細(xì)胞工程第六章課件

第六章轉(zhuǎn)基因生物第六章轉(zhuǎn)基因生物1本章內(nèi)容轉(zhuǎn)基因的方法和原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因生物和生物安全性本章內(nèi)容轉(zhuǎn)基因的方法和原理2轉(zhuǎn)基因的方法和原理目的基因制備和載體系統(tǒng)幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法和原理目的基因制備和載體系統(tǒng)3簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造。簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是4基本步驟1.分離獲得目的基因；2.在體外進(jìn)行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上；3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克隆；5.將此克隆?；静襟E1.分離獲得目的基因；5目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來(lái)源：基因組DNA分離、化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增、cDNA文庫(kù)及DNA文庫(kù)中制得。載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來(lái)源：基因組DNA分離、化學(xué)合6PCR反應(yīng)PCR技術(shù)就是在體外通過酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。PCR要求反應(yīng)體系具有以下條件：1、要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)；2、具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；3、4種dNTP；4、作為模板的目的DNA序列。PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100～5000bp的目的基因。PCR反應(yīng)PCR技術(shù)就是在體外通過酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目7PCR反應(yīng)過程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA；2、退火，將反應(yīng)體系的溫度降低至55℃左右，使得一對(duì)引物分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)；3、延伸，將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列。PCR反應(yīng)過程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，8利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以用結(jié)合長(zhǎng)度大約為15bp的短鏈多聚DT的纖維素填充的柱子，根據(jù)堿基配對(duì)原則，將其吸附，從真核細(xì)胞的總RNA中提取出來(lái)，再用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫。在mRNA群體中，有高豐度的mRNA，拷貝數(shù)多；也有低豐度的mRNA，但種類多，高豐度的mRNA容易合成cDNA。要保證構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中要含有目的克隆，可利用瓊脂糖凝膠電泳、非變性蔗糖梯度離心和羥甲基蔗糖剃度離心等分級(jí)分離不同長(zhǎng)度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分級(jí)分離。利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)9cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶I，緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作為引物，合成cDNA。這些cDNA是由該種生物的各種mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到的，因此是混合物，它們可以通過末端連接或是加入銜接物等其它方法克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，形成cDNA文庫(kù)。然后，采用DNA雜交或免疫分析的方法來(lái)篩選目的基因cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA10質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在，其大小不定，小的不到1kb，大的超過500kb。每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能達(dá)10～100個(gè)拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中只有1－4個(gè)拷貝。質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進(jìn)行遺傳改造，使之成為一個(gè)具有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、多個(gè)選擇性標(biāo)記、并一般小于15kb且以高拷貝數(shù)存在的克隆載體。其最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右。質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分11質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個(gè)抗生素抗性基因2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。3.PstI識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基因。帶有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進(jìn)行復(fù)制功能。質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素12pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lacZ’基因表達(dá)的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。pUC19的篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍(lán)色，如果插入有目的DNA片段，無(wú)法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時(shí)白色的。pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)13λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個(gè)5’末端都是由12個(gè)bp組成的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)。