國(guó)產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室新型冠狀病毒核酸快速檢測(cè)試劑上市后多中心臨床評(píng)價(jià)

國(guó)產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室新型冠狀病毒核酸快速檢測(cè)試劑上市后多中心臨床評(píng)價(jià)目前全球新型冠狀病毒肺炎疫情仍未有效控制，我國(guó)“外防輸入、內(nèi)防反彈”的任務(wù)依然艱巨。核酸檢測(cè)技術(shù)是新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染確診的金標(biāo)準(zhǔn)及主要的篩查手段，在2019-nCoV的實(shí)驗(yàn)室診斷及疫情研判方面發(fā)揮了重要作用［1］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前應(yīng)用最廣泛的核酸檢測(cè)方法，主要過(guò)程包括臨床樣本核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)步驟，通常需要4~6h，對(duì)環(huán)境條件及人員能力要求較高，靈活性及機(jī)動(dòng)性不足。核酸快速檢測(cè)試劑盒作為2019-nCoV核酸常規(guī)檢測(cè)方法的有力補(bǔ)充，操作簡(jiǎn)便，不需復(fù)雜培訓(xùn)，結(jié)果易于判讀，有利于醫(yī)院發(fā)熱門診及急診科提高篩查速度，快速分流患者［2］。我國(guó)在2020年5月已批準(zhǔn)上市了5種2019-nCoV核酸快速檢測(cè)試劑盒，本研究在3家機(jī)構(gòu)開展了一項(xiàng)上市后多中心臨床試驗(yàn)，通過(guò)受試者的咽拭子樣本評(píng)價(jià)上述試劑盒的臨床檢測(cè)性能。材料與方法一、材料選取2022年11月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所確診2019-nCoV感染者及非感染者的咽拭子樣本各24份，根據(jù)循環(huán)閾值（cyclethreshold，Ct）的大小分為強(qiáng)陽(yáng)性樣本（Ct值≤28）、中陽(yáng)性樣本（28<Ct值≤33）和弱陽(yáng)性樣本（Ct值>33）。評(píng)價(jià)產(chǎn)品為我國(guó)批準(zhǔn)上市的5種2019-nCoV核酸快速檢測(cè)試劑盒（隱去名稱，使用ABCDE標(biāo)注）。機(jī)構(gòu)1的強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣本和陰性樣本分別為7、7、6、4份；機(jī)構(gòu)2的強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣本和陰性樣本分別為6、4、8、6份；機(jī)構(gòu)3的強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣本和陰性分別為5、6、8、5份。機(jī)構(gòu)3的5份樣本因剩余核酸量不足，無(wú)法完成試劑盒A、B、D、E復(fù)檢，部分結(jié)果未納入一致性分析。樣本采用不含有胍鹽的友康非滅活病毒采樣管（VTM&UTM）（MT0301）保存。本研究經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-208）。二、方法1.操作步驟及檢測(cè)時(shí)間對(duì)比：3家機(jī)構(gòu)按試劑盒說(shuō)明書推薦的配套儀器及試劑盒對(duì)上述臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，記錄樣本處理時(shí)間、擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間，并由操作人員對(duì)操作步驟的復(fù)雜性及操作難易程度進(jìn)行主觀評(píng)價(jià)。各試劑盒之間的樣本處理時(shí)間、擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間和總時(shí)長(zhǎng)通過(guò)方差分析進(jìn)行比較。試驗(yàn)之前對(duì)操作人員進(jìn)行過(guò)相關(guān)操作培訓(xùn)，且每家機(jī)構(gòu)均為同一人員操作，各機(jī)構(gòu)所用的儀器之間在試驗(yàn)之前均進(jìn)行校準(zhǔn)，排除人員和儀器的干擾。樣本檢測(cè)結(jié)果按照各試劑盒說(shuō)明書的規(guī)則進(jìn)行判斷復(fù)檢。5種快檢試劑盒的基本信息見(jiàn)表1。