抗體工程概述課件

抗體工程廖振林Tel：68914Email：602581821@食品學(xué)院微生物教研室抗體工程廖振林食品學(xué)院微生物教研室1概述概述概述概述2講述內(nèi)容1抗原2抗體3多克隆抗體4細(xì)胞工程抗體5基因工程抗體6抗體的分離純化與鑒定7抗體的應(yīng)用及免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)講述內(nèi)容1抗原3抗體工程概述課件4抗體基本結(jié)構(gòu)抗體基本結(jié)構(gòu)5免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)6抗體工程概述課件7抗體工程概述課件8抗體攻擊病毒抗體攻擊病毒9凝集細(xì)菌凝集細(xì)菌10抗SARS的單抗SARS-CoV抗SARS的單抗SARS-CoV11抗體是對其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡航導(dǎo)彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞檢驗(yàn) 以ELISA偵測特定

病原體抗體是對其抗原有極強(qiáng)專一性的研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測特12抗體藥物銷售趨勢圖抗體藥物銷售趨勢圖13表已批準(zhǔn)上市的治療性單抗2001淋巴瘤CD52人源化抗體Campath2000淋巴瘤CD33人源化抗體化療藥物交聯(lián)物Mylotarg1998移植排斥兔多抗Thymogloblin1998RSV感染RSVF蛋白人源化抗體Synagis1998 乳腺癌HER-2人源化抗體Herceptin19981999炎癥性腸病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α人-鼠嵌合抗體Remicade1998移植排斥CD25人-鼠嵌合抗體Simulect1997淋巴瘤CD20人-鼠嵌合抗體Rituxan1997移植排斥CD25人源化抗體Zenapax1994冠心病血小板受體ⅡbⅢa 人-鼠嵌合FabReoPro1995大腸癌17-1A鼠單抗Panorex1986移植排斥CD3鼠單抗 OKT3批準(zhǔn)日期適應(yīng)癥 靶向抗原抗體種類抗體名稱表已批準(zhǔn)上市的治療性單抗2001淋巴瘤CD52人源化抗體14生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物（蛋白類藥物）人源化治療性單克隆抗體藥物基因治療技術(shù)現(xiàn)代中藥生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物（蛋白類藥物）人源化治療性單15●至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種。●2003年治療用單抗銷售總額已超過52億美元。●2006年預(yù)計(jì)50-60個(gè)治療性單抗上市?！?010年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元。●美國已占全球單抗市場90%—一支獨(dú)秀?！裢耆嗽椿瘑慰宫F(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段●至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，16抗體生成技術(shù)抗體生成技術(shù)17Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個(gè)以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant18整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技19多克隆抗體多克隆抗體20多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。

實(shí)際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，胎盤球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點(diǎn)：特異性差。多克隆抗體（polyclonalantibody）21傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾22

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123單克隆抗體單克隆抗體24可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的淋巴細(xì)胞若與癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可25

●

一個(gè)

B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一

抗原決定基?！?/p>

若有許多抗原決定基，則需許多株

B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一個(gè)B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一抗原決定基261234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗271234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY28m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤29

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體-a-b-c-d-a-b-30-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞（Subcloning）

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG31基因工程抗體基因工程抗體32抗體工程概述課件331人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)34

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆35克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體?？寺∈髥慰沟目勺儏^(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PC362鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。

2鼠單抗可變區(qū)的人源化盡管嵌合抗體的免疫37抗體工程概述課件38經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力39人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。40

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。

研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序41小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):

可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別42FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位FabFvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab43由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。(144

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(245

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。

連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)46

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí)，可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;47

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式:一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%，但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達(dá)，將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式:48即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，49約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)504雙特異抗體和多價(jià)抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

4雙特異抗體和多價(jià)抗體雙鏈抗體（Diabody）51

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時(shí)識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。

即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。雙特異性抗體(bispecificantibody52

Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。表達(dá)后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基53抗體工程概述課件54所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性55抗體工程概述課件56

抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達(dá)，然后篩選出所需的特異基因和抗體。

PCR技術(shù);免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達(dá);噬菌體表面展示文庫技術(shù)。5抗體庫技術(shù)5抗體庫技術(shù)57

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達(dá)后篩選。

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)58它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。噬菌體抗體庫技術(shù)它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)59

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(tǒng)(phagesurfacedisplaysystem)1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面60抗體工程概述課件61

噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導(dǎo)系列的緊靠下游隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):62用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡63該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):