在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因（J-N）與重組和生長(zhǎng)過程有關(guān)，但與裂解生長(zhǎng)過程無(wú)關(guān)，因此對(duì)裂解生長(zhǎng)過程來(lái)說(shuō)，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個(gè)區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞裂解等。λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的14λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長(zhǎng)度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒。λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。15柯氏質(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)?？率腺|(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位（RE2），兩個(gè)cos位點(diǎn)，DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE1）?？率腺|(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA16幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借助于物理、化學(xué)或生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并檢查其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的一種技術(shù)，是細(xì)胞工程中一項(xiàng)重要而應(yīng)用廣泛的技術(shù)。細(xì)胞直接攝取外源DNA的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），如果通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借17基因轉(zhuǎn)移的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≤10－63.染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移<10－6

4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～30％8.激光，超聲波介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％基因轉(zhuǎn)移的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)18DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞株中去的最常用方法，主要用于將基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞。由于核酸以磷酸鈣－DNA共沉淀物的形式存在，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收會(huì)大大提高，細(xì)胞通過內(nèi)吞作用，使DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移整合到細(xì)胞核內(nèi)的染色體內(nèi)。一般是將DNA與CaCl2

溶液混合后，同時(shí)加入HEPES緩沖的鹽溶液（HeBS）混合，靜置后形成DNA－磷酸鈣沉淀物，然后用來(lái)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。這個(gè)過程中，pH值、Ca2＋濃度等都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染的效率有所影響。方法簡(jiǎn)單，效率較高，可達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞的20％，但缺點(diǎn)是受體細(xì)胞有限。DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到19脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包裝DNA的球狀磷脂雙分層膜結(jié)構(gòu)，能與細(xì)胞膜融合將DNA送入細(xì)胞的。用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染各種不同的類型的真核細(xì)胞的方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率和可重復(fù)性。脂質(zhì)體制備的基本方法是以一定比例稱取磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，放于氯仿中之后加入待轉(zhuǎn)移的DNA分子制成懸液，經(jīng)超聲化處理后，即形成包含DNA分子的脂質(zhì)體，然后與培養(yǎng)細(xì)胞作用2小時(shí)左右，就可望實(shí)現(xiàn)DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率受脂質(zhì)體的組成及理化性質(zhì)的影響。脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和體外的瞬時(shí)穩(wěn)定表達(dá)。脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包20顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去的方法，在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中較常使用?，F(xiàn)在，多利用顯微鏡操作器在相差顯微鏡下進(jìn)行操作。每個(gè)細(xì)胞的注射量約為10－11ml，熟練的操作者每10分鐘可注射200個(gè)細(xì)胞。顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微21顯微操作儀顯微操作儀22顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作把微吸管的先端在顯微鏡的視野中作平面移動(dòng)。上下的運(yùn)動(dòng)靠設(shè)在顯微操縱儀支柱上的上下微動(dòng)，粗動(dòng)調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。它與顯微鏡牢固地連接起來(lái)。右側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡本體上，左側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡的機(jī)械臺(tái)上，隨機(jī)械臺(tái)的移動(dòng)而移動(dòng)，一般在進(jìn)行操作時(shí)，先將平皿放置在顯微注射儀上，移動(dòng)載物臺(tái)，把視野移到細(xì)胞處，先用緩慢移

