光譜檢測(cè)技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用課件_第1頁
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第2章光譜檢測(cè)技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用紫外透照燈1.光譜范圍和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)儀器

400nm

650nmUltraVioletVisibleNearInfrared白光透照燈、普通酶標(biāo)儀、熒光化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀、測(cè)序儀、掃描儀顯微鏡測(cè)序儀、掃描儀凝膠圖像分析系統(tǒng)、核酸蛋白檢測(cè)儀、光密度掃描儀、激光掃描儀、熒光顯微鏡分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、掃描酶標(biāo)儀紫外線紫外線是德國物理學(xué)家里特在1801年發(fā)現(xiàn)的,一切高溫物體,如太陽、弧光燈發(fā)出的光都含有紫外線。紫外線的作用主要是化學(xué)作用。紫外線有很強(qiáng)的熒光效應(yīng),能使很多物質(zhì)發(fā)出熒光??梢姽?/p>

A

光主要部件日光燈管和磨砂玻璃波長可見光用于檢測(cè)凝膠和膜上的染料硝酸銀、考馬斯亮藍(lán)等及放射自顯影膠片白光透照儀主要部件光學(xué)系統(tǒng)(光源、濾光片、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:340-700nm用于各種微孔板檢測(cè)普通酶標(biāo)儀Elx-800酶標(biāo)儀工作原理光電倍增管計(jì)算機(jī)打印機(jī)酶標(biāo)板濾光片光源Elx-808酶標(biāo)儀工作原理濾光片輪鹵素?zé)糁饕考鈱W(xué)系統(tǒng)(光源、濾光片、光電倍增管)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)微量比色杯波長:230、260、280、320、562、595nm用于各種生物樣品檢測(cè)核酸蛋白檢測(cè)儀主要部件光學(xué)系統(tǒng)(光源、單色器、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:200-999nm,1nm步進(jìn)用于各種微孔板檢測(cè)全波長掃描酶標(biāo)儀PowerWaveHTSynergy全波長掃描酶標(biāo)儀工作原理熒光技術(shù)簡(jiǎn)介一、熒光發(fā)生過程

熒光產(chǎn)生于某些分子(通常是含多聚芳香烴的碳水化合物或雜環(huán)化合物)稱為熒光體或熒光染料。熒光探針是一個(gè)熒光體設(shè)計(jì)用于定位生物樣品的特異性區(qū)域或?qū)μ禺愋源碳ひ蜃影l(fā)生反應(yīng)。熒光發(fā)生是一個(gè)3階段的過程。①激發(fā)

外源的白熾燈或激光提供的能量(hvEX)的光子被熒光體吸收,產(chǎn)生被激發(fā)的電子單峰態(tài)(S1’)。這個(gè)過程是熒光和化學(xué)發(fā)光的區(qū)別,化學(xué)發(fā)光的激發(fā)態(tài)是由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的。

③熒光發(fā)射

能量(hvEM)光子被激發(fā),熒光體回到基態(tài)S0。由于能量在激發(fā)態(tài)壽命期的部分消耗,這些光子的能量較低,因此比激發(fā)光子hvEX有更長的波長。這種由于(hvEM-hvEX)呈現(xiàn)的能量或波長的差異稱作Stokes漂移。Stokes漂移奠定了熒光技術(shù)靈敏性的基礎(chǔ),因?yàn)樗梢耘c激發(fā)光子在光譜上分離,而在一個(gè)較低的背景下檢測(cè)發(fā)射光子。相比較而言,吸收光分光測(cè)定法在透射光檢測(cè)時(shí)相對(duì)于較高水平的同一波長的光。

EmissionFExcitation熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式:發(fā)光ExcitationBHFTransfer熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式:發(fā)熱二、熒光光譜