將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來;可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù);抗體基因篩選的范圍廣;技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn);適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn):64噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細(xì)胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識別一增殖過程上模擬了B細(xì)胞的成熟過程，從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容65抗體工程概述課件666轉(zhuǎn)人Ig基因小鼠獲取人Ig基因：構(gòu)建人Ig的YAC文庫及篩選小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)小鼠內(nèi)源性Ig基因的敲除獲得完整人Ig-YACs克隆Ig-YACs克隆小ES細(xì)胞的導(dǎo)入含人Ig-YACs的ES細(xì)胞移入小鼠胚胎含人Ig-YACs的ES細(xì)胞的小鼠胚胎向小鼠體內(nèi)送還嵌合純合小鼠的產(chǎn)生和鑒定純合小鼠制備特異性完全人源化抗體6轉(zhuǎn)人Ig基因小鼠獲取人Ig基因：構(gòu)建人Ig的YAC文庫及67抗體工程廖振林Tel：68914Email：602581821@食品學(xué)院微生物教研室抗體工程廖振林食品學(xué)院微生物教研室68概述概述概述概述69講述內(nèi)容1抗原2抗體3多克隆抗體4細(xì)胞工程抗體5基因工程抗體6抗體的分離純化與鑒定7抗體的應(yīng)用及免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)講述內(nèi)容1抗原70抗體工程概述課件71抗體基本結(jié)構(gòu)抗體基本結(jié)構(gòu)72免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)73抗體工程概述課件74抗體工程概述課件75抗體攻擊病毒抗體攻擊病毒76凝集細(xì)菌凝集細(xì)菌77抗SARS的單抗SARS-CoV抗SARS的單抗SARS-CoV78抗體是對其抗原有極強(qiáng)專一性的魔彈或巡航導(dǎo)彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞檢驗(yàn) 以ELISA偵測特定

病原體抗體是對其抗原有極強(qiáng)專一性的研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測特79抗體藥物銷售趨勢圖抗體藥物銷售趨勢圖80表已批準(zhǔn)上市的治療性單抗2001淋巴瘤CD52人源化抗體Campath2000淋巴瘤CD33人源化抗體化療藥物交聯(lián)物Mylotarg1998移植排斥兔多抗Thymogloblin1998RSV感染RSVF蛋白人源化抗體Synagis1998 乳腺癌HER-2人源化抗體Herceptin19981999炎癥性腸病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α人-鼠嵌合抗體Remicade1998移植排斥CD25人-鼠嵌合抗體Simulect1997淋巴瘤CD20人-鼠嵌合抗體Rituxan1997移植排斥CD25人源化抗體Zenapax1994冠心病血小板受體ⅡbⅢa 人-鼠嵌合FabReoPro1995大腸癌17-1A鼠單抗Panorex1986移植排斥CD3鼠單抗 OKT3批準(zhǔn)日期適應(yīng)癥 靶向抗原抗體種類抗體名稱表已批準(zhǔn)上市的治療性單抗2001淋巴瘤CD52人源化抗體81生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物（蛋白類藥物）人源化治療性單克隆抗體藥物基因治療技術(shù)現(xiàn)代中藥生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物（蛋白類藥物）人源化治療性單82●至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種?！?003年治療用單抗銷售總額已超過52億美元?！?006年預(yù)計(jì)50-60個(gè)治療性單抗上市。●2010年預(yù)計(jì)單抗銷售額200億美元。●美國已占全球單抗市場90%—一支獨(dú)秀?！裢耆嗽椿瘑慰宫F(xiàn)有多個(gè)處于臨床前階段●至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，83抗體生成技術(shù)抗體生成技術(shù)84Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個(gè)以上氨基酸Epitope,Antigenicdeterminant85整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技86多克隆抗體多克隆抗體87多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。

實(shí)際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，胎盤球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點(diǎn)：特異性差。多克隆抗體（polyclonalantibody）88傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾89

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?190單克隆抗體單克隆抗體91可生產(chǎn)有用抗體的

淋巴細(xì)胞

若與

癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)Bcell只產(chǎn)生一種抗體可生產(chǎn)有用抗體的淋巴細(xì)胞若與癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可92

●

一個(gè)

B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一

抗原決定基?！?/p>

若有許多抗原決定基，則需許多株

B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基●一個(gè)B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一抗原決定基931234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗941234mmmm1234YYYYYYYYY1234mmmm1234YYYYYYYYY95m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤96

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體-a-b-c-d-a-b-97-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞（Subcloning）

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG98基因工程抗體基因工程抗體99抗體工程概述課件1001人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)101

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆102克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體?？寺∈髥慰沟目勺儏^(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PC1032鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時(shí)它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。

2鼠單抗可變區(qū)的人源化盡管嵌合抗體的免疫104抗體工程概述課件105經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力106人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個(gè)可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。

人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。107

定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。

研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序108小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):

可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強(qiáng);不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別109FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位FabFvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab110由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。(1111

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2112

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。

連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)113

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時(shí)，可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中;如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時(shí)可用完全人工合成法;114

單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式:一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%，但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達(dá)，將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式:115即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，116約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)1174雙特異抗體和多價(jià)抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。

4雙特異抗體和多價(jià)抗體雙鏈抗體（Diabody）118

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時(shí)識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。

即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。雙特異性抗體(bispecificantibody119

Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。表達(dá)后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基120抗體工程概述課件121所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