動(dòng)顯微操縱儀上固定細(xì)胞的微吸管，同時(shí)使注射器緩慢減壓，吸引目標(biāo)受精卵并固定之，再用另一側(cè)顯微操縱儀移動(dòng)微注射針，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核刺入，導(dǎo)入目的基因，完成顯微注射。顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作23顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％，特別是在沒有合適的DNA載體系統(tǒng)時(shí)更有價(jià)值；2）對(duì)各種受體細(xì)胞均適用，從體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞到受精卵；3）對(duì)轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可以是DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、代謝物或代謝底物以至細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞核；4）可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度；5）可選擇受體細(xì)胞的核的接受位點(diǎn)，可研究物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)，區(qū)隔化和依賴區(qū)隔的修飾；6）受體不用特殊的選擇系統(tǒng)；7）要求的樣品量少，2ml樣品足夠作顯微注射；8）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞可以化同樣的條件下比較。但也有缺點(diǎn)，如設(shè)備和技術(shù)的要求較高，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，對(duì)細(xì)胞有損傷。顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％，特別是在沒有合適的DN24基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的?；驑尳閷?dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sa25基因槍轉(zhuǎn)化的原理基因槍轉(zhuǎn)化的原理26決定基因槍使用成功的因素第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。根據(jù)動(dòng)力系統(tǒng)，基因槍分為三大類：一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動(dòng)力；第三類是以高壓氣體作為動(dòng)力。第二因素是微彈的制備過程。用的微載體有兩類：一是鎢粉，另一個(gè)是金粉，直徑一般為－4μm。常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。第三個(gè)因素是受體材料的選擇。決定基因槍使用成功的因素第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。27定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)基因打靶（genetargeting）又稱同源重組技術(shù)，也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)組成部分。利用轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后，通過外源基因序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源基因序列間的重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組上的某一確定位點(diǎn)，而對(duì)某一預(yù)先確定的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突破的一項(xiàng)技術(shù)。定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)基因打靶（genetargeting）又28基因敲除的載體O型載體，又稱序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對(duì)，經(jīng)過一次交換，前者插入后者，它發(fā)生單交換而將載體序列插入靶基因內(nèi)，致使染色體DNA部分重復(fù)，可能破壞內(nèi)在正常基因而發(fā)生突變，也可代替原來(lái)缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。Ω型載體，也稱序列取代載體，外來(lái)載體DNA和靶細(xì)胞染色體DNA同源配對(duì)，經(jīng)過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發(fā)生雙交換，以外源序列取代靶序列，其基因組大小并無(wú)改變?；蚯贸妮d體O型載體，又稱序列插入型載體，這類載體與靶基29靶細(xì)胞基因敲除的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞；既可是植物細(xì)胞，也可是動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于單細(xì)胞生物和體細(xì)胞具有全能性的植物來(lái)所，對(duì)靶細(xì)胞選擇要求不高，對(duì)任一細(xì)胞打靶成功都可獲得純系個(gè)體。但對(duì)于動(dòng)物，普通細(xì)胞敲除卻無(wú)法得到純系個(gè)體，小鼠生殖系嵌合體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展卻提供了理想的胚胎干細(xì)胞靶細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞體積大，胞漿少；體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落形生長(zhǎng)，在集落邊緣有時(shí)可見有少量的已分化細(xì)胞，形態(tài)為扁平上皮細(xì)胞樣或梭形成纖維細(xì)胞樣。靶細(xì)胞基因敲除的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞；既30轉(zhuǎn)入方法構(gòu)建的基因敲除載體，經(jīng)線性化后通常采用電穿孔的方法將DNA引入胚胎干細(xì)胞。一般電壓為220～800V，電容從～500μF不等，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)開始用含200μgG418（或/和其他物質(zhì)）的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，經(jīng)過8～12天未整合外源DNA的胚胎干細(xì)胞都已死亡，而整合了外源DNA的胚胎干細(xì)胞則長(zhǎng)出了顯微鏡下可見到的克隆。該方法的突出優(yōu)點(diǎn)在于其可靠性和重復(fù)性。轉(zhuǎn)入方法構(gòu)建的基因敲除載體，經(jīng)線性化后通常采用電穿孔的方法將31正負(fù)選擇法正負(fù)選擇法32轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法33轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了AV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。