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大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件1大腸桿菌口服疫苗的研制
匯報(bào)人:范群平生物制品實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌口服疫苗的研制匯報(bào)人:范群平2Whatisvaccine?
廣義的疫苗是為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生和流行而接種于機(jī)體的預(yù)防性生物制品。生物制品,是指用微生物或其毒素,人或動(dòng)物的血清、細(xì)胞等制備的用來(lái)預(yù)防、診斷和治療用的制劑。預(yù)防用的抗體制劑也可以歸類(lèi)為疫苗Whatisvaccine?廣義的疫苗是預(yù)防用3Whatisoralvaccine?口服疫苗,顧名思義,就是經(jīng)“口”途徑接種的疫苗,進(jìn)一步來(lái)說(shuō)是經(jīng)過(guò)消化道途徑進(jìn)行接種的疫苗。Whatisoralvaccine?口服疫苗,顧名思義4Whychoosetheoralvaccine?首先,口服疫苗避免了注射疫苗造成的驚嚇應(yīng)激,有效保護(hù)了動(dòng)物福利。其次,口服疫苗降低了養(yǎng)殖成本,例如人力成本、抗應(yīng)激產(chǎn)品的成本。最后,對(duì)于許多經(jīng)腸道和黏膜表面感染的致病微生物有較好的防御能力。口服疫苗具有巨大的市場(chǎng)前景!Whychoosetheoralvaccine?首先5WhydowechoosetheE.Coli?之所以選擇大腸桿菌作為研究對(duì)象,就是因?yàn)樽胸i大腸桿菌病是豬的常見(jiàn)傳染病之一,發(fā)病率、死亡率高達(dá)50%~100%,直接給豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。治療不及時(shí),即使恢復(fù)也變成僵豬,影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育,造成飼料的浪費(fèi),間接影響豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。WhydowechoosetheE.Coli?6大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件7WhyistheK88?1、大腸桿菌的致病性取決于它在小腸的粘附、定植、增殖以及產(chǎn)生毒素的能力,粘附因子或纖毛決定細(xì)菌定植的能力,一旦發(fā)生細(xì)菌定植,就會(huì)快速增值并產(chǎn)生毒素從而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。2、經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查,我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致仔豬大腸桿菌病的的最主要的粘附因子就是
3、K88幾乎100%由蛋白質(zhì)組成,具有較強(qiáng)的免疫原性。K88WhyistheK88?1、大腸桿菌的致病性取決于它8HowtopreventandtreattheE.Colidisease?最好的方法就是應(yīng)用為此,根據(jù)仔豬免疫系統(tǒng)的發(fā)育情況,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種抗體應(yīng)用方案:一、早期直接抗體應(yīng)用方案雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制二、后期間接抗體應(yīng)用方案攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用抗體HowtopreventandtreattheE9一、雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制一、雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制10Whydowechooseyolkantibody(IgY)?1、抗體水平高卵黃抗體所含有的抗體滴度大于血清中的抗體滴度,作為飼料添加劑具有更高的免疫保護(hù)效率。2、穩(wěn)定性高卵黃抗體具有很高的熱穩(wěn)定性,便于機(jī)械生產(chǎn)、加工。3、安全性高卵黃抗體可以用來(lái)防治相應(yīng)的病原體引起的感染并且無(wú)藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性。4、用途廣泛純化的卵黃抗體可以用來(lái)診斷疾病并且具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)省力的特點(diǎn)。Whydowechooseyolkantibody11Researchmathods1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)菌株的分離鑒定以及擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基+誘導(dǎo)劑37℃、220rpm24小時(shí)震蕩培養(yǎng)Researchmathods1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K8812名稱(chēng)豬大腸桿菌豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用細(xì)菌計(jì)數(shù)2.5×109cfu/ml1×109cfu/ml表1:細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果2、經(jīng)過(guò)SDS實(shí)驗(yàn)證明K88粘附素蛋白表達(dá)了以后,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),以保證有較高的細(xì)菌數(shù)來(lái)用于疫苗制備。名稱(chēng)豬大腸桿菌豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用豬沙133、疫苗的制備