熒光發(fā)生的整個(gè)過程是循環(huán)的,除非熒光體在激發(fā)態(tài)不可逆轉(zhuǎn)的破壞(一個(gè)重要的現(xiàn)象稱作光漂白),同一熒光體可以反復(fù)地激發(fā)和檢測(cè)。對(duì)于溶液中多原子分子,由hvEX和hvEM呈現(xiàn)的不連續(xù)的電子躍遷被一個(gè)較寬的能量光譜稱作熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜取代。在兩種或更多的熒光體同時(shí)檢測(cè)時(shí),這些光譜的帶寬是非常重要的參數(shù)。除了很少的例外,一般在稀釋溶液中單種熒光體的熒光激發(fā)光譜和它的吸收光譜是相同的。在同樣條件下,由于在激發(fā)態(tài)壽命期激發(fā)能量的部分消耗,熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長是分離的。熒光發(fā)射強(qiáng)度是與在激發(fā)波長的熒光激發(fā)光譜振幅成比例的。三、熒光檢測(cè)熒光檢測(cè)儀器

熒光檢測(cè)系統(tǒng)的4個(gè)基本要素是:⑴激發(fā)光源,⑵熒光體,⑶將激發(fā)光子與發(fā)射光子分離的特定波長的濾光片,⑷檢測(cè)器記錄發(fā)射光子并輸出,通常是電子信號(hào)或圖像。3種主要的熒光檢測(cè)儀器提供不同的數(shù)據(jù)。熒光分光光度計(jì):測(cè)定液體樣品(uL-mL)

熒光顯微鏡:解析熒光作為二維或三維空間位置定位功能流式細(xì)胞儀:測(cè)定流體中每個(gè)細(xì)胞的熒光,在大量樣品中進(jìn)行分選并識(shí)別和定量激光掃描儀熒光信號(hào)

熒光強(qiáng)度的定量取決于這些參數(shù):吸光度-由Beer-Lambert定律定義為摩爾消光系數(shù)的產(chǎn)物,光徑和稀釋濃度,染料的熒光量子的產(chǎn)量,激發(fā)光源強(qiáng)度和儀器熒光采集效率。在稀釋溶液或懸液中,熒光強(qiáng)度與這些參數(shù)成線性比例關(guān)系。當(dāng)樣品吸光度在1cm光徑超過0.05時(shí),線性關(guān)系被自身吸收和內(nèi)濾光效應(yīng)扭曲。通過一個(gè)大的熒光Stokes漂移(例如分離為A1和E1)可以容易從Rayleigh散射激發(fā)光(EX)分離出熒光發(fā)射信號(hào)(S1)。標(biāo)記有熒光探針的生物分子通常都含有超過1個(gè)的熒光物,使信號(hào)分離更加復(fù)雜。另一個(gè)光信號(hào)(S2)可能是背景熒光或第二個(gè)熒光探針。背景熒光