Palmiter等人于1982年將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)轟動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)界。轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)34反轉(zhuǎn)錄病毒法利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（≤10kb）缺陷：可能導(dǎo)致產(chǎn)生輔助病毒株反轉(zhuǎn)錄病毒法利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（≤10kb）35DNA顯微注射一種注入的外源基因序列DNA顯微注射一種注入的外源基因序列36利用胚胎干細(xì)胞利用胚胎干細(xì)胞37篩選和鑒定可以利用正負(fù)選擇法或PCR檢測(cè)外源DNA是否整合到染色體的正確位點(diǎn)。PCR檢測(cè)篩選和鑒定可以利用正負(fù)選擇法或PCR檢測(cè)外源DNA是否整合到38轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值1）用于各種人類遺傳疾病的模型以轉(zhuǎn)基因鼠居多，例如在老鼠中轉(zhuǎn)入突變的人β珠蛋白基因，會(huì)產(chǎn)生β－地中海型貧血癥。2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型還可以用于人類病毒病的研究。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可將病毒的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。人們利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)培育了引入HIV的tat蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值1）用于各種人類遺傳疾病的模型393）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為乳腺生物反應(yīng)器：將所需要的目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需的藥用蛋白。

3）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為乳腺生物反應(yīng)器：將所需要的目的基因構(gòu)建入載40生產(chǎn)藥用蛋白1.抗凝血酶Ⅲ：轉(zhuǎn)基因羊中得到，產(chǎn)量為7g/l2.β乳球蛋白：轉(zhuǎn)基因小鼠，－2mg/ml3.紅細(xì)胞生成素（EPO）:轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁4.α1抗胰蛋白酶（AAT）:轉(zhuǎn)基因羊60mg/ml5.因子Ⅸ:轉(zhuǎn)基因羊的乳汁125ug/ml的重組蛋白6.因子Ⅷ：轉(zhuǎn)基因豬1－7.單克隆抗體:轉(zhuǎn)基因小鼠中得到8.C蛋白：轉(zhuǎn)基因豬每小時(shí)分泌380ug/ml9.生長(zhǎng)激素：轉(zhuǎn)大鼠GH基因豬最高，血清中740ng/ml生產(chǎn)藥用蛋白1.抗凝血酶Ⅲ：轉(zhuǎn)基因羊中得到，產(chǎn)量為7g/l414）膀胱生物反應(yīng)器：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不會(huì)對(duì)生物造成傷害，宜用UP－Ⅱ作為啟動(dòng)子，但由于含量低，成本和乳腺反應(yīng)器差不多。5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液表達(dá)系統(tǒng)：例如：Swanson等人制備了血液中含有人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因豬。6)轉(zhuǎn)基因改良移植器官：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之能適應(yīng)人體器官或組織的移植。例如導(dǎo)入補(bǔ)體控制因子基因的轉(zhuǎn)基因豬獲得成功，為培育異體移植的供體豬開辟了道路。4）膀胱生物反應(yīng)器：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不會(huì)對(duì)生物造成傷害427）轉(zhuǎn)基因生物獲得更多經(jīng)濟(jì)利益轉(zhuǎn)基因牛：改變牛奶成分及提高產(chǎn)奶量轉(zhuǎn)基因羊：改良羊毛生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因魚：生長(zhǎng)速度提高，以及導(dǎo)入抗凍蛋白基因、珠蛋白基因的魚轉(zhuǎn)基因雞：改良現(xiàn)有品種的遺傳特性，增強(qiáng)雞對(duì)于感染的抵抗能力，降低對(duì)疾病的易感性，還可以將母雞產(chǎn)生的外源蛋白收集到蛋內(nèi)，以供醫(yī)療和保健之用。7）轉(zhuǎn)基因生物獲得更多經(jīng)濟(jì)利益轉(zhuǎn)基因牛：改變牛奶成分及提高產(chǎn)43轉(zhuǎn)基因植物制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法轉(zhuǎn)基因植物與高技術(shù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因植物制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法44制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法

土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生冠癭瘤，這是由于Ti質(zhì)粒上有一段T－DNA，能轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)入植物基因組中，導(dǎo)致冠癭瘤形成。T－DNA的長(zhǎng)度約在12－24kb之間。Vir區(qū)的產(chǎn)物對(duì)于T－DNA的轉(zhuǎn)移是必須的制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法