1、菌株的滅活在菌液濃度為1×109cfu/mL的細(xì)菌懸液中加入終濃度為3‰的甲醛溶液,37℃恒溫振蕩作用48h。2、滅活效果鑒定滅活苗12滅活前細(xì)菌計(jì)數(shù)109cfu/mL109cfu/mL滅活后細(xì)菌計(jì)數(shù)003、疫苗的制備滅活苗12滅活前細(xì)菌計(jì)數(shù)109cfu/mL1143、疫苗的乳化將配制好并高壓滅菌的油相佐劑與滅活的菌液按照1:1的比例混合,并用勻漿儀乳化,乳化期間不定時(shí)抽樣檢測(cè)疫苗的乳化效果乳化好的滅活疫苗呈乳白色牛奶狀,滴入清水中時(shí)不溶解,不擴(kuò)散,不沉淀。3、疫苗的乳化154、預(yù)接種實(shí)驗(yàn)
為了檢驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性和可行性,避免設(shè)計(jì)不周造成浪費(fèi),我們?cè)O(shè)計(jì)了預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明以6×109cfu的量免疫效果最好,免疫雞群一開(kāi)始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),采食量下降、精神抑郁,趴臥不起。接種一周后雞群恢復(fù)正常,沒(méi)有出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)雞只死亡。4、預(yù)接種實(shí)驗(yàn)16免疫170日齡待開(kāi)產(chǎn)雞,雞群分為2組,每組100只,一組為對(duì)照組,一組為實(shí)驗(yàn)組。1、首免每羽注射1.0mL。2、兩周左右進(jìn)行二免,方法同初免,每羽注射1.5ml。3、四周后進(jìn)行三免,方法同初免,每羽注射2.0ml。4、每周收集卵黃液,采用試管直接凝集法進(jìn)行卵黃液中卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定。5、免疫待開(kāi)產(chǎn)雞群,誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,產(chǎn)生高抗體水平的雞蛋免疫170日齡待開(kāi)產(chǎn)雞,雞群分為2組,每組1017樣品編號(hào)12345678910111213抗體效價(jià)(log2)3666.57.58989111010106、免疫雞群的抗體效價(jià)變化表3:免疫雞群大腸桿菌k88抗體效價(jià)樣品編號(hào)12345678910111213抗體效價(jià)(log218免疫雞群的抗體效價(jià)變化以上結(jié)果表明:免疫蛋雞在免疫后卵黃中的特異性抗體開(kāi)始明顯升高,10周達(dá)到高峰,并持續(xù)到13周。免疫雞群的抗體效價(jià)變化以上結(jié)果表明:免疫蛋雞在免疫后卵黃中的19
收集免疫雞10~13周產(chǎn)的雞蛋,進(jìn)行噴干工藝的摸索,最后確定噴干時(shí)進(jìn)口溫度設(shè)定為160℃,出口溫度設(shè)定為90℃,對(duì)卵黃抗體滴度無(wú)影響,并且易于操作。7、卵黃抗體的噴霧干燥收集免疫雞10~13周產(chǎn)的雞蛋,進(jìn)行噴20指標(biāo)色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產(chǎn)品淡黃色80目12.6%97.6%8、卵黃抗體粉指標(biāo)測(cè)定保存條件:常溫下放置半年,卵黃抗體活性無(wú)影響。卵黃抗體噴干粉在生產(chǎn)上具有良好的加工和儲(chǔ)存性能!表4:卵黃抗體指標(biāo)指標(biāo)色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產(chǎn)品淡黃色80目12.6219、小鼠造模飼喂試驗(yàn)5周齡小鼠飼養(yǎng)觀察一周后無(wú)異常,直腸試紙檢測(cè)ETEC陰性,感染前,停止喂食12h,腹腔注射0.2ml菌液,2h后正常喂食。對(duì)照組處理的不同之處是把菌液改為生理鹽水。感染后對(duì)動(dòng)物的觀察:每隔3h觀察1次,連續(xù)觀察24小時(shí)并記錄。
表5:各實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡情況9、小鼠造模飼喂試驗(yàn)5周齡小鼠飼養(yǎng)觀察一周后無(wú)異常,直腸試紙2210、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂試驗(yàn)從表6可見(jiàn),3個(gè)組日增重最好的為試驗(yàn)②組達(dá)169.72g,最差的為對(duì)照組131.94g,料重比最好的為試驗(yàn)②組1.48,最差的為對(duì)照組達(dá)1.92,試驗(yàn)①組介于兩者之間。腹瀉頭次以試驗(yàn)①組為最小。10、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂試驗(yàn)從表6可見(jiàn),3個(gè)組日增23對(duì)照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個(gè)試驗(yàn)組,這表明合用IgY對(duì)有效降低仔豬斷奶后腹瀉的發(fā)生,且在合理范圍內(nèi)隨著劑量的增加其腹瀉效果越好。