第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件

生化分離工程第四章細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)生化分離工程第四章細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)1破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（還原型）酶抑制劑：針對(duì)性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過(guò)程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸2細(xì)胞破碎（Celldisruption）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)動(dòng)物/植物和微生物：前者沒(méi)有細(xì)胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細(xì)胞膜，易于破碎細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比陰性菌的細(xì)胞壁堅(jiān)固Why？較難破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽(yáng)性菌的胞壁厚細(xì)胞破碎（Celldisruption）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)3G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分：細(xì)胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無(wú)約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，其中葡聚糖主要維持細(xì)胞壁強(qiáng)度G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%細(xì)胞壁組成G+G44.1細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的：使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物機(jī)械法非機(jī)械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細(xì)胞破碎4.1細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的：使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同51、機(jī)械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達(dá)到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機(jī)增加裝珠量、延長(zhǎng)破碎時(shí)間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細(xì)胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅(jiān)硬（亞細(xì)胞器）的微生物細(xì)胞1、機(jī)械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細(xì)62）高壓勻漿法

（high-pressurehomogenization）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過(guò)針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速?zèng)_撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎對(duì)易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器一般不適用2）高壓勻漿法

（high-pressurehomoge73）超聲波破碎（ultrasonication）機(jī)理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點(diǎn)：A、影響因素多，細(xì)胞種類、濃度和處理時(shí)間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。3）超聲波破碎（ultrasonication）機(jī)理：高于28機(jī)械破碎法總結(jié)以上幾種機(jī)械破碎法的作用機(jī)理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細(xì)胞、細(xì)胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室適用對(duì)象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細(xì)菌細(xì)菌機(jī)械破碎法總結(jié)以上幾種機(jī)械破碎法的作用機(jī)理不盡相同，有各自的92、細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細(xì)胞破碎方法，適用于易于破碎的細(xì)胞，eg.動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。細(xì)胞于高滲介質(zhì)中？脫水達(dá)到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進(jìn)入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細(xì)胞破壞，對(duì)于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效2、細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticsho103、化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機(jī)溶劑都可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來(lái)→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機(jī)溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價(jià)格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機(jī)械破碎速度低、效率差，常需與機(jī)械法連用。3、化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分利114、生物法破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細(xì)胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細(xì)胞需用不同的酶：酵母細(xì)胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對(duì)溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細(xì)胞碎片等，不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶4、生物法破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁124、生物法破碎自溶：通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制4、生物法破碎自溶：通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑等激活劑135、超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動(dòng)性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。突然降壓后，因細(xì)胞內(nèi)外較大的壓差使細(xì)胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞如酵母甚至對(duì)粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果5、超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上14破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法破碎過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)B、對(duì)下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過(guò)程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題154.2BuffersWhatisbuffer？Whyusebuffer？pH=pKa±0.5時(shí)，作為buffer，其緩沖能力最強(qiáng)補(bǔ)充14.2BuffersWhatisbuffer？pH=16磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpurposes,pKa2isofgreatestinterest－Why？磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpu17Howtomakingabuffer？溶液：1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4、pH7.5緩沖液含1mmol/LEDTA0.15mol/LNaCl2mol/L尿素3mmol/LGSH和0.6mmol/LGSSG1LHowtomakingabuffer？溶液：18方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：600mL1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）與400mL1/15mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4）混勻?！?L1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液、pH7.5bufferA另取一燒杯，分別稱取1mmolEDTA；0.15molNaCl；2mol尿素；3mmolGSH和0.6mmolGSSG用bufferA溶解并定容至1L方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：6019方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.0）：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與29.2mL0.1mol/L鹽酸混勻后，用去離子水定容至100mL?！皒”mlsolutionofA＋