土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞45農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制46Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體必須具備以下的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1）具有選擇標(biāo)記基因2）DNA復(fù)制起始位點(diǎn)3）T－DNA右邊緣序列4）單克隆位點(diǎn)5）vir區(qū)域，利用雙元載體系統(tǒng)和共整合載體系統(tǒng)解決。Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體必須具備47實(shí)現(xiàn)vir區(qū)的方法雙元載體共整合載體和農(nóng)桿菌質(zhì)粒重組過程實(shí)現(xiàn)vir區(qū)的方法雙元載體共整合載體和農(nóng)桿菌質(zhì)粒重組過程48土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法49轉(zhuǎn)基因植物與高技術(shù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在綠色革命中起了重要的作用！抗除草劑基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，農(nóng)作物游離抗除草劑的作用，而可以選擇性除掉雜草！有抗昆蟲基因的農(nóng)作物可以避免農(nóng)藥的使用有抗病毒的農(nóng)作物可以防止病毒的侵襲！利用轉(zhuǎn)基因可以改善農(nóng)作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值！轉(zhuǎn)固氮基因農(nóng)作物可以利用分子氮！轉(zhuǎn)基因植物與高技術(shù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在綠色革命中起了重要的作用！50轉(zhuǎn)基因生物和生物安全性1）基因重組打破了物種間的界限，打亂了自然進(jìn)化歷程，改變了生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，這對(duì)于人類是福是禍？2）轉(zhuǎn)基因生物具有新性狀，其適合度和競(jìng)爭(zhēng)力增加，是否會(huì)導(dǎo)致本來(lái)就弱的瀕危生物更快地從地球上消失？3）轉(zhuǎn)基因生物的數(shù)目增加，是否會(huì)對(duì)生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)形成威脅？轉(zhuǎn)基因生物和生物安全性1）基因重組打破了物種間的界限，打亂了514）新性狀的轉(zhuǎn)基因生物如果大量回歸自然界，有可能會(huì)影響到生態(tài)系統(tǒng)中能量的流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，這又會(huì)有什么影響？5）重組微生物降解的產(chǎn)物是否對(duì)人類有害，這是否會(huì)給人類帶來(lái)負(fù)面效應(yīng)？6）轉(zhuǎn)基因食品是否有損于人類健康？4）新性狀的轉(zhuǎn)基因生物如果大量回歸自然界，有可能會(huì)影響到生態(tài)52你是如何看待轉(zhuǎn)基因生物？？？總之，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，大大促進(jìn)了人類的生產(chǎn)力，推動(dòng)社會(huì)進(jìn)一步向前發(fā)展！但與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因也帶來(lái)了一系列的社會(huì)問題，為了保證人類社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展和人類的安全，人們開始立法限制轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生!到底轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生，是打開了人類的百寶箱，還是打開了潘多拉之盒？你是如何看待轉(zhuǎn)基因生物？？？總之，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，大大53參考書目《動(dòng)物細(xì)胞工程原理與實(shí)踐》馮伯森等科學(xué)出版社《哺乳動(dòng)物胚胎學(xué)》秦鵬春等科學(xué)出版社《轉(zhuǎn)基因技術(shù)理論與應(yīng)用》孫晗笑等河南醫(yī)科大學(xué)出版社《重組DNA的原理和方法》李德葆等浙江科學(xué)技術(shù)出版社《生命的衛(wèi)生——免疫系統(tǒng)》朱錫華編科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社《植物基因與分子操作》顧紅雅等北京大學(xué)出版社參考書目《動(dòng)物細(xì)胞工程原理與實(shí)踐》馮伯森等54謝謝大家謝謝大家55第六章轉(zhuǎn)基因生物第六章轉(zhuǎn)基因生物56本章內(nèi)容轉(zhuǎn)基因的方法和原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因生物和生物安全性本章內(nèi)容轉(zhuǎn)基因的方法和原理57轉(zhuǎn)基因的方法和原理目的基因制備和載體系統(tǒng)幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法和原理目的基因制備和載體系統(tǒng)58簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造。簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是59基本步驟1.分離獲得目的基因；2.在體外進(jìn)行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上；3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克?。?.將此克隆。基本步驟1.分離獲得目的基因；60目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來(lái)源：基因組DNA分離、化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增、cDNA文庫(kù)及DNA文庫(kù)中制得。載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來(lái)源：基因組DNA分離、化學(xué)合61PCR反應(yīng)PCR技術(shù)就是在體外通過酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。PCR要求反應(yīng)體系具有以下條件：1、要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)；2、具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；3、4種dNTP；4、作為模板的目的DNA序列。PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100～5000bp的目的基因。PCR反應(yīng)PCR技術(shù)就是在體外通過酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目62PCR反應(yīng)過程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA；2、退火，將反應(yīng)體系的溫度降低至55℃左右，使得一對(duì)引物分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)；3、延伸，將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列。PCR反應(yīng)過程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，63利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以用結(jié)合長(zhǎng)度大約為15bp的短鏈多聚DT的纖維素填充的柱子，根據(jù)堿基配對(duì)原則，將其吸附，從真核細(xì)胞的總RNA中提取出來(lái)，再用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫。