刺猬蛋白促進(jìn)內(nèi)耳Math1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

刺猬蛋白促進(jìn)內(nèi)耳Math1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究【內(nèi)容摘要】目的研究刺猬蛋白(shh)對(duì)體外小鼠耳蝸多潛能祖代細(xì)胞(cnps)的math1的調(diào)節(jié)作用，討論治療感音神經(jīng)性耳聾的新方法。方法體外分離培養(yǎng)出生后第1天小鼠的cnps細(xì)胞，在dmem/f12+shh培養(yǎng)基培養(yǎng)，用rtpcr、熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)誘導(dǎo)cnps細(xì)胞早期分化的主要轉(zhuǎn)錄因子math1的表達(dá)。結(jié)果shh誘導(dǎo)分化組的math1mrna表達(dá)、math1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平及math1蛋白表達(dá)陽性率均高于未誘導(dǎo)細(xì)胞(p0.05);抑制劑ly294002具有顯著下調(diào)shh對(duì)math1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水安然平靜math1蛋白表達(dá)的作用(p0.05)。結(jié)論出生后第1天小鼠的cnps細(xì)胞能夠在shh的誘導(dǎo)下，促進(jìn)math1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的早期分化。【本文關(guān)鍵詞語】耳蝸基因表達(dá)毛細(xì)胞反式激活因子類聽覺喪失感音神經(jīng)性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)大多數(shù)的感音神經(jīng)性耳聾是由毛細(xì)胞和與之相聯(lián)絡(luò)的螺旋神經(jīng)的損傷和退化所造成。耳蝸?zhàn)婷?xì)胞存在于哺乳動(dòng)物的耳蝸，而且有取代缺失的聽毛細(xì)胞的潛能，但這些細(xì)胞處于靜止?fàn)顩r，并不會(huì)自覺增生或分化為毛細(xì)胞[15]。當(dāng)前尚未發(fā)現(xiàn)哺乳類動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞自覺再生的現(xiàn)象。固然迄今國內(nèi)外已進(jìn)行了很多研究，但尚未發(fā)現(xiàn)促使內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的有效方法。本研究通過體外誘導(dǎo)小鼠耳蝸多潛能祖代細(xì)胞(cochlearneuralprogenitors,cnps)的math1的表達(dá)，討論刺猬蛋白(sonichedgehog，shh)對(duì)耳蝸毛細(xì)胞早期分化的作用，為感音神經(jīng)性耳聾治療提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1cnps細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)出生后第1天的小鼠(c57bj/6，美國明尼蘇達(dá)州大學(xué))，頸椎脫臼法處死，在顯微鏡下精到準(zhǔn)確分離出耳蝸組織，從耳蝸組織內(nèi)分離出耳蝸細(xì)胞，使用dmem/f12+1%n2+egf(10ng/ml)+bfgf(10ng/ml)培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的co2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳代良好，并行細(xì)胞克隆分析，挑選單細(xì)胞克隆。取第45～55代形態(tài)較好的細(xì)胞，用dmem/f12培養(yǎng)基洗滌，實(shí)驗(yàn)組參加dmem/f12+shh培養(yǎng)液，對(duì)照組參加dmem/f12+pbs培養(yǎng)液，正常細(xì)胞形態(tài)也作為一種對(duì)照，置于飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1d，天天換液，倒置顯微鏡(日本zeiss公司)下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。1.2cnps細(xì)胞math1、myosinviia、p27kip1、s100a、ν3tubulin、map2的mrna表達(dá)水平測(cè)定提取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及正常cnps細(xì)胞的mrna，進(jìn)行mrna濃度、純度、完好性檢驗(yàn)，按一定的方法轉(zhuǎn)換為cdna，后進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物由美國integrateddnatechnologies公司合成。