“y”mlsolutionofBWhy?ThepresenceofextrasaltsmaychangethepHormolarityofthebufferduetocommonioneffectsInvolvesextrawork（makinguptwosolutions）Waste（TheunusedvolumesofAandBarediscarded）Usuallyinaccurate缺點(diǎn)方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.20第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件21方案2Choosethebuffer（withapKaascloseaspossibletothedesiredpH）Indentifywhetherthebufferismadefromanacidorabase（buffer由哪種酸或堿構(gòu)成？）Choosethespeciesthatgivesno-productswhentitrated（選擇一種，使得其用HCl或NaOH滴定時(shí)無(wú)副產(chǎn)物出現(xiàn)）Calculatethemassrequiredtogivetherequiredmolarity計(jì)算并稱量配制溶液所需的質(zhì)量Addallcomponents,titratetothepHandmakeupthevolume（加入所有其它組分，用HCl或NaOH調(diào)至所需pH并定容）pH計(jì)工作原理及使用注意事項(xiàng)描述緩沖液的兩個(gè)指標(biāo)：緩沖液的摩爾濃度緩沖液pH方案2Choosethebuffer（withapK22小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預(yù)期pH（pH±0.5）溫度改變、溶液稀釋及添加中性鹽的情況下，緩沖液pH變化盡可能小緩沖物質(zhì)不與實(shí)驗(yàn)中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，不干擾實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)（eg.硼酸鹽/糖蛋白，280nm處有光吸收）一般常用的緩沖液都有現(xiàn)成的配方，可查閱相關(guān)參考書利用特定的緩沖液計(jì)算軟件或者網(wǎng)上緩沖液計(jì)算軟件：http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預(yù)期pH（pH±0.5）一般常23第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件24第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件254.3AssaysforactivityandconcentrationMostproteinshavesomeformofuniquefunctionalactivity（具有一種活性）,whichdefinesthespecificprotein.Beforetheproteincanbeisolated,itisnecessarytoconceiveof(確定)anactivityandtodevise（設(shè)計(jì)）anappropriateassay.補(bǔ)充2Theactivityassayshouldbe:specific,

todefinetheproteinofinterestanddistinguishitfromallothersquantitative,

sothatthesuccessofthepurificationcanbemonitored

economical

intermsoftimeandmaterial.4.3Assaysforactivityandco26干擾素含量測(cè)定（MTT法生物學(xué)活性測(cè)定）

原理：干擾素能刺激某些指示細(xì)胞(如人羊膜上皮細(xì)胞Wish株、人喉癌細(xì)胞株Hep-2等)產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細(xì)胞免受水皰性口炎病毒(VSV)的攻擊，根據(jù)待測(cè)樣品不同稀釋度的保護(hù)能力，計(jì)算出干擾素生物學(xué)活性單位。材料：

VSV、Wish細(xì)胞、MTT、二甲亞砜(DMSO)、10％FCS

RPMI1640、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、CO2孵箱、超凈臺(tái)、酶標(biāo)檢測(cè)儀?；钚远x：以保護(hù)半數(shù)(50％)Wish細(xì)胞免受病毒VSV損害的最高干擾素稀釋度為1個(gè)干擾素活性單位。干擾素含量測(cè)定（MTT法生物學(xué)活性測(cè)定）原理：干擾素能刺激27尿激酶活性測(cè)定尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物體內(nèi)，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。對(duì)合成底物的活性與胰蛋白酶和纖溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-賴氨酸甲酯。對(duì)血纖維蛋白、血纖維蛋白原等都有溶解作用，從而達(dá)到溶血栓、抗凝血作用，所以是一種十分有效的溶血?jiǎng)Ｔ谂R床上，尿激酶已廣泛應(yīng)用于治療各種新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。尿激酶活性測(cè)定尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原28尿激酶活性測(cè)定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在40-60oC迅速加入（牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液0.5mL，立即混勻，倒入平皿（直徑9cm），制成厚度約0.2cm的纖維膜。分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液及供試品液各10mL于膜上，蓋上蓋，于37oC培養(yǎng)箱保溫18h后取出，分別量出每個(gè)溶圈垂直的兩直徑。以溶圈直徑（平均）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線尿激酶活性測(cè)定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在29胰蛋白酶活性測(cè)定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI>酰胺鍵>肽鍵?？衫煤羞@些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn)稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡(jiǎn)稱BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱TAME）測(cè)定酯酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異。胰蛋白酶活性測(cè)定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基30ConcentrationassaysAnumberofmethodsareavailableformeasuringproteinconcentrationEachbeingbasedonaspecificpropertyofproteinsEachhavingcertainadvantagesanddisadvantages.ConcentrationassaysAnumbero311、AbsorptionofultravioletlightTheextinctioncoefficients(消光系數(shù))ofproteinsdifferUV-absorptionisusefulasaqualitative（定性）measure,fordetectingthepresenceofprotein（檢測(cè)蛋白質(zhì)是否存在）Butislessusefulforaccuratequantitativemeasurements（準(zhǔn)確定量測(cè)定）Exceptforpureproteinsofknownextinctioncoefficient.Becauseofitssimplicity,UVabsorptionisthemethodfavoredforcontinuous(semi-quantitative)monitoringoftheproteinconcentrationintheeluatefromchromatographycolumns.1、Absorptionofultravioletli32OneofthelimitationsofUV-absorbanceUV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的非蛋白質(zhì)物質(zhì)）mayinterferewith（干擾）themeasurement.Anelegantmethodforeliminatingtheabsorptionduetonucleicacids,thusallowingameasurementofproteinmustbetakenNucleicacids,whichareubiquitously（無(wú)所不在的）presentinbiologicalmaterial,absorbUVradiationstrongly,withaprofileoverlappingthatofprotein,butwithamaximumat260nm.OneofthelimitationsofUV-a332、ThebiuretassayInalkalinesolution,proteins（withpeptidebonds）reduceCu2+toCu+togiveabluecolouredcomplex.Becausethereactioniswithpeptidebonds,thereislittlevariationinthecolourintensitygivenbydifferentproteins（不同蛋白質(zhì)的光吸收強(qiáng)度差別不大）.Thebiuretmethodcanbeusedforthemeasurementofproteinconcentration2、ThebiuretassayInalkaline34Adisadvantageofthebiuretmethod：