熒光檢測(cè)的靈敏性會(huì)受到背景信號(hào)的很大影響,這些背景信號(hào)來自樣品內(nèi)在組分(自發(fā)熒光)或未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的探針(試劑背景)。檢測(cè)中可以通過選擇濾光片或通過選擇更長波長吸收和發(fā)射的探針來減小E2自發(fā)熒光對(duì)E1的影響。盡管將熒光檢測(cè)帶寬變窄增加了E1和E2間的分辨力,但是會(huì)影響總的熒光檢測(cè)強(qiáng)度。對(duì)于細(xì)胞、組織和生物體液的自發(fā)熒光,可以采用激發(fā)光>500nm的探針減小熒光信號(hào)失真。但是,較長波長的激發(fā)光會(huì)受到密度介質(zhì)如組織的影響而發(fā)散減弱,就需要更強(qiáng)穿透力的激發(fā)光。直接標(biāo)記-將熒光團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)直接銜接在核酸的雙鏈或單鏈上間接標(biāo)記-將帶有熒光團(tuán)標(biāo)記的NTP或dNTP通過酶反應(yīng)摻入到新合成的核酸鏈中熒光對(duì)核酸的修飾和標(biāo)記PhysicalDataforIRDye700-CDImax=680nmemission=715nm=190,000LMol-1cm-1PhysicalDataforIRDye800-CDImax=780nmemission=815nm=205,000LMol-1cm-1核酸染料IRDye結(jié)構(gòu)HybridizeLabelDNA5minFastConvenientRobustLowcostIRDyeDNADNALabeling切口平移法隨機(jī)引物摻入法逆轉(zhuǎn)錄合成摻入法AminallyldUTP與熒光團(tuán)的結(jié)合間接熒光標(biāo)記UniversalLinkageSystem(ULS)platinum-basedchemistry氨基或硫醇基修飾的核酸可直接連接熒光團(tuán)胞嘧啶的硫化介導(dǎo)的熒光團(tuán)標(biāo)記直接熒光標(biāo)記IRDye800Excitationmax=778nmEmissionmax=806nmE=180,000M-1cm-1Quantumyield=0.34Cy5.5Excitationmax=675nmEmissionmax=694nmE=250,000M-1cm-1Quantumyield=0.28蛋白染料IRDye結(jié)構(gòu)AntigenonMembrane1o1o+2oOR1o+2o1o+2o+3oIRDye800andCy5.5SecondaryandTertiaryLabeledAntibodiesLabeledAntibodies主要部件光學(xué)系統(tǒng)(光源、濾光片、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:激發(fā)波長:300-650nm發(fā)射波長:350-700nm發(fā)光波長:350-700nm用于各種微孔板檢測(cè)熒光、化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀Flx800Synergy主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)(激光光源、濾光片、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:激發(fā)波長:488、514、543、594、633nm發(fā)射波長:500-700nm用于玻璃載片的生物芯片檢測(cè)ScanArray激光共聚焦掃描儀ScanArray激光共聚焦原理ScanArray熒光激發(fā)顯微鏡光路圖紅外線紅外線是英國物理學(xué)家赫謝爾在1800年發(fā)現(xiàn)的。紅外線最主要的作用是熱作用。紅外線的波長較長,因此衍射現(xiàn)象比較顯著,穿透力很強(qiáng)。主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)(激光光源、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:激發(fā)波長:685、785nm發(fā)射波長:715、815nm用于測(cè)序紅外激光自動(dòng)測(cè)序儀紅外激光自動(dòng)測(cè)序儀主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)(激光光源、光電倍增管)機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)(步進(jìn)馬達(dá))自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長:激發(fā)波長:685、785nm發(fā)射波長:715、815nm用于雜交膜檢測(cè)紅外激光掃描儀紅外激光掃描儀原理紅外激光掃描儀熒光激發(fā)IRD700激發(fā)IRD800激發(fā)

熒光顯微鏡光路圖濾光片結(jié)構(gòu)圖熒光顯微鏡濾光片光路圖化學(xué)發(fā)光技術(shù)簡(jiǎn)介按光譜分類:狹義:可見光(400-700nm)廣義:紫外光(10-400nm)可見光(400-700nm)紅外光(700-40000nm)光的基本知識(shí)熾熱光或白熾光(incandescence)-因熱而發(fā)光氣體激發(fā)(gasexcitation>-因電子或熱的激發(fā)而發(fā)光摩擦發(fā)光(triboluminescence)電激發(fā)光(electroluminescence)熒光(fluorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光,但光源切斷后即不再發(fā)光磷光(phosphorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光,但光源切斷后仍會(huì)持續(xù)發(fā)光化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence>-非生物體把多余的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽苌锇l(fā)光(bioluminescence)-生物體利用化學(xué)能發(fā)光發(fā)光物質(zhì)

某些熒光物質(zhì)(例如Luminol,C8H7N3O2)可將化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的能量,轉(zhuǎn)化成使分子內(nèi)的電子由基態(tài)(groundstate)躍升到激發(fā)態(tài)(excitedstate),處于激發(fā)態(tài)的分子并不穩(wěn)定,將能量以光的形式釋放出來;有的光波長為可見光范圍,但占多數(shù)的是熒光(fluorescence)?;瘜W(xué)發(fā)光的原理雜交檢測(cè)中的信號(hào)物質(zhì)(非放射性標(biāo)記):核酸雜交(Southern&NorthernBlot)蛋白印跡(WesternBlot)酶聯(lián)免疫(Elisa)其他:

dot/slot雜交、原位雜交、噬菌體文庫篩選、菌落文庫(質(zhì)粒文庫)篩選…

化學(xué)發(fā)光在生物學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用一般需要一定的發(fā)光底物及發(fā)光增強(qiáng)劑(如CDP-Star,461nm,藍(lán)光),并配有各自的過氧化物酶系統(tǒng)。經(jīng)過化學(xué)發(fā)光及增強(qiáng)作用,將光量放大后,在X片上發(fā)光自顯影,將特異結(jié)合條帶顯示出來?;瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)敏感性高,除借助特殊儀器檢測(cè)外,需要在暗室進(jìn)行X光片曝光,曝光時(shí)間要掌握適度以便得到最佳信號(hào)強(qiáng)度。此外,由于不同發(fā)光底物持續(xù)發(fā)光時(shí)間和強(qiáng)度不同,除了摸索曝光時(shí)間外還要注意在穩(wěn)定持續(xù)發(fā)光時(shí)間內(nèi)可以多次曝光。。

生物學(xué)中化學(xué)發(fā)光檢測(cè)原理Luminol(~430nm)CSPD發(fā)光最強(qiáng)最持久:CDP-Star(~460nm,藍(lán)光)Sapphire-II?發(fā)光增強(qiáng)劑Emerald-II?發(fā)光增強(qiáng)劑注:一般的試劑盒中已將發(fā)光底物與發(fā)光增強(qiáng)劑預(yù)先混合為發(fā)光底物L(fēng)uminol幾種常用的發(fā)光底物及增強(qiáng)劑核酸雜交:生物素標(biāo)探針-酶(AP)標(biāo)生物素抗體或Strepavidin-CDP-Star底物生物素標(biāo)探針-酶(AP)標(biāo)生物素抗體或Strepavidin-CDPD底物生物素標(biāo)探針-酶(HRP)標(biāo)生物素抗體或Strepavidin-EnhancedLuminol底物熒光素標(biāo)探針-酶(AP)標(biāo)抗熒光素抗體-CDP-Star底物熒光素標(biāo)探針-酶(HRP)標(biāo)抗熒光素抗體-EnhancedLuminol底物地高辛標(biāo)探針-酶(AP)標(biāo)抗地高辛抗體-CDPD底物酶(專利的耐熱AP)標(biāo)探針-發(fā)光底物幾種常用的試劑盒檢測(cè)原理核酸抽提電泳轉(zhuǎn)膜生物素標(biāo)記探針(隨機(jī)引物法PCR摻入法)雜交、洗脫酶標(biāo)生物素抗體或結(jié)合物敷育底物敷育化學(xué)發(fā)光檢測(cè):X光片壓片-曝光-顯影-定影實(shí)驗(yàn)流程

舉例NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit特點(diǎn):穩(wěn)定:32P-標(biāo)記的探針只能放置幾天,而生物素標(biāo)記的探針可放置較長時(shí)間敏感:可檢測(cè)哺乳動(dòng)物DNA中的單拷貝基因(<1pg),與同位素相當(dāng)?

快速:整個(gè)檢測(cè)程序只需40分鐘(曝光時(shí)間只需1-10分鐘,需要優(yōu)化)?

發(fā)光可持續(xù)幾天,可多次曝光,以獲取最佳信號(hào)強(qiáng)度NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKitAmbionBioDetectTMNonisotopicDetectionKit舉例NEN公司化學(xué)熒光素/生物素標(biāo)發(fā)光檢測(cè)試劑盒晶美公司RNADetector?NorthernBlottingKit

DNADetector?GenomicSouthernBlottingKitTropix(ABI)Southern-Light?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemSouthern-Star?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemAmershamAlkphosLabellingandDetectionSystemRocheDIGLuminescentDetectionKit其他產(chǎn)品酶(AP)標(biāo)二抗-CDP-Star底物酶(AP)標(biāo)二抗-CDPD底物生物素標(biāo)一抗-酶(HRP)標(biāo)生物素抗體或Strepavidin-ECL試劑ECL:EnhancedChemiluminescence,EnhancedLuminol底物檢測(cè)限:DAB顯色:對(duì)HRP敏感,1ngECL化學(xué)發(fā)光:<pgSuperSignal(PIERCE,ECL)化學(xué)發(fā)光:10-15fg蛋白雜交CSTPhototope?-HRP化學(xué)發(fā)光法Western

優(yōu)點(diǎn)

?

敏感。可檢測(cè)pg級(jí)蛋白質(zhì)。

?