在mRNA群體中，有高豐度的mRNA，拷貝數(shù)多；也有低豐度的mRNA，但種類多，高豐度的mRNA容易合成cDNA。要保證構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中要含有目的克隆，可利用瓊脂糖凝膠電泳、非變性蔗糖梯度離心和羥甲基蔗糖剃度離心等分級(jí)分離不同長(zhǎng)度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分級(jí)分離。利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)64cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶I，緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作為引物，合成cDNA。這些cDNA是由該種生物的各種mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到的，因此是混合物，它們可以通過末端連接或是加入銜接物等其它方法克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，形成cDNA文庫(kù)。然后，采用DNA雜交或免疫分析的方法來(lái)篩選目的基因cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA65質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在，其大小不定，小的不到1kb，大的超過500kb。每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能達(dá)10～100個(gè)拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中只有1－4個(gè)拷貝。質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進(jìn)行遺傳改造，使之成為一個(gè)具有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、多個(gè)選擇性標(biāo)記、并一般小于15kb且以高拷貝數(shù)存在的克隆載體。其最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右。質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分66質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個(gè)抗生素抗性基因2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。3.PstI識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基因。帶有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進(jìn)行復(fù)制功能。質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素67pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lacZ’基因表達(dá)的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。pUC19的篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍(lán)色，如果插入有目的DNA片段，無(wú)法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時(shí)白色的。pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)68λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個(gè)5’末端都是由12個(gè)bp組成的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)。在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因（J-N）與重組和生長(zhǎng)過程有關(guān)，但與裂解生長(zhǎng)過程無(wú)關(guān)，因此對(duì)裂解生長(zhǎng)過程來(lái)說(shuō)，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個(gè)區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞裂解等。λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的69λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長(zhǎng)度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒。λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。70柯氏質(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)。柯氏質(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位（RE2），兩個(gè)cos位點(diǎn)，DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE1）?？率腺|(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA71幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借助于物理、化學(xué)或生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并檢查其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的一種技術(shù)，是細(xì)胞工程中一項(xiàng)重要而應(yīng)用廣泛的技術(shù)。細(xì)胞直接攝取外源DNA的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），如果通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借72基因轉(zhuǎn)移的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≤10－63.染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移<10－6

4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～30％8.激光，超聲波介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％基因轉(zhuǎn)移的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)73DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞株中去的最常用方法，主要用于將基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞。由于核酸以磷酸鈣－DNA共沉淀物的形式存在，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收會(huì)大大提高，細(xì)胞通過內(nèi)吞作用，使DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移整合到細(xì)胞核內(nèi)的染色體內(nèi)。一般是將DNA與CaCl2