Itisrelativelyinsensitive(靈敏度低),sothatlargeamountsofproteinarerequiredfortheassay（每次蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)所需蛋白質(zhì)量要很大）.Anotherlimitationisthataminobuffers,suchasTris,whicharecommonlyusedinthepHrange8-10,caninterferewiththereaction.Adisadvantageofthebiuretm353、TheLowryassayMaybeconsideredasanextensionofthebiuretassay.Initially,aCu+-proteincomplexisformed,asinthebiuretassay.Cu+（orprotein中Phe、Tyr）thenreducetheso-calledFolin-Ciocalteureagent(福林-酚試劑),toyieldanintensebluecolour.AnadvantageoftheLowryoverthebiuretassay：

muchmoresensitive,andthusconsumesmuchlessoftheproteinsample.Disadvantage：moresensitivetointerference對(duì)很多干擾試劑敏感,aconsequenceofthemorecomplicatedchemistryinvolved需要配置很多種復(fù)雜試劑.3、TheLowryassayMaybeconsid364、Thebicinchoninicacid(BCA)assayBicinchoninicacid（二喹啉甲酸）formsa2:1complexwithCu+formedinthebiuretreactionresultinginastable,highlycolouredchromophore（高吸收特性的生色團(tuán)）withanabsorbancemaximumat562nm.TheBCAassayismoresensitivethantheLowrymethodandisalsolesssubjecttointerferencebyanumberofcommonlyencounteredsubstances.Sensitivetointerferencebystrongreducingagents（強(qiáng)還原劑Why？）,e.g.ascorbicacid（抗壞血酸）.4、Thebicinchoninicacid(BCA)375、TheBradfordassay

thedye-bindingmethodCoomassieblueG-250,dissolvedinacidsolution（酸性溶液中）,belowpH1,isared-browncolour（紅褐色）regainsitscharacteristicbluecolourwhenitbecomesboundtoaprotein（與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后）.Theconcentrationofproteincanthereforebemeasuredbytheextenttowhichthebluecolour,measuredat595nm,isrestored.Advantages:Simplicity,sensitivityandresistancetointerference.5、TheBradfordassay

thedye-b385）TheBradfordassay

thedye-bindingmethodG-250bindslargelytobasicandaromaticaminoacids.Differentproteinswilldifferintheircontentoftheseaminoacidsandso,ideally,astandardcurveshouldbeelaboratedforeachspecificprotein.Disadvantage：thereagenttendstosticktoglassandplasticware塑料器材.Forthisreason,theuseofdisposablecuvettes一次性試管isrecommended.OrthedyecanberemovedfromsurfacesbyusingSDS.5）TheBradfordassay