但是綜合料重比,腹瀉造成的死亡率等數(shù)據(jù)來(lái)看,基礎(chǔ)日糧+1%的k88卵黃抗體粉可以收到最佳的效果對(duì)照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個(gè)試驗(yàn)組,這表明合24考慮到實(shí)際生產(chǎn)中,導(dǎo)致仔豬腹瀉的情況較為復(fù)雜,不只是大腸桿菌K88粘附素,因此我們有做了進(jìn)一步的工作調(diào)整,將攜帶K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的幾種大腸桿菌還有傷寒沙門(mén)氏菌聯(lián)合在一起制成了大腸桿菌沙門(mén)氏菌二聯(lián)5價(jià)卵黃抗體。大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件25二、攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用二、攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫26實(shí)驗(yàn)一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的SDS和West-blot分析實(shí)驗(yàn)一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的27重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌技術(shù)路線重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)W281、重組乳酸菌的分子鑒定—PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PCR分子鑒定M:DL2000;1、4、7:為重組乳酸菌核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果1、重組乳酸菌的分子鑒定—PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PC29重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)W302大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡(West-bloting)結(jié)果1M234M:低分子量蛋白marker;1:大腸桿菌(K88)發(fā)酵液;2、4:乳酸菌發(fā)酵上清液3:乳酸菌菌體沉淀樣品18KD28KD45KD60KD100KD圖4:大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡結(jié)果2大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡(West-blotin31實(shí)驗(yàn)二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化生產(chǎn)條件的摸索實(shí)驗(yàn)二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化生產(chǎn)條件的摸索32重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方331重組乳酸菌的誘變選育1.1紫外誘變結(jié)果稀釋度對(duì)照誘變時(shí)間菌落個(gè)數(shù)致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0結(jié)論:誘變結(jié)果表明,誘變數(shù)據(jù)符合誘變成功的前提條件,可以對(duì)存活的菌落進(jìn)行選育。1重組乳酸菌的誘變選育1.1紫外誘變結(jié)果稀釋度對(duì)照誘變時(shí)341.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對(duì)數(shù)值均小于2為標(biāo)準(zhǔn),從17株乳桿菌中初步篩選出1株優(yōu)良菌株,其耐酸和耐膽鹽測(cè)定結(jié)果如表編號(hào)耐膽鹽測(cè)定(log)耐酸(log)原液(log)耐膽鹽對(duì)數(shù)差耐酸對(duì)數(shù)差1<47.727.62>2<22<47.827.67>2<23<47.777.71>2<24<47.787.78>2<255.017.757.7>2<265.117.597.69>2<27<47.617.84>2<28<47.577.61>2<294.697.77.72>2<210<47.727.7>2<2114.487.697.68>2<212<47.887.89>2<213<47.987.98>2<214<47.97.78>2<2156.147.587.53<2<2165.267.687.66>2<2174.887.797.76>2<21.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對(duì)數(shù)值均小于2為標(biāo)準(zhǔn),從1352重組乳酸菌選育株對(duì)小鼠腸粘液的體外粘附實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)活菌數(shù)(cfu/mL)原液活菌總數(shù)(cfu/mL)體外粘附率粘液11.63×1094.7×10964.2%粘液21.73×1094.7×10963.2%灌腸1.28×1094.7×10972.8%2重組乳酸菌選育株對(duì)小鼠腸粘液的體外粘附實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)活菌數(shù)(c363選育株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選育株傳10代后,在紅霉素培養(yǎng)基里的計(jì)數(shù)情況,表明遺傳穩(wěn)定性較好。