內(nèi)參gapdh(441bp)：上游：5’aacgggaagcccatcacc3’下游：5’cagccttggcagcaccag3’math1(452bp)：上游：5’agatctacatcaacgctctgtc3’下游：5’actggcctcatcagagtcactg3’myosinviia(628bp)：上游：5’aagcacctgctcctgctcgtccacg3’下游：5’ctccctctacatcgctctgttcg3’p27kip1(524bp)：上游：5’ctggagcggatggacgccagac3’下游：5’cgtctgctccacagtgccagc3’s100a(500bp)：上游：5’tggaggaggtcggtagggaaag3’下游：5’acaggtggggtgaggagcaa3’β3tubulin(542bp)：上游：5’accccagcggcaactatgta3’下游：5’agatgtcgtagagggcttca3’map2(535bp)：上游：5’gcagcagcatcctctctacc3’下游：5’tctggagagtgagggtgtgcagc3’擴(kuò)增條件：94℃10min→94℃30s→退火溫度30s→72℃30s，30個(gè)循環(huán);72℃5min。math1、myosinviia、p27kip1、s100a、β3tubulin、map2及gapdh的退火溫度分別為58.5、65、66、63、59、62.5及61℃。gapdh系管家基因，是小鼠細(xì)胞內(nèi)普遍穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)量較恒定的基因，因而作為內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)。取pcr產(chǎn)品，參加sybrgreen和藍(lán)色染料混勻后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，同時(shí)2%瓊脂糖凝膠中參加dnaladder電泳，dnaladder起標(biāo)示電泳條帶位置作用，將電泳后的瓊脂糖凝膠在電泳顯像儀分析、攝像。1.3熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)shh對(duì)math1啟動(dòng)子的表達(dá)作用將cnps細(xì)胞放于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24h當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)60%，使用lipofectin(終濃度6μg/ml)同時(shí)轉(zhuǎn)染math1啟動(dòng)子(終濃度1.4μg/ml)和βgalactosidase(終濃度0.7μg/ml)，16h后，含4%胎牛血清的培養(yǎng)液恢復(fù)24h，dmem/f12洗滌后，實(shí)驗(yàn)組參加dmem/f12+shh(1μg/ml)培養(yǎng)液24h，陽性對(duì)照組參加dmem/f12+pbs培養(yǎng)液24h，陰性對(duì)照組參加mem培養(yǎng)液24h，另外的組在添加shh基礎(chǔ)上同時(shí)添加各種抑制劑pd98059、sb203580、ly294002(三者均為20μmol/l，德國calbiochem公司)、cyclopamine(cy)5μmol/l(美國biomol公司)24h，抑制劑在添加shh前1h添加于原先培養(yǎng)液中。按說明書于微孔板熒光發(fā)光計(jì)(美國tristarlb941berthold，tropix公司)讀數(shù)，βgalactosidase為細(xì)胞內(nèi)參照，第一次讀數(shù)luciferase與第二次讀數(shù)βgalactosidase的比值rla(relativeluciferaseactivity,luc/βgal)即是處理因素對(duì)math1啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)效率。1.4免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)shh對(duì)math1蛋白的表達(dá)作用將cnps細(xì)胞放入8孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24h當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)40%，dmem/f12洗滌后，實(shí)驗(yàn)組參加dmem/f12+shh(1μg/ml)培養(yǎng)液，對(duì)照組參加dmem/f12+pbs培養(yǎng)液，另一組參加dmem/f12+shh(1μg/ml)+抑制劑ly294002(20μmol/l)混合液體，天天換液。2d后先用pbs洗滌細(xì)胞2遍，用100%甲醛固定6min后開始染色經(jīng)過。先用pbs沖刷2遍，含0.3%tritonx的pbs室溫孵育10min，含0.3%tritonx的pbs洗滌5min×3次，參加含5%兔血清和0.3%tritonx的pbs，37℃孵育20min，以阻斷非特異性的抗原抗體反應(yīng)。參加的一抗為兔抗鼠math1抗體1∶100(美國abcam公司)，37℃孵育60min，含0.3%tritonx的pbs洗滌5min×3次，參加含fitcgoatantirabbitiggconjugated的二抗1∶200(美國zymed公司)，37℃孵育30min，含0.3%tritonx的pbs洗滌5min×3次，dapi避光染核10min，pbs洗滌5min×3次后封片。同時(shí)以igg作為一抗的陰性對(duì)照。在熒光顯微鏡(e400，日本nikon公司)下觀察結(jié)果。1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)shh對(duì)math1蛋白的表達(dá)作用將cnps細(xì)胞放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24h后當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)60%，dmem/f12洗滌后，實(shí)驗(yàn)組參加dmem/f12+shh(1μg/ml)培養(yǎng)液，對(duì)照組參加dmem/f12+pbs培養(yǎng)液，天天換液。