thedye-b39蛋白質(zhì)分析作業(yè)若想分析破胞后所得粗酶液（或發(fā)酵液離心后上清液）的蛋白質(zhì)含量，可采用哪些分析方法？實(shí)驗(yàn)室在分離純化基因重組E.coli所表達(dá)的γ-干擾素含量時(shí)，當(dāng)分離的初級(jí)階段，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)建議采用哪種？當(dāng)進(jìn)行多步色譜法純化之后，電泳檢驗(yàn)為單一條帶，此時(shí)建議采用哪種蛋白質(zhì)分析方法來(lái)確定含量？蛋白質(zhì)含量的諸多分析方法中，哪種適用于混合蛋白質(zhì)含量的測(cè)定？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？哪種適用于純度較高的蛋白質(zhì)含量測(cè)定？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？蛋白質(zhì)分析作業(yè)若想分析破胞后所得粗酶液（或發(fā)酵液離心后上清液40生化分離工程第四章細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)生化分離工程第四章細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)41破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液（與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相似）抗氧化劑：含二硫鍵的蛋白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)：高度還原；外界氧化環(huán)境。eg.二硫蘇糖醇DTT，2-巰基乙醇2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（還原型）酶抑制劑：針對(duì)性添加，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、巰基蛋白酶抑制劑碘乙酸、金屬蛋白酶EDTA，etcPVP：植物組織的破碎過(guò)程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚類物質(zhì)（酚類物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀）破碎緩沖液一般為0.1-0.2mol/L，pH為7－8的磷酸42細(xì)胞破碎（Celldisruption）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)動(dòng)物/植物和微生物：前者沒(méi)有細(xì)胞壁，只有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的柔軟的細(xì)胞膜，易于破碎細(xì)菌：革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁比陰性菌的細(xì)胞壁堅(jiān)固Why？較難破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽(yáng)性菌的胞壁厚細(xì)胞破碎（Celldisruption）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)43G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同類型細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分：細(xì)胞壁組成G+G-肽聚糖60-95%10%磷壁酸有0類脂質(zhì)一般無(wú)約20%蛋白質(zhì)0較高酵母菌：由甘露聚糖、蛋白質(zhì)和葡聚糖組成的“三明治”結(jié)構(gòu)，其中葡聚糖主要維持細(xì)胞壁強(qiáng)度G+：典型金黃色葡萄球菌，肽聚糖60-95%細(xì)胞壁組成G+G444.1細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的：使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物機(jī)械法非機(jī)械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學(xué)法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細(xì)胞破碎4.1細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎的目的：使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同451、機(jī)械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細(xì)胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細(xì)胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細(xì)胞達(dá)到某種程度破碎，釋放內(nèi)含物可采用間歇式或連續(xù)操作珠磨機(jī)增加裝珠量、延長(zhǎng)破碎時(shí)間、提高轉(zhuǎn)速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數(shù)微生物細(xì)胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質(zhì)地堅(jiān)硬（亞細(xì)胞器）的微生物細(xì)胞1、機(jī)械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細(xì)462）高壓勻漿法

（high-pressurehomogenization）破碎原理：利用高壓使懸浮液通過(guò)針形閥，從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環(huán)境破碎作用力：突然減壓和高速?zèng)_撞閥座閥撞擊環(huán)操作參數(shù)少且易于確定，實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中均可適用于酵母和多數(shù)細(xì)胞的破碎對(duì)易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器一般不適用2）高壓勻漿法