3選育株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選育株傳10代后,在紅霉素培養(yǎng)基里37重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方38應(yīng)用生產(chǎn)常用的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基,沒(méi)再單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),做好種子液后加到500L發(fā)酵罐中,發(fā)酵12h后,再轉(zhuǎn)入5噸的發(fā)酵罐,每2h取一次樣,進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)和pH值的測(cè)定,并繪制生長(zhǎng)曲線。應(yīng)用生產(chǎn)常用的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基,沒(méi)再單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),391選育株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定1選育株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定402選育株的菌液PH值變化情況測(cè)定在5噸大罐中發(fā)酵時(shí)間以20小時(shí)為宜。2選育株的菌液PH值變化情況測(cè)定在5噸大罐中發(fā)酵時(shí)間以2041實(shí)驗(yàn)三、重組乳酸菌作為口服疫苗對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響及免疫保護(hù)效果的研究實(shí)驗(yàn)三、重組乳酸菌作為口服疫苗對(duì)小鼠免疫42小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程一覽9.10開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)10.19處理第一批小鼠11.6處理第二批11.22處理第三批10.28-30號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫9.24-26號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫10.10-12號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫11.14-16號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫12.4攻毒試驗(yàn)12.17處理最后一批小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程一覽9.10開(kāi)始10.19處理第11.6處理11431小鼠脾臟指數(shù)(mg/kg)測(cè)定結(jié)果從結(jié)果可以看出,各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組,且均差異顯著(P<0.05);表明基因工程菌對(duì)動(dòng)物脾臟生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。1小鼠脾臟指數(shù)(mg/kg)測(cè)定結(jié)果從結(jié)果可以看出,各實(shí)驗(yàn)442小鼠腸道內(nèi)容物sIgA
(mg/L)測(cè)定結(jié)果從四批實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,工程菌組sIgA含量均高于對(duì)照組、LP組,和疫苗組相比,sIgA的滴度持續(xù)維持高水平狀態(tài),表明工程菌產(chǎn)生的高水平sIgA抗體更加持久,而滅活疫苗產(chǎn)生高水平sIgA抗體維持時(shí)間較短,保護(hù)效力不如工程菌。組別第1批第2批第3批第4批生理鹽水50.54±27.80a68.17±6.64b70.79±4.52a65.27±13.44a
LP60.05±20.51a71.52±7.20b78.62±12.55ab83.50±19.25a
疫苗組66.84±14.88a53.43±5.56a94.32±4.18b86.11±14.03a
工程菌組94.02±26.62a98.32±4.94c91.86±9.11b90.45±6.57b
2小鼠腸道內(nèi)容物sIgA(mg/L)測(cè)定結(jié)果453血清中大腸桿菌k88抗體含量的OD值測(cè)定結(jié)果(大腸桿菌包被)從上述結(jié)果可以看出,各實(shí)驗(yàn)組k88抗體含量均高于對(duì)照組,攻毒以后,實(shí)驗(yàn)組均產(chǎn)生了k88抗體,工程菌組可以持久產(chǎn)生高水平的k88抗體。3血清中大腸桿菌k88抗體含量的OD值測(cè)定結(jié)果從上述結(jié)果可464小鼠腸道內(nèi)的乳酸菌和大腸桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果(log2)
而腸桿菌方面,連續(xù)三天灌服1010cfu/mL的大腸桿菌菌液,攻毒10天后殺死小鼠取小腸進(jìn)行大腸桿菌計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)各組乳酸菌差異不大,但腸桿菌中疫苗組和工程菌組數(shù)量最低。對(duì)腸道的整體保護(hù)效果,大致如下:工程菌組>疫苗組>LP組>生理鹽水組。組別乳酸菌大腸桿菌生理鹽水組8.94.17LP組8.535.11疫苗組8.83<4工程菌組8.7<44小鼠腸道內(nèi)的乳酸菌和大腸桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果(log2)47結(jié)果表明:1、在非特異性免疫方面,使用重組乳酸菌對(duì)小鼠生長(zhǎng)初期的脾臟指數(shù)和小鼠腸道內(nèi)sIgA的分泌有持續(xù)的促進(jìn)作用;2、在特異性免疫方面,重組乳酸菌的效果相比自制的大腸桿菌疫苗效果更加持久,能長(zhǎng)時(shí)間刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的大腸桿菌K88抗體。