中藥化學(xué)第七單元色譜操作課件

第八單元色譜操作第八單元色譜操作1色譜分離條件的選擇

色譜分離條件的選擇2吸附色譜的操作技術(shù)操作形式：吸附薄層色譜吸附柱色譜

吸附色譜的操作技術(shù)3柱色譜法經(jīng)典的柱色譜法是將作為固定相的吸附劑裝在一根玻管柱中(柱長(zhǎng)一般從幾十厘米到上百厘米不等)，從管頂加入樣品溶液，再從管頂加人流動(dòng)相。使流動(dòng)相從上往下流過而使各種成分分離并依次流出色譜柱的過程稱為洗脫。在洗脫時(shí)，可在柱的下端依次收集洗脫液并進(jìn)行檢查，每一份洗脫液從幾毫升到幾十毫升甚至幾百毫升不等。整個(gè)分離過程需幾小時(shí)甚至幾天才能完成。經(jīng)典柱色譜法主要用于分離和精制較大量的樣品，通常適用于幾十毫克到幾十克樣品的分離。近幾十年來飛速發(fā)展的高效液相色譜法采用遠(yuǎn)小于經(jīng)典色譜法的色譜柱(柱長(zhǎng)5—30cm，柱內(nèi)徑0.2—4.0cm)，較細(xì)的固定相(粒徑5～10μm)，用高壓泵輸送流動(dòng)相，具有分離性能好、分析速度快、流出組分容易收集、可以在線檢測(cè)和儀器化等經(jīng)典色譜法所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。柱色譜法4色譜柱的選擇色譜柱的內(nèi)徑與柱長(zhǎng)的比例一般在1：10～1：20(30)之間。有時(shí)為了獲得好的分離效果，可采用細(xì)長(zhǎng)的色譜柱；有時(shí)為了從溶液中吸去某種成分、濾去不溶物以及在利用活性炭脫色時(shí)為濾去細(xì)微的活性炭顆?；蛉艄枘z的顆粒較細(xì)，而粒度分布范圍窄，則可采用短柱(1：5)，這樣不僅增大了截面積，而且也增加了樣品的載量。有的色譜柱下端有活塞,有的有塞板。色譜柱的選擇5

裝柱

A．干法裝柱。直接用小漏斗將吸附劑均勻裝入柱內(nèi)的方法。

B．濕法裝柱。將吸附劑裝入盛有洗脫液的柱內(nèi)，或?qū)⑽絼┡c洗脫液混合成混懸液再裝入柱中。

C．操作要點(diǎn)裝柱前柱底要墊一層脫脂棉、玻璃纖維或塞板以防吸附劑外漏。干法裝柱時(shí)要用橡皮槌輕輕敲打色譜柱，使吸附劑裝填連續(xù)均勻、緊密，然后用洗脫劑洗脫并保持一定液面；濕法裝柱時(shí)注意打開下端活塞，洗脫劑應(yīng)始終保持一定的液面高度，為了增強(qiáng)分離效果，提高分離速度，可在柱面覆蓋一層處理干凈的均勻的細(xì)沙（石英沙、粗硅膠）。

裝柱6根據(jù)所采用吸附劑的不同，裝柱方法略有不同：

氧化鋁一般先準(zhǔn)確量取一定體積的溶劑(Vo)，將色譜柱的活塞稍打開，將溶劑滴人接受器中，同時(shí)將氧化鋁慢慢地加入，保持邊沉降邊添加的狀態(tài)，直至加完。氧化鋁加入速度不宜太快，否則將帶人空氣泡。必要時(shí)可以在色譜管外輕輕敲打振動(dòng)，使氧化鋁均勻下降，并有助于趕走氣泡。當(dāng)采用活性較高的氧化鋁進(jìn)行色譜時(shí)，更應(yīng)注意。待氧化鋁加完后，仍使溶劑流動(dòng)一定時(shí)間，然后將氧化鋁上面的溶劑全部滴人接受器，準(zhǔn)確量取接受器內(nèi)的溶劑量(V1)。從Vo—V1之差，就可以知道氧化鋁內(nèi)包含的溶劑體積。這樣在色譜過程中，就可以掌握大致在什么時(shí)候開始收集流出組分；當(dāng)變換溶劑的時(shí)候，就可以知道新?lián)Q溶劑大致在哪一流分開始。根據(jù)所采用吸附劑的不同，裝柱方法略有不同：

氧化鋁7硅膠由于硅膠多為多孔性物質(zhì)，一般用濕法，即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡除去后，連同溶劑一起傾人層析柱中，最好一次傾人，否則由于不同粒度大小的硅膠沉降速度不一，使硅膠柱有明顯的分段現(xiàn)象，影響分離效果。另亦可采用干法裝柱，將所需硅膠一次傾人柱中，然后蹾緊至硅膠高度不改變?yōu)橹埂．?dāng)采用分配層析時(shí)，應(yīng)先將預(yù)先選定的固定相溶劑如水、緩沖液或極性溶劑加入硅膠中，一般比例為1：0.5—1較為適中，攪拌混合均勻，傾人預(yù)先選定的移動(dòng)相溶劑中并激烈攪拌，使兩相互相飽和達(dá)到平衡．層析管中事先放人用固定相溶劑劇裂振搖飽和后的移動(dòng)相，將上述吸著固定相的硅膠按濕法裝柱，不斷輕敲管壁，使均勻緊密．另外亦可采用加硅膠于固定相飽和的移動(dòng)相中，按濕法裝柱，然后用固定相飽和的流動(dòng)相通過硅膠柱，使達(dá)到層析時(shí)穩(wěn)定的平衡條件．硅膠8活性炭因活性炭在水中的吸附力最強(qiáng)，一般在水中裝柱。色譜柱內(nèi)先加少量蒸餾水，再以玻璃纖維塞住底部，并除去玻璃纖維中的氣泡?；钚蕴恳哉麴s水浸泡1h左右，不斷攪拌除去氣泡。然后倒人柱中，讓其自然沉降，裝至所需體積，備用。粉末活性炭因流速太慢，需與硅藻土(1：1)混合后，再用蒸餾水調(diào)成糊狀裝柱。并且待樣品上柱后，在色譜管頂端連一有自動(dòng)控制的加壓泵或在色譜管下端連一減壓泵進(jìn)行色譜?；钚蕴?聚酰胺預(yù)處理：取聚酰胺粉以90％一95％乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入色譜柱中。用3—4倍體積的90％一95％乙醇洗滌，洗至洗液透明并在蒸干后無殘?jiān)?或極少殘?jiān)?。再依次用2—2.5倍體積，質(zhì)量濃度為5％的NaOH水溶液、1倍體積的蒸餾水、2—2.5倍體積的10％醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。裝柱：若用含水溶劑系統(tǒng)洗脫，常以水裝柱，方法同活性炭的裝柱。若用非極性溶劑系統(tǒng)洗脫時(shí)，常以溶劑組分中極性低的組分裝柱。若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面，加樣時(shí)應(yīng)將柱底端的氯仿層放出并立即加樣，加樣后頂端用棉花塞緊。在色譜柱關(guān)閉時(shí)，應(yīng)將頂端多余的氯仿液放出，否則，聚酰胺會(huì)浮起而攪亂層帶。聚酰胺10加樣樣品上柱可采取二種方式：濕法干法加樣11濕法

