宏基因組功能基因篩選

宏基因組功能基因的篩選WCX2011年3月17日宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!目錄宏基因組簡(jiǎn)介宏基因組的常用研究方法

16S(18S)rDNA測(cè)序

宏基因組文庫(kù)

—功能基因篩選（策略一）宏基因組的測(cè)序

—功能基因篩選（策略二）宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!宏基因組（Metagenome）Metagenome作為一個(gè)新名詞最初由美國(guó)科學(xué)家Handelsman及其研究組于1998年提出，定義為“theGenomesoftheTotalMicrobiotaFoundinNature”，即指任何特定環(huán)境樣品中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和,并且目前主要是指環(huán)境樣品中細(xì)菌和真菌基因組的總和。

宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!MetagenomeVSGenome宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!MetagenomicsinvolvesconstructingDNAlibrariesfromenvironmentalDNAConstruct16S(18S)

rRNAgenelibraryusingPCRsequenceEnvironmentalsampleCloneintovectoregplasmid,cosmidphosmid,BACIntroduceintohostegE.coliExtractmetagenomicDNAMetagenomiclibraryScreenforspecificsequencesbyPCRorhybridisationFunctionalscreeningforexpressionofparticularphenotypeSIGEX宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!Ashelford等（2005）通過(guò)對(duì)4383個(gè)細(xì)菌16SrDNA的序列進(jìn)行比對(duì)分析，表明16SrDNA全長(zhǎng)序列中包含9個(gè)可變區(qū)（V1-V9）和10個(gè)保守區(qū)。其中保守區(qū)反映生物物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)則表明物種間的差異。Chakravorty等（2007）總結(jié)16SrDNA的序列，及其中九個(gè)9個(gè)可變區(qū)和10個(gè)保守區(qū)的位置和長(zhǎng)度，并指出不同的可變區(qū)適合不同菌群的鑒定分析。其中V3（約60bp）和V6區(qū)（約70bp）可以分別用來(lái)鑒定大多數(shù)細(xì)菌。細(xì)菌16SrRNA的V3或V6區(qū)的測(cè)序分析宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!真菌ITS的高通量測(cè)序分析ITS(InternalTranscribedSpacers)，即核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是位于28SrDNA的3’端與18SrDNA的5’端之間的序列ITS常用于真菌的分類研究，其長(zhǎng)度一般為650-750bpITS包含ITS1和ITS2兩個(gè)區(qū)域。其中ITS1位于18SrDNA和5.8SrDNA之間，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之間宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!宏基因組文庫(kù)MetagenomicLibrary通過(guò)PCR或者雜交篩選特定序列通過(guò)功能篩選特定表型的陽(yáng)性克隆環(huán)境樣品抽提DNA克隆(多種載體)轉(zhuǎn)化適宜宿主細(xì)菌(如大腸桿菌)宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的分析宏基因組文庫(kù)SIGEX宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!環(huán)境樣品DNA制備原位裂解法：將土壤樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理,繼而抽提純化。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小,但由于強(qiáng)烈的機(jī)械剪切作用,所提取的DNA片段較小(1-50kb)，且腐殖酸類物質(zhì)也難以完全去除。異位裂解法：采用物理方法將微生物細(xì)胞從土壤中分離出來(lái),然后采用較溫和的方法抽提DNA,如先采用尼可登介質(zhì)密度梯度離心分離微生物細(xì)胞,然后包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖中裂解,脈沖場(chǎng)凝膠電泳回收DNA。可獲得大片段DNA(20～500kb)且純度高,但操作繁瑣,成本高,有些微生物在分離過(guò)程中可能丟失,溫和條件下一些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA難以抽提出來(lái)。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!宿主已報(bào)道的宏基因文庫(kù)構(gòu)建絕大多數(shù)采用cosmid、BAC或fosmid為載體，其功能篩選宿主局限于大腸桿菌，但大腸桿菌并不是一個(gè)很理想的高效表達(dá)外源基因的宿主細(xì)菌,因而構(gòu)建廣宿主或穿梭宏基因組文庫(kù)在充分挖掘和篩選功能新基因的研究中尤為重要。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!功能驅(qū)動(dòng)篩選

生物活性水平的篩選，即根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行功能篩選。采用各種活性檢測(cè)手段檢測(cè)篩選分離陽(yáng)性克隆子，結(jié)合生化分析和插入片段序列分析，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行深入研究。如可在各種選擇性平板上通過(guò)可見性狀篩選產(chǎn)生脂酶、淀粉酶等活性克隆子。本策略能夠直接發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)和功能編碼基因，能夠快速鑒別有開發(fā)潛力的克隆子，但工作量大，效率低，并且受檢測(cè)手段有效性和靈敏性等限制。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!SIGEX載體特點(diǎn)一種操作子捕獲(operontrap)載體多拷貝，穩(wěn)定性好含有一個(gè)標(biāo)記基因（如gfp），能夠與受底物誘導(dǎo)的操作子

基因片段共表達(dá)標(biāo)記基因前有自身可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，能夠檢測(cè)自連的載體；標(biāo)記基因前有RBS位點(diǎn)和起始密碼子，避免形成融合蛋白Uchiyamaetal.,Nature,2009宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!優(yōu)點(diǎn)能夠篩選到新的代謝相關(guān)基因誘導(dǎo)底物不需要經(jīng)過(guò)特殊修飾避免了引入酶切位點(diǎn)的麻煩和切斷目的基因的可能