2.2019-nCoV核酸快速檢測(cè)試劑盒的一致性評(píng)價(jià)：3家機(jī)構(gòu)分別選取2019-nCoV感染患者及未感染者的共24份咽拭子樣本建立樣本盤，采用5種核酸快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)。樣本盤中臨床樣本定性結(jié)果確定方法如下：陽(yáng)性樣本來(lái)自確診2019-nCoV感染者且本次評(píng)價(jià)中有1種試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本；陰性樣本來(lái)自非感染者的咽拭子樣本。不同試劑盒檢測(cè)結(jié)果均與樣本盤定性結(jié)果比較，分析不同試劑盒的陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合率。結(jié)果一、5種試劑盒對(duì)臨床樣本檢測(cè)的陽(yáng)性符合率、陰性符合率及總符合率與樣本盤結(jié)果比較，試劑盒C陽(yáng)性符合率最高，為98.25%，其次為試劑盒E、D和A，陽(yáng)性符合率均超過(guò)90%，分別為98.18%、94.44%和92.59%，而試劑盒B的陽(yáng)性符合率低于90%，為83.64%。5種試劑盒陰性符合率從高到低依次為D（100%），A、B和E（均為93.33%），C（86.67%）。5種試劑盒總符合率從高到低依次為E、C、D、A和B（表2）。二、5種試劑盒對(duì)不同強(qiáng)度臨床樣本的檢出情況5種試劑盒對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性和中等強(qiáng)度陽(yáng)性樣本的檢出率均達(dá)到100%，但對(duì)于Ct值33以上的弱陽(yáng)性標(biāo)本，不同試劑盒的檢出能力存在明顯差異，試劑盒C和E的檢出能力最強(qiáng)，均達(dá)到95%，其余3種試劑盒的檢出能力均低于90%，分別為84.21%（D）、78.95%（A）和57.14%（B），5種試劑盒對(duì)弱陽(yáng)性樣本的總體檢出率為82.18%（表3）。三、5種快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)時(shí)間比較按照說(shuō)明書在3家機(jī)構(gòu)評(píng)估5種核酸快速檢測(cè)試劑盒的樣本平均處理時(shí)間和平均擴(kuò)增時(shí)間。試劑盒A、C和E的樣本平均處理時(shí)間較短，分別為（3.00±3.46）、（2.33±0.58）和（2.33±1.15）min，試劑盒D的樣本處理時(shí)間最長(zhǎng)，為（16.33±2.31）min。平均擴(kuò)增時(shí)間最短的試劑盒為試劑盒A，由短至長(zhǎng)依次為D、B、E和C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）（表4）。5種試劑盒從樣本處理到擴(kuò)增完成的平均總時(shí)長(zhǎng)在32.33~65.33min。四、5種試劑盒的復(fù)檢情況分析3家機(jī)構(gòu)按照試劑盒說(shuō)明書的規(guī)則判斷是否需要復(fù)檢，對(duì)5種試劑盒的復(fù)檢情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，試劑盒A和B的復(fù)檢率高于10%，分別為15.28%（11/72）和12.50%（9/72），試劑盒C復(fù)檢率最低，為6.94%（5/72），試劑盒D和E的復(fù)檢率分別為9.72%（7/72）和8.33%（6/72）。討論本研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)批準(zhǔn)的5種2019-nCoV核酸快速檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性符合率總體較好，說(shuō)明快檢試劑可發(fā)揮快速、靈活的優(yōu)勢(shì)，為發(fā)熱門診、急診等患者提供有效檢測(cè)手段。5種核酸快速檢測(cè)試劑盒對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性及中等強(qiáng)度陽(yáng)性樣本的符合率100%，但對(duì)弱陽(yáng)性樣本，篩查效果差異較大。國(guó)外研究報(bào)道同類產(chǎn)品的陽(yáng)性符合率均不高，美國(guó)MesaBiotech公司的Accula的陽(yáng)性符合率僅為68.0%［3］；美國(guó)雅培公司的IDNow的陽(yáng)性符合率為78.8%［4］，提示我國(guó)2019-nCoV快速檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性符合率總體上優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品。本研究結(jié)果顯示不同試劑盒的陽(yáng)性符合率與PCR上樣量無(wú)相關(guān)性，不同試劑盒陽(yáng)性符合率差異較大的原因可能與試劑盒的檢測(cè)技術(shù)原理不同，引物、探針設(shè)計(jì)和擴(kuò)增體系存在差異有關(guān)，造成對(duì)弱陽(yáng)性樣本的檢出能力不同［5,