如樣品能溶于移動(dòng)相可用少量移動(dòng)相溶解，制成體積小、濃度高的溶液，盡可能保留加樣色帶狹窄，輕輕注入已準(zhǔn)備好的色譜柱上，上樣時(shí)注意沿著柱內(nèi)壁慢慢加入，始終保持吸附劑上端表面平整，勿使色譜柱面受到擾動(dòng)，否則將影響色譜效果。濕法12干法如果樣品難溶于移動(dòng)相或不易溶于開始色譜使用的有機(jī)溶劑，那么先將樣品溶于易溶的、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，以少量的吸附劑拌勻，然后將有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，加適量的移動(dòng)相拌勻再上柱，再按上述裝柱法裝柱，將帶有樣品的吸附劑加在色譜柱中的吸附劑上面。并在上面覆蓋一薄層純凈的砂，然后用移動(dòng)相展開．干法13上樣量一般為上樣量：吸附劑=1：60～1：30氧化鋁的樣品量一般為1：20～50，根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)而定。氧化鋁對(duì)萜烯、倍半萜烯等的吸附力較弱，這時(shí)氧化鋁用量可增至樣品量的100—200倍，而且為了盡量減少這類化合物在色譜柱中的擴(kuò)散，色譜過程不能有間歇。硅膠色譜樣品量，一般為1：30～1：60，若作為分配層析比例應(yīng)加大，主要根據(jù)分離物質(zhì)的難易采確定．較難分離者有時(shí)甚至可選1：500～1：1000。聚酰胺色譜樣品量一般每100m1聚酰胺可上樣1.5—2.5g，實(shí)際上其比例視具體情況而定．樣品先用洗脫溶劑溶解，濃度約20—30%。若不溶解于洗脫劑，可選用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑溶解，拌入干粉中后將溶劑減壓蒸去，濕法裝入柱頂．上樣量14洗脫洗脫方式：等強(qiáng)度（isocratic）梯度（gradient）

洗脫15等強(qiáng)度洗脫：在同一洗脫周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目少、性質(zhì)差別不大的樣品。

等強(qiáng)度洗脫：16梯度洗脫：同一洗脫周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等。分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜樣品時(shí)須采用梯度洗脫技術(shù)，使所有組分都在適宜條件下獲得分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度；但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫：17梯度洗脫曲線類型：兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程序進(jìn)行混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度凹形梯度凸形梯度階梯形梯度梯度洗脫曲線類型：18線性梯度最為常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫；如果用等強(qiáng)度洗脫獲得的色譜圖前段峰重疊，后段峰分開且保留時(shí)間太長(zhǎng)，可以適當(dāng)降低起始溶劑的強(qiáng)度后，采用凹形梯度洗脫，梯度起始階段溶劑強(qiáng)度低，使分離度增大，而末尾階段溶劑強(qiáng)度迅速增加，使組分快速洗脫出柱；也可降低起始溶劑的強(qiáng)度后，采用快速線性梯度洗脫；或者采用階梯式梯度洗脫。總之，應(yīng)該根據(jù)樣品的實(shí)際情況，選擇適宜的梯度曲線、梯度速度和時(shí)間、梯度起始和結(jié)束的溶劑組成。線性梯度最為常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗19由薄層色譜摸索柱色譜條件分離條件最佳與可用范圍的k值表k=0.4,Rf=0.7k=4.0,Rf=0.2色譜類型參數(shù)最佳范圍可用范圍HPLCk2~51~10TLCk0.4~40.1~9GCk~20.2~20由薄層色譜摸索柱色譜條件色譜類型參數(shù)20注意：洗脫時(shí)要盡量避免使用下列溶劑：A．醇類、乙酸乙酯，如樣品中含酯類易發(fā)生酯交換。B．丙酮與硅膠作用C．甲酸、吡啶，溶解固定相注意：21

流速：過快不能達(dá)到平衡過慢色帶擴(kuò)散

最佳流速：1V0/0.5~1h

V0=流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)所占體積一般為上柱硅膠量的1.5倍;松的為2倍，緊的為1.2倍流速：22

流份收集體積：

過小—增加工作量過大—人為混合一般流份體積:1流份=V01/10流份收集體積：23

預(yù)測(cè)被分離物質(zhì)的洗脫體積

V保=V0

/Rf

式:

V0=流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)所占體積V保=保留體積(被分離物質(zhì)的洗脫體積)