快速。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不超過2小時(shí)。曝光時(shí)間從數(shù)秒到10分鐘。

?

定量。

舉例蛋白雜交ECLWesternBlottingDetectionReagentsECLPlusWesternBlottingDetectionReagents(4to20-foldsensitivity)舉例AmershamECLProteinBiotinylationModule/SystemTropixWestern-Light?SystemWestern-Star?System(3-to4-foldsensitivity)酶(AP)標(biāo)二抗-CDPD/CDP-Star底物舉例其他產(chǎn)品酶(AP)標(biāo)二抗-CDPD/CDP-Star底物酶聯(lián)免疫四種底物及增強(qiáng)劑搭配方式適用于夾心法,競(jìng)爭(zhēng)法免疫分析,DNA探針捕獲分析配有TR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)舉例TropixELISA-LightImmunoassaySystem1.X光片壓片(傳統(tǒng)方法)但曝光時(shí)間需要摸索,壓片法有一定不便,定量也不準(zhǔn)2.掃描儀一定波長范圍掃描3.成像儀CooledCCD4.熒光化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法Typhoon?8600

Typhoon?9200

Typhoon?9210

Typhoon?9400

Typhoon?9410

舉例AmershamImaging&Analysis掃描儀Typhoon9410VariableModeImagerunitesprovenstoragephosphorautoradiographytechnologywithfour-color,non-radioactivefluorescentlabellingtechniques.ForDNA,RNA,andproteinsamples,choosefrom:storagephosphorautoradiographydirectblue-excitedfluorescence(457,488

nm)directgreen-excitedfluorescence(532

nm)directred-excitedfluorescence(633

nm)

chemiluminescenceAmershamImaging&Analysis掃描儀WhatImagingSystemdoIneed?OptionalDarkroomforFluorescenceChemiluminescenceonlyGGnSamples>15x12cmCGChemiluminescence&FluorescenceReducedBudgetHigherperformanceCG2XECG2MGUV/whitelightgelsReducedBudgetImagesonlyDGGeneToolsMCSGeneToolsMCSPGeneTools/GeneDirectoryMCSPDGGAddGelAnalysisFromGeniusSeriesGeneGnomeFromBioImagingProductLineDigiDoc-ItSystem DigitalSnapShotBioDoc-ItSystem NoComputer GDS-8000System StandardPC ChemiSystem Expression BioChemiSystem Sensitivity OptiChemiSystem DynamicRange BioMicroSystem RGBColor BioDensitySystem Scanner 舉例ChemiSystem

GeneandProteinExpressionPicogramLevelSensitivityDetection2-4TimesLongerThanFilmCooled(-35C)CCDCamera8-BitMaximumSignal-to-NoiseRatioChemiImager4400ChemiDocMultiGenius450,000pixelsBioChemiSystemGeneandProteinQuantitationMid-FemtogramLevelSensitivitySameDetectionTimeasFilmCooled(-40C)DigitalCCDCamera12,14and16-BitAcquisitionFluorChem8800VersaDoc3000440CF1.45millionpixelsOptiChemiSystemDetailedProteinQuantitationLow-FemtogramLevelSensitivityOneHalftheDetectionTimeasFilmCooled(-85C)DigitalCCDCamera14and16-BitPerformanceFujiLAS-1000VersaDoc5000LumiImager1.40millionpixelsFUJIFILMLAS-1000CCDphotoelement舉例Tropix公司是化學(xué)發(fā)光技術(shù)專業(yè)廠家,專門從事化學(xué)發(fā)光相關(guān)儀器、應(yīng)用試劑的生產(chǎn)和研發(fā)。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)方面擁有355項(xiàng)專利。TropixTR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(AppliedBiosystems)1.靈敏度:數(shù)字光子計(jì)數(shù)器

可檢測(cè)5×10-21摩爾AP分子,定量線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)采用光導(dǎo)纖維探頭和屏蔽技術(shù),孔間信號(hào)相互干擾小于3×10-5,光電倍增管檢測(cè)器波長范圍:380nm~630nm2.靈活性