結(jié)果表明:48實(shí)驗(yàn)四、重組乳酸菌選育株作為口服疫苗對(duì)斷奶仔豬飼喂效果的研究實(shí)驗(yàn)四、重組乳酸菌選育株作為口服疫苗對(duì)斷奶仔豬飼喂效果的研究494.1重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬糞便中sIgA含量的影響結(jié)果表明,飼喂重組乳酸菌的斷奶仔豬糞便中sIgA的含量顯著多于對(duì)照組。表明基因工程乳酸菌可以顯著提高斷奶仔豬的腸道粘膜免疫,增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抵抗力。4.1重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬糞便中sIgA含量的影響結(jié)果表明504.2重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明,重組乳酸菌能顯著抑制腸道內(nèi)大腸桿菌的繁殖(P<0.05)。4.2重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明,51-10.9%
4.3重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬料重比的影響結(jié)果表明:重組乳酸菌促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育,降低料重比。-10.9%4.3重組乳酸菌對(duì)斷奶仔豬料重比的影響結(jié)果表明52結(jié)論經(jīng)過(guò)對(duì)基因工程重組乳酸菌的優(yōu)化選育,我們成功的篩選到了一株能用于實(shí)際生產(chǎn)的菌株。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該株乳酸工程菌,能夠1、顯著的抑制斷奶仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌的繁殖。2、提高斷奶仔豬腸道內(nèi)sIgA的滴度,有效增強(qiáng)了腸道的粘膜免疫3.促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育,降低料重比。結(jié)論經(jīng)過(guò)對(duì)基因工程重組乳酸菌的優(yōu)化選育,我們成53大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件54演講完畢,謝謝觀看!演講完畢,謝謝觀看!55大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件56大腸桿菌口服疫苗的研制
匯報(bào)人:范群平生物制品實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌口服疫苗的研制匯報(bào)人:范群平57Whatisvaccine?
廣義的疫苗是為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生和流行而接種于機(jī)體的預(yù)防性生物制品。生物制品,是指用微生物或其毒素,人或動(dòng)物的血清、細(xì)胞等制備的用來(lái)預(yù)防、診斷和治療用的制劑。預(yù)防用的抗體制劑也可以歸類(lèi)為疫苗Whatisvaccine?廣義的疫苗是預(yù)防用58Whatisoralvaccine?口服疫苗,顧名思義,就是經(jīng)“口”途徑接種的疫苗,進(jìn)一步來(lái)說(shuō)是經(jīng)過(guò)消化道途徑進(jìn)行接種的疫苗。Whatisoralvaccine?口服疫苗,顧名思義59Whychoosetheoralvaccine?首先,口服疫苗避免了注射疫苗造成的驚嚇應(yīng)激,有效保護(hù)了動(dòng)物福利。其次,口服疫苗降低了養(yǎng)殖成本,例如人力成本、抗應(yīng)激產(chǎn)品的成本。最后,對(duì)于許多經(jīng)腸道和黏膜表面感染的致病微生物有較好的防御能力??诜呙缇哂芯薮蟮氖袌?chǎng)前景!Whychoosetheoralvaccine?首先60WhydowechoosetheE.Coli?之所以選擇大腸桿菌作為研究對(duì)象,就是因?yàn)樽胸i大腸桿菌病是豬的常見(jiàn)傳染病之一,發(fā)病率、死亡率高達(dá)50%~100%,直接給豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。治療不及時(shí),即使恢復(fù)也變成僵豬,影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育,造成飼料的浪費(fèi),間接影響豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。WhydowechoosetheE.Coli?61大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件62WhyistheK88?1、大腸桿菌的致病性取決于它在小腸的粘附、定植、增殖以及產(chǎn)生毒素的能力,粘附因子或纖毛決定細(xì)菌定植的能力,一旦發(fā)生細(xì)菌定植,就會(huì)快速增值并產(chǎn)生毒素從而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。2、經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查,我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致仔豬大腸桿菌病的的最主要的粘附因子就是