若Rf=0.1,則V保=10V0

若Rf=0.2,則V保=5V0若Rf=0.3,則V保=3.3V0

預(yù)測(cè)被分離物質(zhì)的洗脫體積24一般連續(xù)洗脫(柱色譜)的條件:以TLC的Rf=0.1~0.3條件為佳先用單一溶劑,若Rf值過大,則降低溶劑極性若Rf值過小,則增加溶劑極性若單一溶劑不能使Rf值=0.1~0.3,則用混合溶劑一種溶劑Rf=0另一種溶劑Rf=1混合使Rf=0.1~0.3.若斑點(diǎn)較多,則選適當(dāng)溶劑,使第一斑點(diǎn)展出,而其它斑點(diǎn)留在原點(diǎn)。一般連續(xù)洗脫(柱色譜)的條件:25梯度洗脫起步溶劑的確定:極性小于洗脫劑,一般為洗脫劑中極性小組分的2倍例:CHCL3:MeOH=10:1;5:1;2.5:1;1:1起步溶劑=20:1

梯度洗脫起步溶劑的確定:26檢測(cè)時(shí),點(diǎn)樣的物質(zhì)有:待分離物質(zhì)(總樣);標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(對(duì)照品);柱洗脫下來的各個(gè)流分檢測(cè)時(shí),點(diǎn)樣的物質(zhì)有:27溶劑的重復(fù)使用：a．若洗脫液為單一溶媒，則采用蒸餾法回收溶媒后，進(jìn)行循環(huán)使用。b．若洗脫液為混合溶媒，應(yīng)先回收溶媒，再進(jìn)行調(diào)節(jié)密度。如；三元系統(tǒng)的洗脫溶媒CHCI3—MeOH—H2O=6：4：2，新配制時(shí)d=1.064,回收溶媒后，用MeOH、H2O調(diào)節(jié)密度，再用TLC檢查，與原斑點(diǎn)Rf值相同即可。溶劑的重復(fù)使用：28吸附劑的再生用過的吸附劑經(jīng)適當(dāng)方法處理后，可以重復(fù)使用。

A．氧化鋁色譜分離后，除去氧化鋁柱上端含聚合物及帶有深顏色的氧化鋁，用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用、。為了使吸附在氧化鋁表面的有機(jī)物分解，高溫活化時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)?；罨?，氧化鋁的顏色比使用后的稍淡，一般來說，氧化鋁可重復(fù)使用多次，重復(fù)次數(shù)隨色譜過程中有機(jī)物污染的程度而定。

吸附劑的再生29B．硅膠由于硅膠對(duì)雜質(zhì)及色素吸附力差，因此回收操作比氧化鋁簡(jiǎn)單。一般可用乙醇或甲醇洗滌，或于索氏提取器中連續(xù)抽提除去雜質(zhì)，洗凈的硅膠待溶劑揮發(fā)除去后，烘干活化處理即可使用。硅膠的再生也可用5—10倍體積，質(zhì)量濃度為1％的氫氧化鈉煮沸0.5h如仍不呈強(qiáng)堿性(以酚酞作指示劑)，可追加適量質(zhì)量濃度為1％的氫氧化鈉，趁熱過濾，以蒸餾水洗3次，再以36倍5％鹽酸煮沸0.5h，以蒸餾水洗至中性，120℃活化，過篩即得。

B．硅膠30C．聚酰胺用過的聚酰胺粉，一般用5％氫氧化鈉洗滌，洗到氫氧化鈉液顏色極淡為止。有時(shí)因某些鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時(shí)，可用質(zhì)量濃度為5％的氫氧化鈉在柱中浸泡。每天將柱中的氫氧化鈉液放出一次，并加入新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本洗完。然后用蒸餾水洗至pH8～9，再以2倍量10％醋酸洗，最后以蒸餾水洗至中性，即可重復(fù)使用。

D．活性炭用過的活性炭可以用酸堿處理回收。因活性炭來源較易，價(jià)格便宜，一般不回收使用。C．聚酰胺31薄層色譜法

優(yōu)點(diǎn)：①所使用的固定相是一次性的，因此樣品的預(yù)處理比較簡(jiǎn)單；②被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒有限制，應(yīng)用范圍廣③固定相特別是流動(dòng)相選擇范圍寬：有利于不同性質(zhì)化合物的分離；在同一薄層板上可根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測(cè)方法進(jìn)行定性或定量分析。④直觀性，且隨化學(xué)成分及顯色方法的不同，斑點(diǎn)顯色的顏色豐富多彩，有利鑒別。薄層色譜法32中藥化學(xué)第七單元色譜操作課件33中藥化學(xué)第七單元色譜操作課件34制板板類型:軟板----不含黏合劑硬板-----含黏合劑的前者系將吸附劑或載體直接在玻璃板上用干法涂成均勻的薄層，但軟板疏松，操作很不方便，目前很少使用。制備含黏合劑的硬板，必須先要制備固定相的勻漿，它是由吸附劑與黏合劑以一定的比例用水調(diào)和而成。由于固定相及黏合劑類型不同，性能也不相同，常用的黏合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉(CMC—Na)和某些聚合物如聚丙烯酸等。

制板35規(guī)格:薄層所用的玻璃板為2mm厚，除另有規(guī)定外，一般為5cm×20cm10cmX10cm10cm×20cm20cmX20cm

規(guī)格:36薄層板活化:步驟⑴晾干鋪好的薄層板應(yīng)先晾干，⑵活化溫度在105～110℃活化。⑶活化時(shí)間為0.5—1h，⑷保存保存于干燥器中備用。

注:有些薄層板鋪好后陰干即可使用，有些薄層板則需要保存在一定濕度下才能獲得較好的分離效果，如聚酰胺薄層板。

薄層板活化:37點(diǎn)樣

⑴樣品溶液的制備溶解樣品的溶劑，對(duì)點(diǎn)樣非常重要。盡量避免用水，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性溶劑，因?yàn)辄c(diǎn)樣后它們能迅速揮發(fā)，可減少色斑的擴(kuò)散。對(duì)水溶性樣品，采取先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。

⑵點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等而定。一般是數(shù)微克至幾十微克。在檢測(cè)器靈敏度足夠時(shí)，應(yīng)降低點(diǎn)樣量，以減少拖尾。

⑶點(diǎn)樣的量器為管口平整的點(diǎn)樣毛細(xì)管或平口的微量注射器。吸取一定量樣品溶液，輕輕接觸于薄層的點(diǎn)樣線上。當(dāng)溶液稀時(shí)，反復(fù)點(diǎn)幾次，每次點(diǎn)干后再點(diǎn)，溶劑應(yīng)迅速揮去，否則造成樣斑擴(kuò)散而影響分離效果。