96孔或384孔微板,可編程讀板方式具有兩個(gè)RS232接口,可兼容目前市售的全自動(dòng)機(jī)械手臂控溫范圍:室溫以上5℃~42℃專利的特氟隆(Teflon)材質(zhì)進(jìn)樣器,快速均勻混合反應(yīng)液,保證結(jié)果精確性3.應(yīng)用的廣泛性報(bào)告基因分析,探針雜交和免疫分析:TropixTR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀特性(AppliedBiosystems)紫外與熒光光譜在蛋白質(zhì)

研究中的應(yīng)用主要內(nèi)容UV/vis

基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)、應(yīng)用

Fluorescence

基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)、

常規(guī)熒光、淬滅、熒光共振能量傳遞(FRET)譜學(xué)方法10100Kcal/molBondsbreakLightusedforvisionandphotosynthesisElectromagneticspectrumNuclearspinvibrationsElectronictransitionsThelongerthewavelength,thelowertheenergy.基本原理1-LambertLawThefractionoflightabsorbedbyatransparentmediumisindependentoftheincidentintensity,andeachsuccessivelayerofthemediumabsorbsanequalfractionofthelightpassingthroughit.

Log10(I0/I)=kl基本原理2-Beer’sLawTheamountoflightabsorbedisproportionaltothenumberofmoleculesofthechromophorethroughwhichthelightpasses.

k=cDeviationsfromtheBeer-Lambertlaw強(qiáng)吸收

高濃度噪聲與誤差WavelengthAbsorbanceConcentrationABAB波長選擇等吸收點(diǎn)(Isosbesticpoint)等吸收點(diǎn)常作為體系中只有兩種成分(狀態(tài))的指示

可作為參比波長

若有等吸收點(diǎn),則不需要為為每個(gè)譜作基線單光路雙光路雙波長二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列光譜儀動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)吸收光譜實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)樣品準(zhǔn)備波長選擇池子選擇掃描速度選擇帶寬選擇石英、玻璃、塑料慢快若樣品不穩(wěn)定若噪聲大,分辨率低等窄寬若噪聲大合適的濃度,正確的參比紫外/可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用濃度測(cè)定

構(gòu)象變化研究

相互作用研究蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在<250nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶劑吸收也較大溶劑的吸收蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250nm附近有弱吸收確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)

ProtParam:Tyr的吸收譜與pH有關(guān)pHtitrationcanbeusedtodetermine

-

whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm環(huán)境極性的影響B(tài)lueshiftofspectrainpolarsolventWeakerabsorptionofTyrinpolarsolvent蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25oC(bold);-HelixatpH10.8,25oC(dotted);-strandatpH10.8,52oC(dashed).蛋白質(zhì)折疊/變性研究熒光光譜0330TheFranck-Condonprinciple:transitionsareverticalinbothabsorptionandemissionTheFranck-Condonfactoristhesameforabsorptionandfluorescence00011003063060Exceptions:-verylonglivedS1state:emissionoccursfromadifferentgeometry.-Reactionsfromtheexcitedstate.量子產(chǎn)率F=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)

熒光強(qiáng)度IF=I0(1-10-cl)F

若cl很小,則近似:IF=I0(cl)FInnerfiltereffect

Innerfiltereffect所以,實(shí)驗(yàn)中,A,EX<0.1RamanandRayleighScatteringTwopotentialsourcesofbackgroundradiationareRamanandRayleighscattering.Bothofthesephenomenaariseduetovibrationalchangesinducedinmoleculesbyincidentradiation.Bothcanalsobedescribedasscatteredlight.TheRamanlinesareofdifferentfrequencyfromtheincidentlightandusuallyoflongerwavelength.Rayleighradiationisscatteredlightofthesamefrequencyastheincidentlight.RayleighScattering強(qiáng)度與r6/4成正比不能通過減空白來消除

選擇合適的激發(fā)波長從比激發(fā)波長大(10nm)處開始收譜減少帶寬Ramanscattering因水中O-H收縮(3300cm-1):

