目的基因的克隆與基因文庫的構建精美生物醫(yī)學講課課件

請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？構建基因文庫由什么用呢？構建一個基因文庫都有哪些基本步驟，請概括！請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結合在一起。一．基因文庫概述1、概念2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫cDNA：由mRNA逆轉錄的DNA，因此不含非轉錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉變成雙鏈，應用于基因工程。

2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；cDNA文庫（cDNAlibrary）限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？cDNA：由mRNA逆轉錄的DNA，因此不連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級在熱作用下，_____斷裂，形成___________轉化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序工作量較大，需要了解目的基因的背景知識基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量cDNA文庫（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫（cDNAlibrary）以mRNA為?；蚪M文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有3、構建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。3、構建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目4、基因文庫的構建流程（1）基因組文庫的構建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成mRNA逆轉錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體菌群該生物cDNA文庫4、基因文庫的構建流程（1）基因組文庫的構建提取某生物用適5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體導入不同的受體細胞大量復制和表達找出含有目的基因的細胞限制酶將DNA切成許多片段用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉錄酶3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質的氨基4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為____5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物Ⅱ1.目(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板b、從基因庫中篩選特定的克?。?）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選的DNA片段或基因。當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫與cDNA文庫的比較：重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因找出含有目的基因的細胞基因組文庫GenomicDNAlibrary三、基因文庫的構建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！從基因庫中篩選特定的克隆三、基因文庫的構建（一）切割：基因組載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質粒載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的

上述幾種載體的最大裝載量如下：質粒l-DNA考斯質粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的

用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因文庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的篩選文庫質?；驇旌Y選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質粒篩選文庫質粒基因庫篩選陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵測序電泳圖譜測序電泳圖譜基因測序及分析基因測序及分析30序列測定的技術

雜交測序法質譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:序列測定的技術雜交測序法經(jīng)典方法:新技術方法:31連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級1、直接分離法—“鳥槍法”二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因3、通過DNA合成儀直接合成目的基因從基因庫中篩選特定的克隆基因組文庫包含基因組的所有基因1、直接分離法—“鳥槍法”一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性基因組文庫與cDNA文庫的比較：（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成目的基因受熱變性，解旋；基因組文庫GenomicDNAlibrary反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級與32Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN33*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結構比較*少一個－OH脫氧核甘酸34Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得35ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時，得到較短的產(chǎn)物；“標記／終止法”測序產(chǎn)物的平均長度可通過標記反應中dNTP濃度(高濃度能得到長的產(chǎn)物)或終止反應的ddNTP:dNTP來調(diào)整。

ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈36Sanger第二步：熒光檢測Sanger第二步：熒光檢測37工作量較大，需要了解目的基因的背景知識的DNA片段或基因。根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成cDNA文庫（cDNAlibrary）重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。ddNTPs是反應終止劑連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級可以當作正常堿基參與復制，一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識這些序列分別與適當?shù)妮d體結合在一起。載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結合在一起。工作量較大，需要了解目的基因的背景知識一．基因文庫概述1、5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉錄酶三、基因文庫的構建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！三、基因文庫的構建（一）切割：基因組DNA的分解

上述幾種載體的最大裝載量如下：質粒l-DNA考斯質粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？構建基因文庫由什么用呢？構建一個基因文庫都有哪些基本步驟，請概括！請你找找看……什么是基因文庫，由哪兩部分組成呢？一．基因文庫概述

1、概念基因文庫(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當?shù)妮d體結合在一起。一．基因文庫概述1、概念2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫cDNA：由mRNA逆轉錄的DNA，因此不含非轉錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉變成雙鏈，應用于基因工程。

2、基本組成包括：基因組文庫、cDNA文庫出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；cDNA文庫（cDNAlibrary）限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？cDNA：由mRNA逆轉錄的DNA，因此不連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級在熱作用下，_____斷裂，形成___________轉化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序工作量較大，需要了解目的基因的背景知識基因組文庫GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量cDNA文庫（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉錄酶合成互補DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當載體連接轉化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNA文庫cDNA文庫（cDNAlibrary）以mRNA為?；蚪M文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因cDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列分離特定基因，cDNA庫比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有3、構建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。3、構建目的創(chuàng)建基因文庫的目的：從特定的材料中分離目4、基因文庫的構建流程（1）基因組文庫的構建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成mRNA逆轉錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體菌群該生物cDNA文庫4、基因文庫的構建流程（1）基因組文庫的構建提取某生物用適5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選5、基因文庫的質量標準盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體導入不同的受體細胞大量復制和表達找出含有目的基因的細胞限制酶將DNA切成許多片段用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥槍法”載入運載體鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結構鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因（雙鏈）化學合成2、人工合成基因法：1）逆轉錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉錄酶3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。3、通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質的氨基4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段4、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為____5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物Ⅱ1.目(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結果：使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(2)利用PCR技術擴增②原理：__________DNA復⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑥過程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板b、從基因庫中篩選特定的克?。?）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選的DNA片段或基因。當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。這個群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫與cDNA文庫的比較：重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因找出含有目的基因的細胞基因組文庫GenomicDNAlibrary三、基因文庫的構建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！從基因庫中篩選特定的克隆三、基因文庫的構建（一）切割：基因組載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質粒載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的

上述幾種載體的最大裝載量如下：質粒l-DNA考斯質粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的

用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？根據(jù)待選基因相關信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因文庫從基因庫中篩選特定的克隆一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標記、熒光標記、顏色標記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補的篩選文庫質粒基因庫篩選細菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉移到尼龍膜上裂解細菌變性DNA標記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測挑取對應菌落、培養(yǎng)抽提質粒篩選文庫質?；驇旌Y選陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測序自動測序儀功能分析預測軟件陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵測序電泳圖譜測序電泳圖譜基因測序及分析基因測序及分析73序列測定的技術

雜交測序法質譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:序列測定的技術雜交測序法經(jīng)典方法:新技術方法:74連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級1、直接分離法—“鳥槍法”二、篩選：從基因文庫中篩選目的基因3、通過DNA合成儀直接合成目的基因從基因庫中篩選特定的克隆基因組文庫包含基因組的所有基因1、直接分離法—“鳥槍法”一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性基因組文庫與cDNA文庫的比較：（2）cDNA文庫的構建——mRNA反轉錄形成目的基因受熱變性，解旋；基因組文庫GenomicDNAlibrary反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；與PCR反應類似。反應體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測序引物；反應過程：變性－復性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級與75Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應終止劑可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN76*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結構比較*少一個－OH脫氧核甘酸77Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得78ddNTPs參與下的DNA復制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時，得到較短的產(chǎn)物；“標記／終止法”測序產(chǎn)物的平