⑷點(diǎn)樣原點(diǎn)面積原點(diǎn)面積擴(kuò)散直徑以不超過2—3mm為宜。各點(diǎn)距離為1～2cm。如在空氣中點(diǎn)樣以不超過10min為宜，以免吸附劑在空氣中吸濕而降低活度。點(diǎn)樣38

展開展開方式：上行展開下行展開雙向展開多次展開徑向展開連續(xù)展開展開39定位確定組分在薄層板上的位置。類型：

a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)

b.顯色定位(化學(xué)方法)

通用型顯色劑:專屬型顯色劑:C.生物檢測(cè)法定位40a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)對(duì)于那些對(duì)可見光有吸收的化合物，在自然光下就可以觀察到不同顏色的斑點(diǎn)；對(duì)于在可見光下不能顯色，但可吸收紫外光的化合物，在紫外燈下可顯示不同顏色的斑點(diǎn)；還有一些化合物吸收了較短波長(zhǎng)的光后會(huì)在色譜上顯出不同顏色的熒光斑點(diǎn)；對(duì)可見光、紫外光都不吸收，也沒有合適的顯色方法的化合物可以用熒光淬滅技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

光學(xué)檢測(cè)法具有使用方便、被檢出組分不被破壞的優(yōu)點(diǎn)。

a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)41b.顯色定位(化學(xué)方法)根據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)，噴灑適宜試劑(顯色劑)使之發(fā)生反應(yīng)生成有色物質(zhì)而顯色的方法稱為顯色法。顯色劑有通用型和專屬型兩種。

通用型顯色劑:碘使許多化合物顯色，如生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂苷等。多數(shù)情況下碘是一種非破壞性的顯色劑，它的最大特點(diǎn)是與物質(zhì)的反應(yīng)是可逆的，不會(huì)改變組分的性質(zhì)，當(dāng)?shù)馍A揮去后，斑點(diǎn)便于進(jìn)一步處理。

專屬型顯色劑:是指對(duì)某個(gè)或某一類官能團(tuán)顯色的試劑。由于化合物種類繁多，因此專屬性顯色劑也是很多的。例如茚三酮是氨基酸的專用顯色劑，對(duì)脂肪族伯胺也呈正反應(yīng)；羧酸可用酸堿指示劑作顯色劑，含酚羥基物質(zhì)可噴三氯化鐵—鐵氰化鉀試劑。各類化合物的顯色劑可在有關(guān)手冊(cè)中查閱。b.顯色定位(化學(xué)方法)42

C.生物檢測(cè)法具有某些生物活性的物質(zhì)，可以采用生物實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行專屬性檢測(cè)。把含有某種特定細(xì)菌的凝膠混懸液倒在展開后的薄層上，在適當(dāng)溫度培養(yǎng)一段時(shí)間，可以用此方法檢測(cè)出某些具有抑菌或殺菌作用的活性物質(zhì)。檢測(cè)不同的化合物可以采用不同的細(xì)菌，例如檢測(cè)青霉素可用金球菌，檢測(cè)四環(huán)素可用干草桿菌等。除了抗生素以外，其他一些有生理活性的物質(zhì)，例如有溶血作用的化合物(如皂苷)也可以利用類似的方法檢出。將血液—明膠混懸液倒在薄層表面上，如果有溶血物質(zhì)存在，過一定時(shí)間可以明顯地看到透明的、幾乎無色的斑點(diǎn)，背景為渾濁的紅色。C.生物檢測(cè)法43

顯色方式蒸氣顯色噴霧顯色浸漬顯色加熱顯色

顯色方式44定性分析：保留值①比移值Rf②相對(duì)比移值板上化學(xué)反應(yīng)板上光譜圖色譜與其它技術(shù)聯(lián)用

定性分析：45保留值定性①比移值（Rf）比移值Rf是溶質(zhì)移動(dòng)距離和展開劑移動(dòng)距離之比，是薄層色譜的基本定性參數(shù)。它說明組分在色譜系統(tǒng)中的保流行為?？捎梅秶?.2一0.8最佳范圍：0.3～0.6

保留值定性46②相對(duì)比移值（Rr）是被分離組分a和參考物質(zhì)s在同一薄層板上、同一展開條件下的Rf值之比。由于參考物質(zhì)的Rf或移動(dòng)距離可大于或小于被分離組分的Rf值或移動(dòng)距離。因此，Rr值可大于或小于1。Rr值的重復(fù)性和可比性都優(yōu)于Rf。相對(duì)比移值以下式表示：Rr=Rf(a)/Rf(s)

②相對(duì)比移值（Rr）47薄層色譜定性分析的依據(jù)是：在固定的色譜條件下，相同物質(zhì)的Rf值相同。利用定性參數(shù)進(jìn)行定性鑒別的方法適用于已知范圍的未知物。對(duì)照方法：已知物對(duì)照法文獻(xiàn)法薄層色譜定性分析的依據(jù)是：48已知物對(duì)照法：即將樣品和已知物對(duì)照品在同一薄層板上展開，比較組分與對(duì)照品Rf值：如果二者的值不同，則組分與對(duì)照品不是同一物質(zhì)；如果二者的值相同，也不能輕易肯定就是同一物質(zhì)，必須用幾種性質(zhì)不同的展開劑或性質(zhì)不同的吸附劑展開，若二者Rf值都一致，同時(shí)又對(duì)多種顯色劑有相同的反應(yīng)，這時(shí)說組分與對(duì)照品為同一物質(zhì)才比較可靠。已知物對(duì)照法：49文獻(xiàn)法：

也可利用文獻(xiàn)的Rf值進(jìn)行定性鑒別，但是由于薄層色譜的實(shí)驗(yàn)條件很難與文獻(xiàn)完全一致，因此，最好采用相對(duì)比移值進(jìn)行定性鑒別。文獻(xiàn)法：50定量分析洗脫測(cè)定法直接測(cè)定法