1/

RA=1/EX–0.00033EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫2waysofmeasuringfluorescenceEmissionspectrum-excitationλconstant,measurefluorescenceintensityofemissionagainstλ,I.e.spectrumofemittedlight.Excitationspectrum–measurefluorescenceintensityatdifferentexcitationλ,similartoabsorptionspectra.ExcitationspectrumExcitationspectrumshouldcorrespondcolselywiththeabsorptionspectrumofthemoleculethatisresponsibleforthefluorescence.Excitationspectrumrevealswhetherthesampleishomogeneous,andwhetherallfluorescencefeaturesresultfromasinglemolecule.ExperimentsSpectralshifts:Intrinsic,

Extrinsic

FluorescenceFluorescencequenching:Internal,ExternalFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)Rotationofmolecules:fluorescenceanisotropyFluorescencelifetime…..ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)TrpisthedominantintrinsicfluorophoreinproteinsTrpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponsetoconformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquelysensitivetocollisionalquenching,eitherbyexternallyaddedquenchers,orbynearbygroupsintheprotein.LocalelectricfieldscausespectralshiftsGasphasemm*solventSolventcanaffectthegroundstateandexcitedstatemoleculescausingspectralshiftExample:Hbondingtotryptophan.Changesitsabsorptionbyabout10nmFluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylargeTyrfluorescence若蛋白質(zhì)只含TYR,不含TRP:

蛋白質(zhì)變性后,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。GFPisisolatedfromthePacificjellyfishAequoreavictoriaandnowplayscentralrolesinbiochemistryandcellbiologyduetoitswidespreaduseasaninvivoreporterofgeneexpression,celllineage,protein-proteininteractionsandproteintrafficking

GFPcanbefusedtoanotherproteineitherN-orC-terminally.ThisisduetothefactthatbothterminiofGFPappearratherflexibleonthesurfaceofthebeta-can,sothatGFP'sstructureisnotsignificantlydistortedordestroyedbythefusedprotein.RibbondiagramoftheGreenFluorescentProtein(GFP)drawnfromthewild-typecrystalstructure.Theburiedchromophore,whichisresponsibleforGFP'sluminescence,isshowninfullatomicdetail.GreenFluorescentProtein(GFP)Differentcolourformsof

GFPAdditionallyseveraldifferentcolourformsof

GFP

havebeenproduced.

blue,

cyan,

green,and

yellow

FPorBFP,CFP,GFPandYFP.Fluorescenceemissionspectraofequalconcentrationsof1,8-ANSinethanol:watermixtures.Thelabelsadjacenttoeachcurveindicatethepercentageofethanolinthesolventmixture.ProteinExtrinsicfluorescenceANS(1-anilinonaphthalene-8-sulfonicacid)1-苯胺基萘-8-磺酸strongfluorescenceenhancementwhenitsexposuretowaterisloweredFluorescenceenhancementof1,8-ANS,uponbindingtoprotein.Theimageshowsaqueoussolutionsof1,8-ANSexcitedbyultravioletlight.Additionofprotein(bovineserumalbumin)tothesolutioninthecuvetteontheleftresultsinintensebluefluorescence.Thefluorescenceofuncomplexedfreedyeinthecuvetteontherightisnegligibleincomparison.1,8-ANSisasensitiveprobeforpartiallyfoldedintermediatesinprotein-foldingpathways.MoltenglobuleintermediatesarecharacterizedbyparticularlyhighANSfluorescenceintensitiesduetotheexposureofhydrophobiccoreregionsthatareinaccessibletothedyeinthenativestructure.ANSbindingofsHSP16.5inGdnHCl