2d后按收獲細(xì)胞的方法獲取細(xì)胞，先用pbs洗滌細(xì)胞2遍后離心，棄上清，含0.3%saponin的pbs冰上孵育10min后離心，棄上清，參加含1%bsa和0.3%saponin的pbs，冰上孵育30min，以阻斷非特異性的抗原抗體反應(yīng)。參加的一抗為兔抗鼠math1抗體1∶100(美國abcam公司)，冰上孵育30min，含0.3%saponin的pbs洗滌后離心，棄上清，參加含fitcgoatantirabbitiggconjugated的二抗1∶100(美國zymed公司)，冰上孵育30min，pbs洗滌后離心，棄上清，反復(fù)pbs洗滌1次，將細(xì)胞溶解于含0.1%bsa的pbs。同時(shí)以igg作為一抗的陰性對(duì)照，流式細(xì)胞儀(美國bdbiosciences公司)檢測(cè)結(jié)果，后使用flowjo軟件分析。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示，使用sigmaplot軟件作圖分析。兩組間采取t檢驗(yàn)，p0.05為差異不同有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)改變和鑒定剛分離時(shí)細(xì)胞小而圓，折光性強(qiáng)，傳代后細(xì)胞小而紡綞樣，貼壁生長，傳代50代后細(xì)胞仍存活。用rtpcr檢測(cè)毛細(xì)胞的標(biāo)記物:math1、myosinviia;支持細(xì)胞標(biāo)記物p27kip1、s100a;神經(jīng)元標(biāo)記物：β3tubulin、map2，結(jié)果顯示此細(xì)胞表達(dá)math1、myosinviia、p27kip1、s100a、β3tubulin，但不表達(dá)map2。取第45～55代的此細(xì)胞，shh處理1d后細(xì)胞體積增大、變圓，呈神經(jīng)元樣或上皮樣改變(圖1)。2.2rtpcr檢測(cè)mrna的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組shh(1μg/ml)處理cnps細(xì)胞1d后math1mrna表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組pbs，也明顯高于未經(jīng)過處理的cnps。實(shí)驗(yàn)組shh與對(duì)照組pbs處理cnps細(xì)胞后，cnps細(xì)胞在p27kip1、s100a、β3tubulinmrna的表達(dá)上未見明顯差別。實(shí)驗(yàn)組shh與對(duì)照組pbs處理cnps細(xì)胞3d后的myosinviiamrna表達(dá)水平高于未經(jīng)過處理的cnps(圖2)。a：正常細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞小而紡綞樣，貼壁生長;b：實(shí)驗(yàn)組，shh1μg/ml，24h后細(xì)胞體積變大、變圓，呈神經(jīng)元或上皮樣改變.2.3熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)shh對(duì)math1啟動(dòng)子的表達(dá)作用實(shí)驗(yàn)組shh(1μg/ml)處理cnps細(xì)胞1d后對(duì)math1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于陰性對(duì)照組mem，實(shí)驗(yàn)組shh與陰性對(duì)照組相比，差異不同有顯著性意義(p0.05)，略高于陽性對(duì)照組pbs。抑制劑ly294002具有顯著下調(diào)shh對(duì)math1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平作用，與shh組相比，差異不同有顯著性意義(p0.05，圖3)。2.4免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)shh對(duì)math1蛋白的表達(dá)作用熒光顯微鏡下，在fitc頻道，細(xì)胞核顯示綠色熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，在dapi頻道下，藍(lán)色熒光所示的是細(xì)胞核，起標(biāo)示細(xì)胞作用。在1個(gè)高倍視野下，選擇4個(gè)角落和1中心，共5個(gè)高倍視野來計(jì)算陽性細(xì)胞，取4個(gè)不反復(fù)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)量和百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)組shh(50.72±17.34)%處理cnps細(xì)胞2d后math1蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組pbs(33.3±9.37)%，與對(duì)照組pbs相比，以為差異不同有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。ly294002(23.5±8.56)%具有明顯下調(diào)shh對(duì)math1蛋白的表達(dá)作用，具有顯著差異不同(p0.05)(圖4a～b)。