A．目視比較法B．薄層掃描法

定量分析51洗脫測(cè)定法

樣品經(jīng)薄層色譜分離后，用適當(dāng)?shù)娜軇唿c(diǎn)中的組分洗脫下來，再用適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)定的方法稱為洗脫測(cè)定法。關(guān)鍵：洗脫劑的選擇，所選擇的洗脫劑必須能定量地將待測(cè)組分全部洗下；此外，不能將對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響的微量干擾物質(zhì)同時(shí)洗脫下來：洗脫測(cè)定法52例如在進(jìn)行小蔓長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春胺的測(cè)定時(shí)，若用乙醇作為洗脫劑，有微量葉綠素干擾測(cè)定；當(dāng)改用0.1mol／L鹽酸溶液作為洗脫劑時(shí)，長(zhǎng)春胺可以定量洗脫，而葉綠素則不溶于稀酸而留在吸附劑上。例如在進(jìn)行小蔓長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春胺的測(cè)定時(shí)，若用乙醇作為洗脫劑，有53測(cè)定方法：紫外分光光度法顯色劑比色法熒光分光光度法電化學(xué)方法測(cè)定方法：54直接測(cè)定法

A．目視比較法

樣品經(jīng)薄層色譜分離后，可在薄層板上對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行直接測(cè)定。最簡(jiǎn)易的方法是目視比較法。將一系列已知濃度的對(duì)照品溶液與樣品溶液點(diǎn)在同一薄層板上，展開并顯色后，以目視法直接比較樣品斑點(diǎn)與對(duì)照品斑點(diǎn)的顏色深度或面積大小，也可用測(cè)面儀直接測(cè)定斑點(diǎn)的面積。在嚴(yán)格控制色譜條件的情況下，斑點(diǎn)的顏色深度或面積隨溶液濃度(或點(diǎn)樣量)而變化，由此測(cè)出樣品的近似含量或含量范圍。

本法常用于半定量分析或限度檢查。

直接測(cè)定法55B．薄層掃描法

薄層掃描法與洗脫測(cè)定法相比，后者操作麻煩，測(cè)定誤差大，而前者快速簡(jiǎn)便，測(cè)定誤差較小。因此，自20世紀(jì)70年代我國(guó)引進(jìn)薄層色譜掃描儀后，薄層定量工作迅速發(fā)展。目前用薄層掃描法直接定量已成為薄層色譜的主要定量方法。薄層掃描法是以一定波長(zhǎng)的光照射展開后的薄層色譜板，測(cè)定其對(duì)光的吸收或所發(fā)出的熒光進(jìn)行定量分析的方法。薄層掃描法一般可分為吸收掃描法和熒光掃描法B．薄層掃描法56第八單元色譜操作第八單元色譜操作57色譜分離條件的選擇

色譜分離條件的選擇58吸附色譜的操作技術(shù)操作形式：吸附薄層色譜吸附柱色譜

吸附色譜的操作技術(shù)59柱色譜法經(jīng)典的柱色譜法是將作為固定相的吸附劑裝在一根玻管柱中(柱長(zhǎng)一般從幾十厘米到上百厘米不等)，從管頂加入樣品溶液，再從管頂加人流動(dòng)相。使流動(dòng)相從上往下流過而使各種成分分離并依次流出色譜柱的過程稱為洗脫。在洗脫時(shí)，可在柱的下端依次收集洗脫液并進(jìn)行檢查，每一份洗脫液從幾毫升到幾十毫升甚至幾百毫升不等。整個(gè)分離過程需幾小時(shí)甚至幾天才能完成。經(jīng)典柱色譜法主要用于分離和精制較大量的樣品，通常適用于幾十毫克到幾十克樣品的分離。近幾十年來飛速發(fā)展的高效液相色譜法采用遠(yuǎn)小于經(jīng)典色譜法的色譜柱(柱長(zhǎng)5—30cm，柱內(nèi)徑0.2—4.0cm)，較細(xì)的固定相(粒徑5～10μm)，用高壓泵輸送流動(dòng)相，具有分離性能好、分析速度快、流出組分容易收集、可以在線檢測(cè)和儀器化等經(jīng)典色譜法所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。柱色譜法60色譜柱的選擇色譜柱的內(nèi)徑與柱長(zhǎng)的比例一般在1：10～1：20(30)之間。有時(shí)為了獲得好的分離效果，可采用細(xì)長(zhǎng)的色譜柱；有時(shí)為了從溶液中吸去某種成分、濾去不溶物以及在利用活性炭脫色時(shí)為濾去細(xì)微的活性炭顆?；蛉艄枘z的顆粒較細(xì)，而粒度分布范圍窄，則可采用短柱(1：5)，這樣不僅增大了截面積，而且也增加了樣品的載量。有的色譜柱下端有活塞,有的有塞板。色譜柱的選擇61

裝柱

A．干法裝柱。直接用小漏斗將吸附劑均勻裝入柱內(nèi)的方法。

B．濕法裝柱。將吸附劑裝入盛有洗脫液的柱內(nèi)，或?qū)⑽絼┡c洗脫液混合成混懸液再裝入柱中。

C．操作要點(diǎn)裝柱前柱底要墊一層脫脂棉、玻璃纖維或塞板以防吸附劑外漏。干法裝柱時(shí)要用橡皮槌輕輕敲打色譜柱，使吸附劑裝填連續(xù)均勻、緊密，然后用洗脫劑洗脫并保持一定液面；濕法裝柱時(shí)注意打開下端活塞，洗脫劑應(yīng)始終保持一定的液面高度，為了增強(qiáng)分離效果，提高分離速度，可在柱面覆蓋一層處理干凈的均勻的細(xì)沙（石英沙、粗硅膠）。