溶液混合后，同時(shí)加入HEPES緩沖的鹽溶液（HeBS）混合，靜置后形成DNA－磷酸鈣沉淀物，然后用來(lái)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。這個(gè)過程中，pH值、Ca2＋濃度等都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染的效率有所影響。方法簡(jiǎn)單，效率較高，可達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞的20％，但缺點(diǎn)是受體細(xì)胞有限。DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到74脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包裝DNA的球狀磷脂雙分層膜結(jié)構(gòu)，能與細(xì)胞膜融合將DNA送入細(xì)胞的。用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染各種不同的類型的真核細(xì)胞的方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率和可重復(fù)性。脂質(zhì)體制備的基本方法是以一定比例稱取磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，放于氯仿中之后加入待轉(zhuǎn)移的DNA分子制成懸液，經(jīng)超聲化處理后，即形成包含DNA分子的脂質(zhì)體，然后與培養(yǎng)細(xì)胞作用2小時(shí)左右，就可望實(shí)現(xiàn)DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率受脂質(zhì)體的組成及理化性質(zhì)的影響。脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和體外的瞬時(shí)穩(wěn)定表達(dá)。脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包75顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去的方法，在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中較常使用?，F(xiàn)在，多利用顯微鏡操作器在相差顯微鏡下進(jìn)行操作。每個(gè)細(xì)胞的注射量約為10－11ml，熟練的操作者每10分鐘可注射200個(gè)細(xì)胞。顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微76顯微操作儀顯微操作儀77顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作把微吸管的先端在顯微鏡的視野中作平面移動(dòng)。上下的運(yùn)動(dòng)靠設(shè)在顯微操縱儀支柱上的上下微動(dòng)，粗動(dòng)調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。它與顯微鏡牢固地連接起來(lái)。右側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡本體上，左側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡的機(jī)械臺(tái)上，隨機(jī)械臺(tái)的移動(dòng)而移動(dòng)，一般在進(jìn)行操作時(shí)，先將平皿放置在顯微注射儀上，移動(dòng)載物臺(tái)，把視野移到細(xì)胞處，先用緩慢移

動(dòng)顯微操縱儀上固定細(xì)胞的微吸管，同時(shí)使注射器緩慢減壓，吸引目標(biāo)受精卵并固定之，再用另一側(cè)顯微操縱儀移動(dòng)微注射針，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核刺入，導(dǎo)入目的基因，完成顯微注射。顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作78顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％，特別是在沒有合適的DNA載體系統(tǒng)時(shí)更有價(jià)值；2）對(duì)各種受體細(xì)胞均適用，從體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞到受精卵；3）對(duì)轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可以是DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、代謝物或代謝底物以至細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞核；4）可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度；5）可選擇受體細(xì)胞的核的接受位點(diǎn)，可研究物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)，區(qū)隔化和依賴區(qū)隔的修飾；6）受體不用特殊的選擇系統(tǒng)；7）要求的樣品量少，2ml樣品足夠作顯微注射；8）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞可以化同樣的條件下比較。但也有缺點(diǎn)，如設(shè)備和技術(shù)的要求較高，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，對(duì)細(xì)胞有損傷。顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％，特別是在沒有合適的DN79基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的?；驑尳閷?dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sa80基因槍轉(zhuǎn)化的原理基因槍轉(zhuǎn)化的原理81決定基因槍使用成功的因素第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。根據(jù)動(dòng)力系統(tǒng)，基因槍分為三大類：一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動(dòng)力；第三類是以高壓氣體作為動(dòng)力。第二因素是微彈的制備過程。用的微載體有兩類：一是鎢粉，另一個(gè)是金粉，直徑一般為－4μm。常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。第三個(gè)因素是受體材料的選擇。決定基因槍使用成功的因素第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。82定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)基因打靶（genetargeting）又稱同源重組技術(shù)，也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)組成部分。