3、K88幾乎100%由蛋白質(zhì)組成,具有較強(qiáng)的免疫原性。K88WhyistheK88?1、大腸桿菌的致病性取決于它63HowtopreventandtreattheE.Colidisease?最好的方法就是應(yīng)用為此,根據(jù)仔豬免疫系統(tǒng)的發(fā)育情況,我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種抗體應(yīng)用方案:一、早期直接抗體應(yīng)用方案雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制二、后期間接抗體應(yīng)用方案攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用抗體HowtopreventandtreattheE64一、雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制一、雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)卵黃抗體的研制65Whydowechooseyolkantibody(IgY)?1、抗體水平高卵黃抗體所含有的抗體滴度大于血清中的抗體滴度,作為飼料添加劑具有更高的免疫保護(hù)效率。2、穩(wěn)定性高卵黃抗體具有很高的熱穩(wěn)定性,便于機(jī)械生產(chǎn)、加工。3、安全性高卵黃抗體可以用來(lái)防治相應(yīng)的病原體引起的感染并且無(wú)藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性。4、用途廣泛純化的卵黃抗體可以用來(lái)診斷疾病并且具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)省力的特點(diǎn)。Whydowechooseyolkantibody66Researchmathods1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K88)菌株的分離鑒定以及擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基+誘導(dǎo)劑37℃、220rpm24小時(shí)震蕩培養(yǎng)Researchmathods1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(K8867名稱(chēng)豬大腸桿菌豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用細(xì)菌計(jì)數(shù)2.5×109cfu/ml1×109cfu/ml表1:細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果2、經(jīng)過(guò)SDS實(shí)驗(yàn)證明K88粘附素蛋白表達(dá)了以后,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),以保證有較高的細(xì)菌數(shù)來(lái)用于疫苗制備。名稱(chēng)豬大腸桿菌豬沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用豬沙683、疫苗的制備
1、菌株的滅活在菌液濃度為1×109cfu/mL的細(xì)菌懸液中加入終濃度為3‰的甲醛溶液,37℃恒溫振蕩作用48h。2、滅活效果鑒定滅活苗12滅活前細(xì)菌計(jì)數(shù)109cfu/mL109cfu/mL滅活后細(xì)菌計(jì)數(shù)003、疫苗的制備滅活苗12滅活前細(xì)菌計(jì)數(shù)109cfu/mL1693、疫苗的乳化將配制好并高壓滅菌的油相佐劑與滅活的菌液按照1:1的比例混合,并用勻漿儀乳化,乳化期間不定時(shí)抽樣檢測(cè)疫苗的乳化效果乳化好的滅活疫苗呈乳白色牛奶狀,滴入清水中時(shí)不溶解,不擴(kuò)散,不沉淀。3、疫苗的乳化704、預(yù)接種實(shí)驗(yàn)
為了檢驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性和可行性,避免設(shè)計(jì)不周造成浪費(fèi),我們?cè)O(shè)計(jì)了預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明以6×109cfu的量免疫效果最好,免疫雞群一開(kāi)始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),采食量下降、精神抑郁,趴臥不起。接種一周后雞群恢復(fù)正常,沒(méi)有出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)雞只死亡。4、預(yù)接種實(shí)驗(yàn)71免疫170日齡待開(kāi)產(chǎn)雞,雞群分為2組,每組100只,一組為對(duì)照組,一組為實(shí)驗(yàn)組。1、首免每羽注射1.0mL。2、兩周左右進(jìn)行二免,方法同初免,每羽注射1.5ml。3、四周后進(jìn)行三免,方法同初免,每羽注射2.0ml。4、每周收集卵黃液,采用試管直接凝集法進(jìn)行卵黃液中卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定。5、免疫待開(kāi)產(chǎn)雞群,誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,產(chǎn)生高抗體水平的雞蛋免疫170日齡待開(kāi)產(chǎn)雞,雞群分為2組,每組1072樣品編號(hào)12345678910111213抗體效價(jià)(log2)3666.57.58989111010106、免疫雞群的抗體效價(jià)變化表3:免疫雞群大腸桿菌k88抗體效價(jià)樣品編號(hào)12345678910111213抗體效價(jià)(log273免疫雞群的抗體效價(jià)變化以上結(jié)果表明:免疫蛋雞在免疫后卵黃中的特異性抗體開(kāi)始明顯升高,10周達(dá)到高峰,并持續(xù)到13周。免疫雞群的抗體效價(jià)變化以上結(jié)果表明:免疫蛋雞在免疫后卵黃中的74