裝柱62根據(jù)所采用吸附劑的不同，裝柱方法略有不同：

氧化鋁一般先準(zhǔn)確量取一定體積的溶劑(Vo)，將色譜柱的活塞稍打開，將溶劑滴人接受器中，同時(shí)將氧化鋁慢慢地加入，保持邊沉降邊添加的狀態(tài)，直至加完。氧化鋁加入速度不宜太快，否則將帶人空氣泡。必要時(shí)可以在色譜管外輕輕敲打振動(dòng)，使氧化鋁均勻下降，并有助于趕走氣泡。當(dāng)采用活性較高的氧化鋁進(jìn)行色譜時(shí)，更應(yīng)注意。待氧化鋁加完后，仍使溶劑流動(dòng)一定時(shí)間，然后將氧化鋁上面的溶劑全部滴人接受器，準(zhǔn)確量取接受器內(nèi)的溶劑量(V1)。從Vo—V1之差，就可以知道氧化鋁內(nèi)包含的溶劑體積。這樣在色譜過程中，就可以掌握大致在什么時(shí)候開始收集流出組分；當(dāng)變換溶劑的時(shí)候，就可以知道新?lián)Q溶劑大致在哪一流分開始。根據(jù)所采用吸附劑的不同，裝柱方法略有不同：

氧化鋁63硅膠由于硅膠多為多孔性物質(zhì)，一般用濕法，即將硅膠混懸于裝柱溶劑中，不斷攪拌，待內(nèi)中空氣泡除去后，連同溶劑一起傾人層析柱中，最好一次傾人，否則由于不同粒度大小的硅膠沉降速度不一，使硅膠柱有明顯的分段現(xiàn)象，影響分離效果。另亦可采用干法裝柱，將所需硅膠一次傾人柱中，然后蹾緊至硅膠高度不改變?yōu)橹埂．?dāng)采用分配層析時(shí)，應(yīng)先將預(yù)先選定的固定相溶劑如水、緩沖液或極性溶劑加入硅膠中，一般比例為1：0.5—1較為適中，攪拌混合均勻，傾人預(yù)先選定的移動(dòng)相溶劑中并激烈攪拌，使兩相互相飽和達(dá)到平衡．層析管中事先放人用固定相溶劑劇裂振搖飽和后的移動(dòng)相，將上述吸著固定相的硅膠按濕法裝柱，不斷輕敲管壁，使均勻緊密．另外亦可采用加硅膠于固定相飽和的移動(dòng)相中，按濕法裝柱，然后用固定相飽和的流動(dòng)相通過硅膠柱，使達(dá)到層析時(shí)穩(wěn)定的平衡條件．硅膠64活性炭因活性炭在水中的吸附力最強(qiáng)，一般在水中裝柱。色譜柱內(nèi)先加少量蒸餾水，再以玻璃纖維塞住底部，并除去玻璃纖維中的氣泡?；钚蕴恳哉麴s水浸泡1h左右，不斷攪拌除去氣泡。然后倒人柱中，讓其自然沉降，裝至所需體積，備用。粉末活性炭因流速太慢，需與硅藻土(1：1)混合后，再用蒸餾水調(diào)成糊狀裝柱。并且待樣品上柱后，在色譜管頂端連一有自動(dòng)控制的加壓泵或在色譜管下端連一減壓泵進(jìn)行色譜。活性炭65聚酰胺預(yù)處理：取聚酰胺粉以90％一95％乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入色譜柱中。用3—4倍體積的90％一95％乙醇洗滌，洗至洗液透明并在蒸干后無殘?jiān)?或極少殘?jiān)?。再依次用2—2.5倍體積，質(zhì)量濃度為5％的NaOH水溶液、1倍體積的蒸餾水、2—2.5倍體積的10％醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。裝柱：若用含水溶劑系統(tǒng)洗脫，常以水裝柱，方法同活性炭的裝柱。若用非極性溶劑系統(tǒng)洗脫時(shí)，常以溶劑組分中極性低的組分裝柱。若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面，加樣時(shí)應(yīng)將柱底端的氯仿層放出并立即加樣，加樣后頂端用棉花塞緊。在色譜柱關(guān)閉時(shí)，應(yīng)將頂端多余的氯仿液放出，否則，聚酰胺會(huì)浮起而攪亂層帶。聚酰胺66加樣樣品上柱可采取二種方式：濕法干法加樣67濕法

如樣品能溶于移動(dòng)相可用少量移動(dòng)相溶解，制成體積小、濃度高的溶液，盡可能保留加樣色帶狹窄，輕輕注入已準(zhǔn)備好的色譜柱上，上樣時(shí)注意沿著柱內(nèi)壁慢慢加入，始終保持吸附劑上端表面平整，勿使色譜柱面受到擾動(dòng)，否則將影響色譜效果。濕法68干法如果樣品難溶于移動(dòng)相或不易溶于開始色譜使用的有機(jī)溶劑，那么先將樣品溶于易溶的、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，以少量的吸附劑拌勻，然后將有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，加適量的移動(dòng)相拌勻再上柱，再按上述裝柱法裝柱，將帶有樣品的吸附劑加在色譜柱中的吸附劑上面。并在上面覆蓋一薄層純凈的砂，然后用移動(dòng)相展開．干法69上樣量一般為上樣量：吸附劑=1：60～1：30氧化鋁的樣品量一般為1：20～50，根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)而定。氧化鋁對(duì)萜烯、倍半萜烯等的吸附力較弱，這時(shí)氧化鋁用量可增至樣品量的100—200倍，而且為了盡量減少這類化合物在色譜柱中的擴(kuò)散，色譜過程不能有間歇。硅膠色譜樣品量，一般為1：30～1：60，若作為分配層析比例應(yīng)加大，主要根據(jù)分離物質(zhì)的難易采確定．較難分離者有時(shí)甚至可選1：500～1：1000。聚酰胺色譜樣品量一般每100m1聚酰胺可上樣1.5—2.5g，實(shí)際上其比例視具體情況而定．樣品先用洗脫溶劑溶解，濃度約20—30%。若不溶解于洗脫劑，可選用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑溶解，拌入干粉中后將溶劑減壓蒸去，濕法裝入柱頂．上樣量70洗脫洗脫方式：等強(qiáng)度（isocratic）梯度（gradient）

洗脫71等強(qiáng)度洗脫：在同一洗脫周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目少、性質(zhì)差別不大的樣品。