利用轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后，通過外源基因序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源基因序列間的重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組上的某一確定位點(diǎn)，而對(duì)某一預(yù)先確定的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突破的一項(xiàng)技術(shù)。定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)基因打靶（genetargeting）又83基因敲除的載體O型載體，又稱序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對(duì)，經(jīng)過一次交換，前者插入后者，它發(fā)生單交換而將載體序列插入靶基因內(nèi)，致使染色體DNA部分重復(fù)，可能破壞內(nèi)在正常基因而發(fā)生突變，也可代替原來(lái)缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。Ω型載體，也稱序列取代載體，外來(lái)載體DNA和靶細(xì)胞染色體DNA同源配對(duì)，經(jīng)過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發(fā)生雙交換，以外源序列取代靶序列，其基因組大小并無(wú)改變?；蚯贸妮d體O型載體，又稱序列插入型載體，這類載體與靶基84靶細(xì)胞基因敲除的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞；既可是植物細(xì)胞，也可是動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于單細(xì)胞生物和體細(xì)胞具有全能性的植物來(lái)所，對(duì)靶細(xì)胞選擇要求不高，對(duì)任一細(xì)胞打靶成功都可獲得純系個(gè)體。但對(duì)于動(dòng)物，普通細(xì)胞敲除卻無(wú)法得到純系個(gè)體，小鼠生殖系嵌合體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展卻提供了理想的胚胎干細(xì)胞靶細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞體積大，胞漿少；體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落形生長(zhǎng)，在集落邊緣有時(shí)可見有少量的已分化細(xì)胞，形態(tài)為扁平上皮細(xì)胞樣或梭形成纖維細(xì)胞樣。靶細(xì)胞基因敲除的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞；既85轉(zhuǎn)入方法構(gòu)建的基因敲除載體，經(jīng)線性化后通常采用電穿孔的方法將DNA引入胚胎干細(xì)胞。一般電壓為220～800V，電容從～500μF不等，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)開始用含200μgG418（或/和其他物質(zhì)）的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，經(jīng)過8～12天未整合外源DNA的胚胎干細(xì)胞都已死亡，而整合了外源DNA的胚胎干細(xì)胞則長(zhǎng)出了顯微鏡下可見到的克隆。該方法的突出優(yōu)點(diǎn)在于其可靠性和重復(fù)性。轉(zhuǎn)入方法構(gòu)建的基因敲除載體，經(jīng)線性化后通常采用電穿孔的方法將86正負(fù)選擇法正負(fù)選擇法87轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法88轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了AV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。Palmiter等人于1982年將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)轟動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)界。轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)89反轉(zhuǎn)錄病毒法利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（≤10kb）缺陷：可能導(dǎo)致產(chǎn)生輔助病毒株反轉(zhuǎn)錄病毒法利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（≤10kb）90DNA顯微注射一種注入的外源基因序列DNA顯微注射一種注入的外源基因序列91利用胚胎干細(xì)胞利用胚胎干細(xì)胞92篩選和鑒定可以利用正負(fù)選擇法或PCR檢測(cè)外源DNA是否整合到染色體的正確位點(diǎn)。PCR檢測(cè)篩選和鑒定可以利用正負(fù)選擇法或PCR檢測(cè)外源DNA是否整合到93轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值1）用于各種人類遺傳疾病的模型以轉(zhuǎn)基因鼠居多，例如在老鼠中轉(zhuǎn)入突變的人β珠蛋白基因，會(huì)產(chǎn)生β－地中海型貧血癥。2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型還可以用于人類病毒病的研究。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可將病毒的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。人們利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)培育了引入HIV的tat蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值1）用于各種人類遺傳疾病的模型943）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為乳腺生物反應(yīng)器：將所需要的目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需的藥用蛋白。

3）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為乳腺生物反應(yīng)器：將所需要的目的基因構(gòu)建入載95生產(chǎn)藥用蛋白1.抗凝血酶Ⅲ：轉(zhuǎn)基因羊中得到，產(chǎn)量為7g/l2.β乳球蛋白：轉(zhuǎn)基因小鼠，－2mg/ml3.紅細(xì)胞生成素（EPO）:轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁4.α1抗胰蛋白酶（AAT）:轉(zhuǎn)基因羊60mg/ml5.因子Ⅸ:轉(zhuǎn)基因羊的乳汁125ug/ml的重組蛋白6.因子Ⅷ：轉(zhuǎn)基因豬1－7.單克隆抗體:轉(zhuǎn)基因小鼠中得到8.C蛋白：轉(zhuǎn)基因豬每小時(shí)分泌380ug/ml9.生長(zhǎng)激素：轉(zhuǎn)大鼠GH基因豬最高，血清中740ng/ml生產(chǎn)藥用蛋白1.抗凝血酶Ⅲ：轉(zhuǎn)基因羊中得到，產(chǎn)量為7g/l964）