實(shí)驗(yàn)組：shh1μg/ml;陰性對(duì)照組：mem;陽性對(duì)照組：pbs;pd98059組：shh1μg/ml+pd9805920μmol/l;sb203580組：shh1μg/ml+sb20358020μmol/l;ly294002組：shh1μg/ml+ly29400220μmol/l;cy組：shh1μg/ml+cyclopamine5μmol/l;處理時(shí)間：24h.實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，p0.05;實(shí)驗(yàn)組與ly294002組比較，p0.05.3討論感音神經(jīng)性耳聾是毛細(xì)胞和與之相聯(lián)絡(luò)的螺旋神經(jīng)的損傷或退化所造成。當(dāng)前尚無治療感音神經(jīng)性耳聾的有效方法，助聽器和人工耳蝸雖有助于提升聽力，但不是從生物學(xué)意義上逆轉(zhuǎn)聽力。因而，尋求促使內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的有效途徑還是感音神經(jīng)性耳聾防治研究的重點(diǎn)。以往研究表示清楚，哺乳類動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞在胚胎期已完成分化，出生后不能自覺再生。其內(nèi)耳毛細(xì)胞的數(shù)目從出生至衰老，基本維持在穩(wěn)定水平[6]。因而，毛細(xì)胞的任何損傷和毀壞都可導(dǎo)致永久性聽力損害。但是，近年研究表示清楚，哺乳類動(dòng)物出生早期階段存在cnps細(xì)胞[7]。從cnps細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化來補(bǔ)充毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元，有可能恢復(fù)內(nèi)耳的生物學(xué)構(gòu)造，為感音神經(jīng)性耳聾的治療提供新途徑。近年，lin等從出生后第1天小鼠耳蝸組織中分離出耳蝸細(xì)胞，經(jīng)鑒定，以為這些細(xì)胞是cnps細(xì)a:熒光顯微鏡下觀察cnps細(xì)胞的math1蛋白的表達(dá)作用;b:熒光顯微鏡下觀察cnps細(xì)胞中math1陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù).a：對(duì)照組：pbs;b：實(shí)驗(yàn)組：shh1μg/ml;c：ly294002組：shh1μg/ml+ly29400220μmol/l;處理時(shí)間：48h.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，p0.05;實(shí)驗(yàn)組與ly294002組比較，p0.05.胞，并發(fā)現(xiàn)第45代cnps細(xì)胞與第5代cnps細(xì)胞具有類似的形態(tài)學(xué)改變和生物學(xué)性質(zhì)，即細(xì)胞具有自我更新能力。約有90%左右的單細(xì)胞具有不對(duì)稱分裂為2個(gè)不同子細(xì)胞(毛細(xì)胞和神經(jīng)元方向)的能力，即細(xì)胞具有多向分化的能力，但其本身不具備分化為成熟毛細(xì)胞的能力。lin等用組合生長因子serb(刺猬蛋白(shh)、表皮生長因子(egf)、視黃酸(ra)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)對(duì)cnps細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)cnps具有分化為神經(jīng)元、毛細(xì)胞的能力，且cnps細(xì)胞在成熟毛細(xì)胞纖毛束的標(biāo)記物espin、factin的表達(dá)水平明顯加強(qiáng)[7]。但上述組合因子對(duì)cnps細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間長、經(jīng)過較繁瑣，且各因子對(duì)耳蝸毛細(xì)胞分化的詳細(xì)作用機(jī)制尚不明了。本實(shí)驗(yàn)所使用的耳蝸細(xì)胞培養(yǎng)至50代后對(duì)其實(shí)驗(yàn)組：shh1μg/ml;對(duì)照組：pbs;處理時(shí)間：48h.進(jìn)行標(biāo)記物檢測(cè)。rtpcr顯示math1、myosinviia、p27kip1、s100a、β3tubulin均呈陽性表達(dá)，但不表達(dá)map2。因β3tubulin是不成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物，在成熟神經(jīng)元的表達(dá)量較少，map2是較成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物[7]，說明此細(xì)胞處于分化早期。以上結(jié)果表示清楚本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞與lin所以為的cnps細(xì)胞特征一致。本實(shí)驗(yàn)重要研究單因子對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的分化作用，其中shh在內(nèi)耳的發(fā)生發(fā)育經(jīng)過中起主要作用。研究表示清楚，在神經(jīng)系統(tǒng)，nkx21決定神經(jīng)祖細(xì)胞向某些神經(jīng)元亞型轉(zhuǎn)化的方向，并調(diào)控有絲分裂后期某些神經(jīng)元的遷移或分化[8]。