收集免疫雞10~13周產(chǎn)的雞蛋,進(jìn)行噴干工藝的摸索,最后確定噴干時(shí)進(jìn)口溫度設(shè)定為160℃,出口溫度設(shè)定為90℃,對(duì)卵黃抗體滴度無(wú)影響,并且易于操作。7、卵黃抗體的噴霧干燥收集免疫雞10~13周產(chǎn)的雞蛋,進(jìn)行噴75指標(biāo)色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產(chǎn)品淡黃色80目12.6%97.6%8、卵黃抗體粉指標(biāo)測(cè)定保存條件:常溫下放置半年,卵黃抗體活性無(wú)影響。卵黃抗體噴干粉在生產(chǎn)上具有良好的加工和儲(chǔ)存性能!表4:卵黃抗體指標(biāo)指標(biāo)色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產(chǎn)品淡黃色80目12.6769、小鼠造模飼喂試驗(yàn)5周齡小鼠飼養(yǎng)觀察一周后無(wú)異常,直腸試紙檢測(cè)ETEC陰性,感染前,停止喂食12h,腹腔注射0.2ml菌液,2h后正常喂食。對(duì)照組處理的不同之處是把菌液改為生理鹽水。感染后對(duì)動(dòng)物的觀察:每隔3h觀察1次,連續(xù)觀察24小時(shí)并記錄。
表5:各實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡情況9、小鼠造模飼喂試驗(yàn)5周齡小鼠飼養(yǎng)觀察一周后無(wú)異常,直腸試紙7710、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂試驗(yàn)從表6可見(jiàn),3個(gè)組日增重最好的為試驗(yàn)②組達(dá)169.72g,最差的為對(duì)照組131.94g,料重比最好的為試驗(yàn)②組1.48,最差的為對(duì)照組達(dá)1.92,試驗(yàn)①組介于兩者之間。腹瀉頭次以試驗(yàn)①組為最小。10、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂試驗(yàn)從表6可見(jiàn),3個(gè)組日增78對(duì)照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個(gè)試驗(yàn)組,這表明合用IgY對(duì)有效降低仔豬斷奶后腹瀉的發(fā)生,且在合理范圍內(nèi)隨著劑量的增加其腹瀉效果越好。但是綜合料重比,腹瀉造成的死亡率等數(shù)據(jù)來(lái)看,基礎(chǔ)日糧+1%的k88卵黃抗體粉可以收到最佳的效果對(duì)照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個(gè)試驗(yàn)組,這表明合79考慮到實(shí)際生產(chǎn)中,導(dǎo)致仔豬腹瀉的情況較為復(fù)雜,不只是大腸桿菌K88粘附素,因此我們有做了進(jìn)一步的工作調(diào)整,將攜帶K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的幾種大腸桿菌還有傷寒沙門(mén)氏菌聯(lián)合在一起制成了大腸桿菌沙門(mén)氏菌二聯(lián)5價(jià)卵黃抗體。大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制課件80二、攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用二、攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫81實(shí)驗(yàn)一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的SDS和West-blot分析實(shí)驗(yàn)一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的82重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌技術(shù)路線重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)W831、重組乳酸菌的分子鑒定—PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PCR分子鑒定M:DL2000;1、4、7:為重組乳酸菌核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果1、重組乳酸菌的分子鑒定—PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PC84重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)W852大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡(West-bloting)結(jié)果1M234M:低分子量蛋白marker;1:大腸桿菌(K88)發(fā)酵液;2、4:乳酸菌發(fā)酵上清液3:乳酸菌菌體沉淀樣品18KD28KD45KD60KD100KD圖4:大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡結(jié)果2大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡(West-blotin86實(shí)驗(yàn)二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化生產(chǎn)條件的摸索實(shí)驗(yàn)二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化生產(chǎn)條件的摸索87重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方881重組乳酸菌的誘變選育1.1紫外誘變結(jié)果稀釋度對(duì)照誘變時(shí)間菌落個(gè)數(shù)致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0結(jié)論:誘變結(jié)果表明,誘變數(shù)據(jù)符合誘變成功的前提條件,可以對(duì)存活的菌落進(jìn)行選育。