6］。需要說(shuō)明的是，本研究中采用的凍存臨床樣本，包括一定數(shù)量的弱陽(yáng)性樣本，樣本凍融過(guò)程中也會(huì)引起一定的降解，因此弱陽(yáng)性樣本的數(shù)量可能多于臨床實(shí)際情況。本研究結(jié)果提示，在應(yīng)用2019-nCoV核酸快速檢測(cè)試劑盒前，應(yīng)對(duì)整個(gè)快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，確保其檢測(cè)限達(dá)到≤500拷貝/ml的水平［7］，并應(yīng)注意采用弱陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控，監(jiān)測(cè)是否存在假陰性問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)部分試劑盒的陰性符合率未達(dá)到100%，有4種試劑盒在2個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果。由于本研究采用的樣本是剩余樣本，分析在使用快檢試劑盒進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增過(guò)程中可能存在陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物污染，包括在樣本提取中實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、對(duì)照品及質(zhì)控品的交叉污染［8］。因此，在使用核酸快檢試劑盒時(shí)，應(yīng)注意臨床實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境清潔和消毒，避免樣品間交叉污染，并妥善保存和處理對(duì)照品及質(zhì)控品，避免假陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)。另外，5種快檢試劑盒之間的檢測(cè)原理存在差異，引物設(shè)計(jì)引起的非特異性擴(kuò)增也有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性［9］，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。在檢測(cè)時(shí)間方面，5種核酸快檢試劑盒明顯快于常規(guī)核酸檢測(cè)試劑，大約30~60min即可完成從樣本提取、核酸擴(kuò)增和結(jié)果判讀全過(guò)程。上述快檢試劑盒的檢測(cè)時(shí)間與國(guó)外多數(shù)核酸快速檢測(cè)產(chǎn)品耗時(shí)相當(dāng)，但長(zhǎng)于國(guó)外少數(shù)快檢產(chǎn)品，如雅培的IDNow檢測(cè)系統(tǒng)（5~13min）。相較于傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，更短的檢測(cè)時(shí)間對(duì)于發(fā)熱門診和急診患者的快速篩查、發(fā)現(xiàn)并控制疫情非常重要。本研究還發(fā)現(xiàn)5種快檢試劑盒均有不同程度的復(fù)檢率，主要原因包括單靶標(biāo)陽(yáng)性和質(zhì)控異常，這對(duì)于臨床結(jié)果的確認(rèn)和檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間影響較大，可能是由于試劑盒采用的不同靶標(biāo)基因的擴(kuò)增效率不同，相互競(jìng)爭(zhēng)所致［10］。另外這5種試劑盒都是雙靶標(biāo)檢測(cè)試劑，每個(gè)靶標(biāo)基因的擴(kuò)增效率不同，多個(gè)靶標(biāo)之間相互競(jìng)爭(zhēng)，可能會(huì)引起單靶標(biāo)陽(yáng)性結(jié)果［8，10］，可通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系來(lái)降低復(fù)檢率。建議臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有至少另外一種2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑，用于復(fù)查單靶標(biāo)陽(yáng)性標(biāo)本，確保檢測(cè)結(jié)果的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。此外，由于本研