結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，適于高通量克隆和篩選缺點(diǎn)不能篩選組成型表達(dá)的基因僅針對(duì)能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的底物僅適用于插入片段帶有自身啟動(dòng)子的情況出發(fā)菌株須與宿主菌株近緣T載體容量有限，>10kb的基因或操縱子難以克隆與GFP反向插入的目的基因?qū)⒙z目的基因與GFP之間有轉(zhuǎn)錄終止子的情況將漏檢YunandRyu，MicrobialCellFactories，2005SIGEX的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!目錄宏基因組簡(jiǎn)介宏基因組的常用研究方法

16S(18S)rDNA測(cè)序

宏基因組文庫(kù)

—功能基因篩選（策略一）宏基因組的測(cè)序

—功能基因篩選（策略二）宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!高通量克隆ORF——TheGateway?systemGateway技術(shù)原理Gateway克隆技術(shù)是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的λ嗜菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)的重組整合與切出反應(yīng)（attBxattP→attLxattR）BP和LR兩個(gè)反應(yīng)構(gòu)成的。BP反應(yīng)利用一個(gè)attBDNA片段或表達(dá)克隆和一個(gè)attP供體載體之間的重組反應(yīng)，創(chuàng)建一個(gè)入門克隆。LR反應(yīng)是一個(gè)attL入門克隆和一個(gè)attR目的載體之間的重組反應(yīng)。LR反應(yīng)用來(lái)在在平行的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移目的序列到一個(gè)或更多個(gè)目的載體。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!不需要傳統(tǒng)的酶切、連接方法利用位點(diǎn)特異性重組，省時(shí)省力,可以實(shí)現(xiàn)高通量克隆利用了ccdB選擇方法，以確保高效率的分離重組克隆,

典型的效率是>95%在目的基因（或者開放閱讀框(ORF)克隆進(jìn)Gateway?

入門載體后，可以很容易將它轉(zhuǎn)移到任何目的載體，

創(chuàng)建各種各種各樣的表達(dá)克隆

Gateway技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!得到生物體的ORFeome后，通過(guò)高通量誘導(dǎo)ORF

表達(dá)，利用“功能驅(qū)動(dòng)篩選”，篩選得到相應(yīng)的功能基因ORFeome的用途高通量檢測(cè)、篩選功能基因、新型酶宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!目錄宏基因組簡(jiǎn)介宏基因組的常用研究方法

16S(18S)rDNA測(cè)序

宏基因組文庫(kù)

—功能基因篩選（策略一）宏基因組的測(cè)序

—功能基因篩選（策略二）宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!16SrDNA指的是細(xì)菌基因組中編碼核糖體16SrRNA分子的對(duì)應(yīng)的DNA序列，也就是16SrRNA的編碼基因。其長(zhǎng)度大約為1500bp通過(guò)16SrDNA的測(cè)序，可以分析環(huán)境的群落構(gòu)成，以及進(jìn)行細(xì)菌的分類和進(jìn)化分析。細(xì)菌16SrRNA的測(cè)序分析宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!16SrDNA通過(guò)設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增得到V3或V6區(qū)的序列，然后兩端加上接頭，便可利用Illumilla的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)V3或V6區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，以獲得環(huán)境樣品中細(xì)菌等物種分類、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、群落比較等諸多信息。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域,其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致,種間差異比較明顯。ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異,此外ITS序列片段較小、易于分析,目前已被廣泛應(yīng)用于這種特點(diǎn)使ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。通過(guò)設(shè)計(jì)特異的PCR引物，擴(kuò)增得到ITS序列，然后兩端加上接頭，便可利用Illumilla的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)ITS進(jìn)行測(cè)序分析，以獲得環(huán)境樣品中真菌等的物種分類、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、群落比較等諸多信息。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!基于宏基因組分離篩選功能基因

的四個(gè)技術(shù)要素載體Vector宿主Host自然產(chǎn)品篩選平臺(tái)NaturalProductDiscoveryPlatform環(huán)境樣品DNA制備DNAPreparation高通量篩選HighThroughputScreening宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!載體一般選用質(zhì)粒、粘?；蛘逨osmid載體來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，其插入片斷小于40kb,對(duì)生物合成比較復(fù)雜的化合物，因其基因簇較大，則無(wú)法完整克隆。細(xì)菌人工染色體（BAC）載體能克隆100kb以上的大插入片斷，完全有可能克隆到完整的代謝基因簇途徑，但是其拷貝數(shù)目和表達(dá)量低。因而可選擇和改進(jìn)已有的穿梭BAC載體來(lái)構(gòu)建文庫(kù)，達(dá)到其拷貝數(shù)量可以誘導(dǎo)控制的目的，在必要時(shí)可誘導(dǎo)增加載體拷貝數(shù)以獲得大量DNA進(jìn)行亞克隆和序列分析。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!序列驅(qū)動(dòng)篩選

基于DNA序列水平的篩選。根據(jù)某些已知的相關(guān)功能基因的保守序列或相似序列設(shè)計(jì)雜交探針或PCR引物，通過(guò)雜交或PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆子。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可能篩選獲得某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子，且能利用基因芯片技術(shù)大大提高篩選效率，缺點(diǎn)是必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的預(yù)先了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)及其功能編碼基因。宏基因組功能基因篩選共31頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!SIGEX（Substrate-inducedgene-expressionscreening），即底物誘導(dǎo)基因篩選，其基本原理為：代謝相關(guān)基因通常由相應(yīng)的化合物（如底物或者代謝）誘導(dǎo)表達(dá)。因此，通過(guò)建立特定的宏基因組文庫(kù)，利用流式細(xì)胞儀，篩選受一定底物誘導(dǎo)、與載體中的特定標(biāo)簽（如GFP）共表達(dá)的克隆子，就能夠篩選到相應(yīng)的代謝基因。

利用