（high-pressurehomoge473）超聲波破碎（ultrasonication）機(jī)理：高于20kHz的超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產(chǎn)生和閉合，產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。缺點(diǎn)：A、影響因素多，細(xì)胞種類、濃度和處理時(shí)間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產(chǎn)熱大，需控溫；D、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。3）超聲波破碎（ultrasonication）機(jī)理：高于248機(jī)械破碎法總結(jié)以上幾種機(jī)械破碎法的作用機(jī)理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細(xì)胞、細(xì)胞發(fā)酵液的特性）和處理規(guī)模（實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規(guī)模實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)用實(shí)驗(yàn)室適用對(duì)象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細(xì)菌細(xì)菌機(jī)械破碎法總結(jié)以上幾種機(jī)械破碎法的作用機(jī)理不盡相同，有各自的492、細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細(xì)胞破碎方法，適用于易于破碎的細(xì)胞，eg.動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。細(xì)胞于高滲介質(zhì)中？脫水達(dá)到平衡后，迅速將其轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進(jìn)入細(xì)胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結(jié)－融化法（FreezingandThawing）細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)操作多次使細(xì)胞破壞，對(duì)于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效2、細(xì)胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticsho503、化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機(jī)溶劑都可改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇性地滲透出來(lái)→化學(xué)滲透法利用酸堿調(diào)pH；有機(jī)溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價(jià)格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機(jī)械破碎速度低、效率差，常需與機(jī)械法連用。3、化學(xué)法破碎用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分利514、生物法破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細(xì)胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細(xì)胞需用不同的酶：酵母細(xì)胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放的選擇性高、產(chǎn)品破壞少、對(duì)溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細(xì)胞碎片等，不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)決定了需要不同的酶4、生物法破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁524、生物法破碎自溶：通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，esp.G-的酶溶更受到了限制4、生物法破碎自溶：通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑等激活劑535、超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質(zhì)（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動(dòng)性能、傳質(zhì)性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質(zhì)，高壓CO2易于滲透到細(xì)胞內(nèi)。突然降壓后，因細(xì)胞內(nèi)外較大的壓差使細(xì)胞急劇膨脹而發(fā)生破裂可破碎細(xì)胞壁較厚的細(xì)胞如酵母甚至對(duì)粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果5、超臨界細(xì)胞破碎技術(shù)超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上54破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法破碎過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)B、對(duì)下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過(guò)程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物破碎方法的選擇選擇的一般原則破碎過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題554.2BuffersWhatisbuffer？Whyusebuffer？pH=pKa±0.5時(shí)，作為buffer，其緩沖能力最強(qiáng)補(bǔ)充14.2BuffersWhatisbuffer？pH=56磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpurposes,pKa2isofgreatestinterest－Why？磷酸鹽緩沖體系Formostbiochemicalpu57Howtomakingabuffer？溶液：1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4、pH7.5緩沖液含1mmol/LEDTA0.15mol/LNaCl2mol/L尿素3mmol/LGSH和0.6mmol/LGSSG1LHowtomakingabuffer？溶液：58方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：600mL1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）與400mL1/15mol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4）混勻?！?L1/15mol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液、pH7.5bufferA另取一燒杯，分別稱取1mmolEDTA；0.15molNaCl；2mol尿素；3mmolGSH和0.6mmolGSSG用bufferA溶解并定容至1L方案1磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L，pH7.5）：6059方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.0）：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與29.2mL0.1mol/L鹽酸混勻后，用去離子水定容至100mL。“x”mlsolutionofA＋

“y”mlsolutionofBWhy?ThepresenceofextrasaltsmaychangethepHormolarityofthebufferduetocommonioneffectsInvolvesextrawork（makinguptwosolutions）Waste（TheunusedvolumesofAandBarediscarded）Usuallyinaccurate缺點(diǎn)方案1Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.60第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件61方案2Choosethebuffer（withapKaascloseaspossibletothedesiredpH）Indentifywhetherthebufferismadefromanacidorabase（buffer由哪種酸或堿構(gòu)成？）Choosethespeciesthatgivesno-productswhentitrated（選擇一種，使得其用HCl或NaOH滴定時(shí)無(wú)副產(chǎn)物出現(xiàn)）Calculatethemassrequiredtogivetherequiredmolarity計(jì)算并稱量配制溶液所需的質(zhì)量Addallcomponents,titratetothepHandmakeupthevolume（加入所有其它組分，用HCl或NaOH調(diào)至所需pH并定容）pH計(jì)工作原理及使用注意事項(xiàng)描述緩沖液的兩個(gè)指標(biāo)：緩沖液的摩爾濃度緩沖液pH方案2Choosethebuffer（withapK62小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預(yù)期pH（pH±0.5）溫度改變、溶液稀釋及添加中性鹽的情況下，緩沖液pH變化盡可能小緩沖物質(zhì)不與實(shí)驗(yàn)中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，不干擾實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)（eg.硼酸鹽/糖蛋白，280nm處有光吸收）一般常用的緩沖液都有現(xiàn)成的配方，可查閱相關(guān)參考書利用特定的緩沖液計(jì)算軟件或者網(wǎng)上緩沖液計(jì)算軟件：http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp小結(jié)緩沖液的pKa值盡可能接近預(yù)期pH（pH±0.5）一般常63第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件64第四章-細(xì)胞破碎和分離提取技術(shù)-課件654.3AssaysforactivityandconcentrationMostproteinshavesomeformofuniquefunctionalactivity（具有一種活性）,whichdefinesthespecificprotein.Beforetheproteincanbeisolated,itisnecessarytoconceiveof(確定)anactivityandtodevise（設(shè)計(jì)）anappropriateassay.補(bǔ)充2Theactivityassayshouldbe:specific,

todefinetheproteinofinterestanddistinguishitfromallothersquantitative,

sothatthesuccessofthepurificationcanbemonitored

economical

intermsoftimeandmaterial.4.3Assaysforactivityandco66干擾素含量測(cè)定（MTT法生物學(xué)活性測(cè)定）