1重組乳酸菌的誘變選育1.1紫外誘變結(jié)果稀釋度對(duì)照誘變時(shí)891.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對(duì)數(shù)值均小于2為標(biāo)準(zhǔn),從17株乳桿菌中初步篩選出1株優(yōu)良菌株,其耐酸和耐膽鹽測(cè)定結(jié)果如表編號(hào)耐膽鹽測(cè)定(log)耐酸(log)原液(log)耐膽鹽對(duì)數(shù)差耐酸對(duì)數(shù)差1<47.727.62>2<22<47.827.67>2<23<47.777.71>2<24<47.787.78>2<255.017.757.7>2<265.117.597.69>2<27<47.617.84>2<28<47.577.61>2<294.697.77.72>2<210<47.727.7>2<2114.487.697.68>2<212<47.887.89>2<213<47.987.98>2<214<47.97.78>2<2156.147.587.53<2<2165.267.687.66>2<2174.887.797.76>2<21.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對(duì)數(shù)值均小于2為標(biāo)準(zhǔn),從1902重組乳酸菌選育株對(duì)小鼠腸粘液的體外粘附實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)活菌數(shù)(cfu/mL)原液活菌總數(shù)(cfu/mL)體外粘附率粘液11.63×1094.7×10964.2%粘液21.73×1094.7×10963.2%灌腸1.28×1094.7×10972.8%2重組乳酸菌選育株對(duì)小鼠腸粘液的體外粘附實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)活菌數(shù)(c913選育株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選育株傳10代后,在紅霉素培養(yǎng)基里的計(jì)數(shù)情況,表明遺傳穩(wěn)定性較好。3選育株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選育株傳10代后,在紅霉素培養(yǎng)基里92重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方93應(yīng)用生產(chǎn)常用的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基,沒(méi)再單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),做好種子液后加到500L發(fā)酵罐中,發(fā)酵12h后,再轉(zhuǎn)入5噸的發(fā)酵罐,每2h取一次樣,進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)和pH值的測(cè)定,并繪制生長(zhǎng)曲線。應(yīng)用生產(chǎn)常用的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基,沒(méi)再單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),941選育株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定1選育株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定952選育株的菌液PH值變化情況測(cè)定在5噸大罐中發(fā)酵時(shí)間以20小時(shí)為宜。2選育株的菌液PH值變化情況測(cè)定在5噸大罐中發(fā)酵時(shí)間以2096實(shí)驗(yàn)三、重組乳酸菌作為口服疫苗對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響及免疫保護(hù)效果的研究實(shí)驗(yàn)三、重組乳酸菌作為口服疫苗對(duì)小鼠免疫97小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程一覽9.10開(kāi)始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)10.19處理第一批小鼠11.6處理第二批11.22處理第三批10.28-30號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫9.24-26號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫10.10-12號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫11.14-16號(hào),連續(xù)三天灌胃,同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫12.4攻毒試驗(yàn)12.17處理最后一批小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程一覽9.10開(kāi)始10.19處理第11.6處理11981小鼠脾臟指數(shù)(mg/kg)測(cè)定結(jié)果從結(jié)果可以看出,各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組,且均差異顯著(P<0.05);表明基因工程菌對(duì)動(dòng)物脾臟生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。1小鼠脾臟指數(shù)(mg/kg)測(cè)定結(jié)果從結(jié)果可以看出,各實(shí)驗(yàn)992小鼠腸道內(nèi)容物sIgA
(mg/L)測(cè)定結(jié)果
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