等強(qiáng)度洗脫：72梯度洗脫：同一洗脫周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等。分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜樣品時(shí)須采用梯度洗脫技術(shù)，使所有組分都在適宜條件下獲得分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度；但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫：73梯度洗脫曲線類型：兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程序進(jìn)行混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度凹形梯度凸形梯度階梯形梯度梯度洗脫曲線類型：74線性梯度最為常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫；如果用等強(qiáng)度洗脫獲得的色譜圖前段峰重疊，后段峰分開且保留時(shí)間太長(zhǎng)，可以適當(dāng)降低起始溶劑的強(qiáng)度后，采用凹形梯度洗脫，梯度起始階段溶劑強(qiáng)度低，使分離度增大，而末尾階段溶劑強(qiáng)度迅速增加，使組分快速洗脫出柱；也可降低起始溶劑的強(qiáng)度后，采用快速線性梯度洗脫；或者采用階梯式梯度洗脫。總之，應(yīng)該根據(jù)樣品的實(shí)際情況，選擇適宜的梯度曲線、梯度速度和時(shí)間、梯度起始和結(jié)束的溶劑組成。線性梯度最為常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗75由薄層色譜摸索柱色譜條件分離條件最佳與可用范圍的k值表k=0.4,Rf=0.7k=4.0,Rf=0.2色譜類型參數(shù)最佳范圍可用范圍HPLCk2~51~10TLCk0.4~40.1~9GCk~20.2~20由薄層色譜摸索柱色譜條件色譜類型參數(shù)76注意：洗脫時(shí)要盡量避免使用下列溶劑：A．醇類、乙酸乙酯，如樣品中含酯類易發(fā)生酯交換。B．丙酮與硅膠作用C．甲酸、吡啶，溶解固定相注意：77

流速：過快不能達(dá)到平衡過慢色帶擴(kuò)散

最佳流速：1V0/0.5~1h

V0=流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)所占體積一般為上柱硅膠量的1.5倍;松的為2倍，緊的為1.2倍流速：78

流份收集體積：

過小—增加工作量過大—人為混合一般流份體積:1流份=V01/10流份收集體積：79

預(yù)測(cè)被分離物質(zhì)的洗脫體積

V保=V0

/Rf

式:

V0=流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)所占體積V保=保留體積(被分離物質(zhì)的洗脫體積)

若Rf=0.1,則V保=10V0

若Rf=0.2,則V保=5V0若Rf=0.3,則V保=3.3V0

預(yù)測(cè)被分離物質(zhì)的洗脫體積80一般連續(xù)洗脫(柱色譜)的條件:以TLC的Rf=0.1~0.3條件為佳先用單一溶劑,若Rf值過大,則降低溶劑極性若Rf值過小,則增加溶劑極性若單一溶劑不能使Rf值=0.1~0.3,則用混合溶劑一種溶劑Rf=0另一種溶劑Rf=1混合使Rf=0.1~0.3.若斑點(diǎn)較多,則選適當(dāng)溶劑,使第一斑點(diǎn)展出,而其它斑點(diǎn)留在原點(diǎn)。一般連續(xù)洗脫(柱色譜)的條件:81梯度洗脫起步溶劑的確定:極性小于洗脫劑,一般為洗脫劑中極性小組分的2倍例:CHCL3:MeOH=10:1;5:1;2.5:1;1:1起步溶劑=20:1

梯度洗脫起步溶劑的確定:82檢測(cè)時(shí),點(diǎn)樣的物質(zhì)有:待分離物質(zhì)(總樣);標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(對(duì)照品);柱洗脫下來的各個(gè)流分檢測(cè)時(shí),點(diǎn)樣的物質(zhì)有:83溶劑的重復(fù)使用：a．若洗脫液為單一溶媒，則采用蒸餾法回收溶媒后，進(jìn)行循環(huán)使用。b．若洗脫液為混合溶媒，應(yīng)先回收溶媒，再進(jìn)行調(diào)節(jié)密度。如；三元系統(tǒng)的洗脫溶媒CHCI3—MeOH—H2O=6：4：2，新配制時(shí)d=1.064,回收溶媒后，用MeOH、H2O調(diào)節(jié)密度，再用TLC檢查，與原斑點(diǎn)Rf值相同即可。溶劑的重復(fù)使用：84吸附劑的再生用過的吸附劑經(jīng)適當(dāng)方法處理后，可以重復(fù)使用。

A．氧化鋁色譜分離后，除去氧化鋁柱上端含聚合物及帶有深顏色的氧化鋁，用甲醇、稀醋酸、氫氧化鈉溶液及水洗滌，再經(jīng)高溫活化后，可重復(fù)使用、。為了使吸附在氧化鋁表面的有機(jī)物分解，高溫活化時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)?；罨?，氧化鋁的顏色比使用后的稍淡，一般來說，氧化鋁可重復(fù)使用多次，重復(fù)次數(shù)隨色譜過程中有機(jī)物污染的程度而定。

吸附劑的再生85B．硅膠由于硅膠對(duì)雜質(zhì)及色素吸附力差，因此回收操作比氧化鋁簡(jiǎn)單。一般可用乙醇或甲醇洗滌，或于索氏提取器中連續(xù)抽提除去雜質(zhì)，洗凈的硅膠待溶劑揮發(fā)除去后，烘干活化處理即可使用。硅膠的再生也可用5—10倍體積，質(zhì)量濃度為1％的氫氧化鈉煮沸0.5h如仍不呈強(qiáng)堿性(以酚酞作指示劑)，可追加適量質(zhì)量濃度為1％的氫氧化鈉，趁熱過濾，以蒸餾水洗3次，再以36倍5％鹽酸煮沸0.5h，以蒸餾水洗至中性，120℃活化，過篩即得。

B．硅膠86C．聚酰胺用過的聚酰胺粉，一般用5％氫氧化鈉洗滌，洗到氫氧化鈉液顏色極淡為止。有時(shí)因某些鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時(shí)，可用質(zhì)量濃度為5％的氫氧化鈉在柱中浸泡。每天將柱中的氫氧化鈉液放出一次，并加入新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本洗完。然后用蒸餾水洗至pH8～9，再以2倍量10％醋酸洗，最后以蒸餾水洗至中性，即可重復(fù)使用。