TitrationofANSfluorescenceat475nm

Haemoglobinisacomplexofasmallprostheticgroupwiththeproteinapohaemoglobin.TheextrinsicfluorANSfluoresceswhenaddedtosolutionsofapohaemoglobinbutnotwithhaemoglobin.Theadditionofhaemtotheapohaemoglobin-ANScomplexeliminatesthefluorescencebydisplacingANS.ThistellsusthatANSandthehaemgroupbindtothesamesite.SinceANSisonlyfluorescentinhighlynon-polarenvironments,thehaemmustbindtoahighlynon-polarsite.ThiswouldgivevaluablecluesintheinterpretationofX-raydiffractionpatterns.E.g.youwouldknowthatacertainconfigurationofaminoacidscouldbethepointofinteractionbetweenhaemandproteinwhenbuildingthestructure.ExtrinsicfluorescenceexamplesFluorescenceQuenchingInternalquenchingduetointrinsicstructuralfeaturee.g.structuralrearrangement.Externalquenchinginteractionoftheexcitedmoleculewithanothermoleculeinthesampleorabsorptionofexcitingoremittedlightbyanotherchromophoreinsample.IntramolecularquenchingTyroftenisquenchedbynearbytryptophanesTrpfluorescencecanbequenchedbyneighbouringprotonatedacidgroups.IfthepKmeasuredbymonitoringtrpfluorescenceisthesameasthepKforaknownionisablegroup(e.g.acarboxyl)thenthegroupmustbenearthetrp.ExternalquenchingAcrylamide,I-,Cs+Stern-VolmerequationFluorescencequenchingisafunctionof:TheexcitedstatelifetimeThediffusion-limitedquenchingconstantTheconcentrationofthequencherTheSternVolmerslope:

KSV=skQF0/F

=1+tskQ[Q]Stern-VolmerequationAsafirstproximationthevalueofKSVrevealsthedegreeOfexposuretothesolventofaTrpresidue.,0M,1M,2M,3M,4M,5M,6MStern-VolmerplotatvariousGdnHClconcentrationsAcrylamidequenchingofTrpfluorescence

Stern-Volmerconstants

FluorescenceResonanceEnergyTransferKnownasfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)orF?rsterenergytransfer.Itistheradiationlesstransferofexcitationenergyfromadonortoanacceptor.Animportantconsequenceofthistransferisthatthereisnoemissionoflightbythedonor.Theacceptormayormaynotbefluorescent.FRETisadistance-dependentinteractionwheretheenergytransferoccurstypicallyoveradistanceof1-10nm.ThedistancedependentnatureofFRETishighlightedbythefactthatitisproportionaltotheinversesixthpoweroftheintermolecularseparation.

Ifthefluorophores(extrinsicorintrinsic)haveuniquelocationswithintheproteinorcomplex,itispossibleforemissionlightenergyfromAtobeabsorbedbyBandtobeemittedaspartofB’semissionspectrumA/QFluorAλ2λ1AbsorbanceemissionA/Qλ(nm)FluorBλ2λ3AbsorbanceemissionFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)FRETisdependentonthedistance,R,betweenthetwofluors.Usedtomeasuredistancesinproteins,membranes,¯omolecularassemblies10to80?apart.Efficiencyoftheenergytransfer(E)fromdonortoacceptor(AtoB)definedbyE=R06

R06+R6

R=distancebetweenA&B,R0isaconstantcalculatedfromabsorptionandemissionspectra.Ecanbecalculatedfromfluorescenceintensity(F)

E=Fda/FdFda=Finthepresenceofacceptor,Fd=Fintheabsenceofacceptor.OnceEisknown,Rcanbecalculatedfromthefirstequation

ifR0isknown.FRETisusedasa‘spectroscopicruler’theC-terminalsubdomainofthemoleculeformsanensembleofcompactlooselyfoldedconformationswithnative-likefeatures.FRET應(yīng)用實(shí)例IntramolecularandintermolecularFRET.(a)IntramolecularFRETcanoccurwhenboththedonorandacceptorchromophoresareonthesamehostmolecule,whichundergoesatransition,forexample,between‘open’and‘closed’conformations.IneachsquareboxcorrespondingtoCFPorYFP(shownincyanoryellow,respectively),adiagonallinerepresentsthechromophore.TheamountofFRETtransferredstronglydependsontherelativeorientationanddistancebetweenthedonorandacceptorchromophores:theparallelorientationandtheshorterdistance(<100?)generallyyieldlargerFRET.(b)IntermolecularFRETcanoccurbetweenonemolecule(proteinA)fusedtothedonor(CFP)andanothermolecule(proteinB)fusedtotheacceptor(YFP).Whenthetwoproteinsbindtoeachother,FREToccurs.Whentheydissociate,FRETdiminishes.FRETimagingmicroscopyexperiment.InFRETexperiments,asingletransfection(intramolecularFRET)orco-transfection(intermolecularFRET)oftheconstructsmustfirstbeperformed.TheoccurrenceofFR

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