原理：干擾素能刺激某些指示細(xì)胞(如人羊膜上皮細(xì)胞Wish株、人喉癌細(xì)胞株Hep-2等)產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細(xì)胞免受水皰性口炎病毒(VSV)的攻擊，根據(jù)待測(cè)樣品不同稀釋度的保護(hù)能力，計(jì)算出干擾素生物學(xué)活性單位。材料：

VSV、Wish細(xì)胞、MTT、二甲亞砜(DMSO)、10％FCS

RPMI1640、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、CO2孵箱、超凈臺(tái)、酶標(biāo)檢測(cè)儀?；钚远x：以保護(hù)半數(shù)(50％)Wish細(xì)胞免受病毒VSV損害的最高干擾素稀釋度為1個(gè)干擾素活性單位。干擾素含量測(cè)定（MTT法生物學(xué)活性測(cè)定）原理：干擾素能刺激67尿激酶活性測(cè)定尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物體內(nèi)，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。對(duì)合成底物的活性與胰蛋白酶和纖溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-賴氨酸甲酯。對(duì)血纖維蛋白、血纖維蛋白原等都有溶解作用，從而達(dá)到溶血栓、抗凝血作用，所以是一種十分有效的溶血?jiǎng)Ｔ谂R床上，尿激酶已廣泛應(yīng)用于治療各種新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。尿激酶活性測(cè)定尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，血纖蛋白溶酶原68尿激酶活性測(cè)定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在40-60oC迅速加入（牛纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液0.5mL，立即混勻，倒入平皿（直徑9cm），制成厚度約0.2cm的纖維膜。分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液及供試品液各10mL于膜上，蓋上蓋，于37oC培養(yǎng)箱保溫18h后取出，分別量出每個(gè)溶圈垂直的兩直徑。以溶圈直徑（平均）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線尿激酶活性測(cè)定取瓊脂糖10mL，纖維蛋白原溶液5.0mL，在69胰蛋白酶活性測(cè)定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI>酰胺鍵>肽鍵?？衫煤羞@些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn)稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡(jiǎn)稱BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱TAME）測(cè)定酯酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異。胰蛋白酶活性測(cè)定胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基70ConcentrationassaysAnumberofmethodsareavailableformeasuringproteinconcentrationEachbeingbasedonaspecificpropertyofproteinsEachhavingcertainadvantagesanddisadvantages.ConcentrationassaysAnumbero711、AbsorptionofultravioletlightTheextinctioncoefficients(消光系數(shù))ofproteinsdifferUV-absorptionisusefulasaqualitative（定性）measure,fordetectingthepresenceofprotein（檢測(cè)蛋白質(zhì)是否存在）Butislessusefulforaccuratequantitativemeasurements（準(zhǔn)確定量測(cè)定）Exceptforpureproteinsofknownextinctioncoefficient.Becauseofitssimplicity,UVabsorptionisthemethodfavoredforcontinuous(semi-quantitative)monitoringoftheproteinconcentrationintheeluatefromchromatographycolumns.1、Absorptionofultravioletli72OneofthelimitationsofUV-absorbanceUV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的非蛋白質(zhì)物質(zhì)）mayinterferewith（干擾）themeasurement.Anelegantmethodforeliminatingtheabsorptionduetonucleicacids,thusallowingameasurementofproteinmustbetakenNucleicacids,whichareubiquitously（無(wú)所不在的）presentinbiologicalmaterial,absorbUVradiationstrongly,withaprofileoverlappingthatofprotein,butwithamaximumat260nm.OneofthelimitationsofUV-a732、ThebiuretassayInalkalinesolution,proteins（withpeptidebonds）reduceCu2+toCu+togiveabluecolouredcomplex.Becausethereactioniswithpeptidebonds,thereislittlevariationinthecolourintensitygivenbydifferentproteins（不同蛋白質(zhì)的光吸收強(qiáng)度差別不大）.Thebiuretmethodcanbeusedforthemeasurementofproteinconcentration2、ThebiuretassayInalkaline74Adisadvantageofthebiuretmethod：

Itisrelativelyinsensitive(靈敏度低),sothatlargeamountsofproteinarerequiredfortheassay（每次蛋白質(zhì)含量測(cè)定時(shí)所需蛋白質(zhì)量要很大）.Anotherlimitationisthataminobuffers,suchasTris,whicharecommonlyusedinthepHrange8-10,caninterferewiththereaction.Adisadvantageofthebiuretm753、TheLowryassayMaybeconsideredasanextensionofthebiuretassay.Initially,