03實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌的革蘭氏染色課件

實驗三、細(xì)菌的革蘭氏染色和顯微鏡油鏡的使用一、實驗?zāi)康牧私獠⒄莆沼顽R的原理和使用方法；掌握細(xì)菌革蘭氏染色的原理和方法，學(xué)會在油鏡下觀察細(xì)胞和識別細(xì)菌的形態(tài)特征。實驗三、細(xì)菌的革蘭氏染色和顯微鏡油鏡的使用一、實驗?zāi)康?二、實驗材料1、菌種：大腸桿菌、葡萄球菌2、儀器：顯微鏡3、染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、Lugol碘液、95％乙醇、0.5%沙黃染色液4、材料：載玻片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙二、實驗材料2三、實驗原理（一）普通光學(xué)顯微鏡（p.21-23）1.光學(xué)部分:接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,造成物象。2.機(jī)械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。三、實驗原理（一）普通光學(xué)顯微鏡（p.21-23）3圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理倒立的虛像圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理倒立的虛像41.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：D=0.61λ/n·Sinα/2式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)5（二）油鏡使用的原理

油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。根據(jù)公式D=0.61λ/n·Sinα/2

，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。（二）油鏡使用的原理油鏡，即61.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。（三）顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。（三）顯微鏡保養(yǎng)71、實驗原理（p.29）革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。（四）、革蘭氏染色原理及操作1、實驗原理（p.29）（四）、革蘭氏染色原理及操作8經(jīng)典法，四步法（p.29-31）經(jīng)典法，四步法（p.29-31）92、實驗操作p.30，采用三區(qū)涂片法2、實驗操作p.30，采用三區(qū)涂片法10大腸桿菌葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌11（1）涂片：：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚03實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌的革蘭氏染色課件12（2）固定：染色前必須固定細(xì)菌，其目的是：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上。二是增加其對染料的親和力。常用加熱固定法。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。

注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。（2）固定：注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改13（3）染色（先閱讀p.31的注意事項）革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)摔去細(xì)胞上的殘水，以免染色液被稀釋。03實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌的革蘭氏染色課件14（4）鏡檢(p.24，用低倍、高倍、油鏡分別觀察細(xì)菌)以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。（5）顯微鏡用畢后的處理（p.25）油鏡使用完畢后一定要用二甲苯擦拭鏡頭，但二甲苯量不可過多！

（4）鏡檢(p.24，用低倍、高倍、油鏡分別觀察細(xì)菌)（5）15本實驗每人做一張。實驗報告中要畫圖表示結(jié)果（低倍、高倍、油鏡）。3、實驗報告本實驗每人做一張。3、實驗報告16實驗思考題（回答在實驗報告上）1.涂片為何要固定？固定加熱時間過長會怎樣2.使用油鏡時，為什么必須用香柏油？3.鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？4、革蘭氏染色中哪一步是關(guān)鍵，為什么？你如何控制這一步？實驗思考題（回答在實驗報告上）1.涂片為何要固定？固定加熱時17實驗三、細(xì)菌的革蘭氏染色和顯微鏡油鏡的使用一、實驗?zāi)康牧私獠⒄莆沼顽R的原理和使用方法；掌握細(xì)菌革蘭氏染色的原理和方法，學(xué)會在油鏡下觀察細(xì)胞和識別細(xì)菌的形態(tài)特征。實驗三、細(xì)菌的革蘭氏染色和顯微鏡油鏡的使用一、實驗?zāi)康?8二、實驗材料1、菌種：大腸桿菌、葡萄球菌2、儀器：顯微鏡3、染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、Lugol碘液、95％乙醇、0.5%沙黃染色液4、材料：載玻片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙二、實驗材料19三、實驗原理（一）普通光學(xué)顯微鏡（p.21-23）1.光學(xué)部分:接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,造成物象。2.機(jī)械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。三、實驗原理（一）普通光學(xué)顯微鏡（p.21-23）20圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理倒立的虛像圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理倒立的虛像211.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)2.顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：D=0.61λ/n·Sinα/2式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。：可見光的波長（平均0.55m)n:物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。：鏡口角（即入射角）。顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰1.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)22（二）油鏡使用的原理

油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。根據(jù)公式D=0.61λ/n·Sinα/2

，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。（二）油鏡使用的原理油鏡，即231.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。（三）顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。（三）顯微鏡保養(yǎng)241、實驗原理（p.29）革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。（四）、革蘭氏染色原理及操作1、實驗原理（p.29）（四）、革蘭氏染色原理及操作25經(jīng)典法，四步法（p.29-31）經(jīng)典法，四步法（p.29-31）262、實驗操作p.30，采用三區(qū)涂片法2、實驗操作p.30，采用三區(qū)涂片法27大腸桿菌葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌28（1）涂片：：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚03實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌的革蘭氏染色課件29（2）固定：染色前必須固定細(xì)菌，其目的是：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上。二是增加其對染料的親和力。常用加熱固定法。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。

注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。（2）固定：注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改30（3）染色（先閱讀p.31的注意事項）革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)摔去細(xì)胞上的殘水，以免染色液被稀釋。03實驗三顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌的革蘭氏染色課件31（4）鏡檢(p.24，用低倍、高倍、油鏡分別觀察細(xì)菌)以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。（5）顯微鏡用畢后的處理（p.25）油鏡使用完畢后一定要用二甲苯擦拭鏡頭，但二甲苯量不可過多！

（4）鏡檢(p.24，用低