shh在前腦存在表達(dá)，與前腦的發(fā)育有關(guān)，且shh與維持腹側(cè)前腦構(gòu)造的某些基因(例如nkx21)的表達(dá)有直接關(guān)聯(lián)[9]。shh基因敲除的小鼠沒有聽泡的腹側(cè)囊泡，包含缺失蝸水管和耳蝸前庭神經(jīng)節(jié)[1011]，說明shh在內(nèi)耳的發(fā)育構(gòu)成中起關(guān)鍵作用。1998年，atoh1(math1)基因首先在果蠅基因中被發(fā)現(xiàn)，小鼠同系物math1位于小鼠6號(hào)染色體,編碼351個(gè)氨基酸。math1是一種產(chǎn)生毛細(xì)胞所必須的堿性螺旋環(huán)螺旋的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[5，1213]。math1自己可促進(jìn)毛細(xì)胞早期分化[5]。math1的基因轉(zhuǎn)移使出生后哺乳動(dòng)物的耳蝸產(chǎn)生功能性的毛細(xì)胞[14]。本實(shí)驗(yàn)利用出生后第1天小鼠耳蝸組織的cnps細(xì)胞來研究shh通過調(diào)節(jié)cnps細(xì)胞早期分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子math1，誘導(dǎo)cnps細(xì)胞分化的機(jī)制。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的cnps細(xì)胞，在無其他相關(guān)因子和血清存在的情況下，通過rtpcr、熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shh誘導(dǎo)math1表達(dá)的適宜濃度為1μg/ml。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組shh處理cnps細(xì)胞48h，cnps細(xì)胞的math1蛋白表達(dá)(ihc和facs)增長10%～15%，具有顯著性意義，此后回到原始水平，揣測(cè)與以下因素有關(guān)：(1)math1通常出如今有絲分裂后期，終分化前期，時(shí)間短暫。(2)被上調(diào)的math1是短暫出現(xiàn)的，math1的表達(dá)在細(xì)胞遭遇刺激后24～48h存在一個(gè)高峰，此后其表達(dá)將恢復(fù)到原始水平。math1的短時(shí)增長現(xiàn)象，使胚胎后期和出生早期math1的表達(dá)不易檢測(cè)出。本實(shí)驗(yàn)中，采取了dmem/f12培養(yǎng)基，不使用血清，不使用促神經(jīng)細(xì)胞生長的因子n2，不使用促細(xì)胞增生的因子egf+bfgf，故更能客觀地反映shh對(duì)cnps細(xì)胞的直接作用。ly294002系pi3k/akt通路的抑制物，ly294002具有明顯下調(diào)shh對(duì)math1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水安然平靜math1蛋白表達(dá)的作用，故shh促進(jìn)math1的表達(dá)，與pi3k/akt信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表示清楚shh重要通過上調(diào)math1對(duì)耳蝸多潛能祖代細(xì)胞起促分化的作用，但分化后能否改變?yōu)橛泄δ艿拿?xì)胞，還有待于進(jìn)一步討論。(致謝:本文實(shí)驗(yàn)的部分內(nèi)容在美國明尼蘇達(dá)州大學(xué)聽覺分子生物實(shí)驗(yàn)室完成，特此表示深深的感激!)【以下為參考文獻(xiàn)】[1]malgrangeb,belachews,thirym,liferativegenerationofmammalianauditoryhaircellsinculture[j].mechdev,2002,112:7988.[2]ozekim,duanl,obritchw,etal.establishmentandcharacterizationofprogenitorhaircelllinesinrats[j].hearres,2003,179:4352.[3]doetzlhofera,whitepm,johnsonje,etal.invitrogrowthanddifferentiationofmammaliansensoryhaircellprogenitors:arequirementforegfandperioticmesenchyme[j].devbiol,2004,272:432447.[4]linj,fengl,fukudomes,etal.cochlearstemcells/progenitorsanddegenerativehearingdisorders[j].currmedchem,2007,14:29372943.[5]chenp,johnsonje,zoghbihy,etal.theroleofmath1ininnereardevelopment:uncouplingtheestablishmentofthesensoryprimordiumfromhaircellfatedetermination[j].development,2002,129:24952505.[6]morslih,chood,ryana,etal.developmentofthemouseinnerearandoriginofitssensoryorgans[j].neurosci,1998,18:33273335.[7]linj,fengl,hamajimay,etal.directeddifferentiationofmousecochlearneuralprogenitorsinvitro[j].amjphysiolcellphysio