D．活性炭用過的活性炭可以用酸堿處理回收。因活性炭來源較易，價(jià)格便宜，一般不回收使用。C．聚酰胺87薄層色譜法

優(yōu)點(diǎn)：①所使用的固定相是一次性的，因此樣品的預(yù)處理比較簡(jiǎn)單；②被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒有限制，應(yīng)用范圍廣③固定相特別是流動(dòng)相選擇范圍寬：有利于不同性質(zhì)化合物的分離；在同一薄層板上可根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測(cè)方法進(jìn)行定性或定量分析。④直觀性，且隨化學(xué)成分及顯色方法的不同，斑點(diǎn)顯色的顏色豐富多彩，有利鑒別。薄層色譜法88中藥化學(xué)第七單元色譜操作課件89中藥化學(xué)第七單元色譜操作課件90制板板類型:軟板----不含黏合劑硬板-----含黏合劑的前者系將吸附劑或載體直接在玻璃板上用干法涂成均勻的薄層，但軟板疏松，操作很不方便，目前很少使用。制備含黏合劑的硬板，必須先要制備固定相的勻漿，它是由吸附劑與黏合劑以一定的比例用水調(diào)和而成。由于固定相及黏合劑類型不同，性能也不相同，常用的黏合劑有煅石膏、羧甲基纖維素鈉(CMC—Na)和某些聚合物如聚丙烯酸等。

制板91規(guī)格:薄層所用的玻璃板為2mm厚，除另有規(guī)定外，一般為5cm×20cm10cmX10cm10cm×20cm20cmX20cm

規(guī)格:92薄層板活化:步驟⑴晾干鋪好的薄層板應(yīng)先晾干，⑵活化溫度在105～110℃活化。⑶活化時(shí)間為0.5—1h，⑷保存保存于干燥器中備用。

注:有些薄層板鋪好后陰干即可使用，有些薄層板則需要保存在一定濕度下才能獲得較好的分離效果，如聚酰胺薄層板。

薄層板活化:93點(diǎn)樣

⑴樣品溶液的制備溶解樣品的溶劑，對(duì)點(diǎn)樣非常重要。盡量避免用水，因?yàn)樗芤喊唿c(diǎn)容易擴(kuò)散，且不易揮發(fā)。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發(fā)性溶劑，因?yàn)辄c(diǎn)樣后它們能迅速揮發(fā)，可減少色斑的擴(kuò)散。對(duì)水溶性樣品，采取先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。

⑵點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量多少視薄層的性能及顯色劑的靈敏度等而定。一般是數(shù)微克至幾十微克。在檢測(cè)器靈敏度足夠時(shí)，應(yīng)降低點(diǎn)樣量，以減少拖尾。

⑶點(diǎn)樣的量器為管口平整的點(diǎn)樣毛細(xì)管或平口的微量注射器。吸取一定量樣品溶液，輕輕接觸于薄層的點(diǎn)樣線上。當(dāng)溶液稀時(shí)，反復(fù)點(diǎn)幾次，每次點(diǎn)干后再點(diǎn)，溶劑應(yīng)迅速揮去，否則造成樣斑擴(kuò)散而影響分離效果。

⑷點(diǎn)樣原點(diǎn)面積原點(diǎn)面積擴(kuò)散直徑以不超過2—3mm為宜。各點(diǎn)距離為1～2cm。如在空氣中點(diǎn)樣以不超過10min為宜，以免吸附劑在空氣中吸濕而降低活度。點(diǎn)樣94

展開展開方式：上行展開下行展開雙向展開多次展開徑向展開連續(xù)展開展開95定位確定組分在薄層板上的位置。類型：

a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)

b.顯色定位(化學(xué)方法)

通用型顯色劑:專屬型顯色劑:C.生物檢測(cè)法定位96a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)對(duì)于那些對(duì)可見光有吸收的化合物，在自然光下就可以觀察到不同顏色的斑點(diǎn)；對(duì)于在可見光下不能顯色，但可吸收紫外光的化合物，在紫外燈下可顯示不同顏色的斑點(diǎn)；還有一些化合物吸收了較短波長(zhǎng)的光后會(huì)在色譜上顯出不同顏色的熒光斑點(diǎn)；對(duì)可見光、紫外光都不吸收，也沒有合適的顯色方法的化合物可以用熒光淬滅技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

光學(xué)檢測(cè)法具有使用方便、被檢出組分不被破壞的優(yōu)點(diǎn)。

a.光學(xué)檢測(cè)(物理方法)97b.顯色定位(化學(xué)方法)根據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)，噴灑適宜試劑(顯色劑)使之發(fā)生反應(yīng)生成有色物質(zhì)而顯色的方法稱為顯色法。顯色劑有通用型和專屬型兩種。

通用型顯色劑:碘使許多化合物顯色，如生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂苷等。多數(shù)情況下碘是一種非破壞性的顯色劑，它的最大特點(diǎn)是與物質(zhì)的反應(yīng)是可逆的，不會(huì)改變組分的性質(zhì)，當(dāng)?shù)馍A揮去后，斑點(diǎn)便于進(jìn)一步處理。

專屬型顯色劑:是指對(duì)某個(gè)或某一類官能團(tuán)顯色的試劑。由于化合物種類繁多，因此專屬性顯色劑也是很多的。例如茚三酮是氨基酸的專用顯色劑，對(duì)脂肪族伯胺也呈正反應(yīng)；羧酸可用酸堿指示劑作顯色劑，含酚羥基物質(zhì)可噴三氯化鐵—鐵氰化鉀試劑。各類化合物的顯色劑可在有關(guān)手冊(cè)中查閱。b.顯色定位(化學(xué)方法)98

C.生物檢測(cè)法具有某些生物活性的物質(zhì)，可以采用生物實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行專屬性檢測(cè)。把含有某種特定細(xì)菌的凝膠混懸液倒在展開后的薄層上，在適當(dāng)溫度培養(yǎng)一段時(shí)間，可以用此方法檢