重組DNA技術(shù)課件

第五章重組DNA技術(shù)以LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)行說明第五章重組DNA技術(shù)以LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)行1第一節(jié)重組DNA技術(shù)的主要工具一限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第一節(jié)重組DNA技術(shù)的主要工具一限制性核酸內(nèi)切酶2分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG分類Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)3BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC4重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能Taq酶用于PCRDNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功5第二節(jié)載體載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第二節(jié)載體載體定義常用載體6克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)

含有能被宿主細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)識(shí)別的表達(dá)元件、從而可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因合成目的蛋白的載體?？寺≥d體(cloningvector)7載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制的起始點(diǎn)，能自主復(fù)制；選擇標(biāo)記，具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。表達(dá)載體還要有表達(dá)元件。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制的起始點(diǎn)，能自主復(fù)制；8質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)9第五章重組DNA技術(shù)課件10第五章重組DNA技術(shù)課件11第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本原理基本原理獲取目的基因，選擇載體DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接切割目的基因和載體重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本原理基本原理獲取目的基因，12以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程以13一目的基因的獲取1.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)2.cDNA文庫(cDNAlibrary)3.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)4.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

一目的基因的獲取1.基因組DNA文庫(genomicDN14三目的基因與載體的連接二克隆載體的選擇和構(gòu)建1.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端三目的基因與載體的連接二克隆載體的選擇和構(gòu)建1.平15目的基因限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體載體162.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接單酶切末端連接雙酶切末端連接2.粘性末端連接17BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割同一限制酶切位點(diǎn)連接重組體載體自連目的基因自連目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC18不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg193.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接205′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶T(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTP5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶T(214.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接22人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco23受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)：重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。四重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞受體菌條件導(dǎo)入方式四重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞24五篩選和鑒定重組體

1.平板篩選2.酶切分析3.PCR分析4.核酸分子雜交分析五篩選和鑒定重組體25(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)26雞的β肌球蛋白的克隆和檢出雞的β肌球蛋白的克隆和檢出27重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為分分離目的基因切限制酶28重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)29第三節(jié)LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建1、查找基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物1tttcctggtctggagcgaccaatgccgtcctccttcctccaggcacctgttcaccgaagt61tgaggctggtcacaactccggcggcccaaggagctgctcggttcacccacaaggaatgag121agctgcctgcctgctgctgcttggagagccccagacagtcgcttgaagaggtgtgtggat181gtctcctagatcttgacttgctcctgaggaaatattgtgtgactgagtttcctgttatac241tgctctccaatccatcatgaaccagccagagtctgccaacgatcctgaacccctgtgtgc301agtgtgtggccaagcccactccttggaggaaaaccacttctacagctatccagaggaagt361ggatgatgacctcatctgccacatctgcctgcaggctttgctggaccccctggacactcc421gtgtggacacacctactgcaccctctgcctcaccaacttcctggtggagaaggacttctg481tcccatggaccgcaagcctctggttctgcagcactgcaagaagtccagcatcctggtcaa541caaactcctcaacaagctactggtgacctgcccattcagggagcactgcacccaggtgtt601gcagcgctgtgacctcgagcatcactttcaaaccagctgtaaaggtgcctcccactacgg661cctgaccaaagataggaagaggcgctcacaagatggctgtccagacggctgtgcgagcct721cacagccacggctccctccccagaggtttctgcagctgccaccatctccttaatgacaga781cgagcctggcctagacaaccctgcctacgtgtcctcggcagaggacgggcagccagcaat841cagcccagtggactctggccggagcaaccgaactagggcacggccctttgagagatccac901tattagaagcagatcatttaaaaaaataaatcgagctttgagtgttcttcgaaggacaaa961gagcgggagtgcagttgccaaccatgccgaccagggcagggaaaattctgaaaacaccac1021tgcccctgaagtctttccaaggttgtaccacctgattccagatggtgaaa………….第三節(jié)LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建1、查找基因序列，根據(jù)基30SalⅠ-LNX-FP-2445'GCGTCGACTCTCCAATCCATCATGAACCAG3'SalⅠ-LNX-FP-13095'ATGTCGACGTGGCTGACTGTGATGCGTG3'KpnⅠ-LNX-RP-24775'ATCCATGGGATTTTTCTGTTTTCCTCTGACCC3'SalⅠ-短LNX-FP-2835'ACGTCGACAAGGCAGCACACTGCTCGGAG3'SalⅠ-短LNX-FP-2745'ACGTCGACGCCAGGGAGAAGGCAGCACAC3'KpnⅠ-短LNX-RP-22405'ATCCATGGTGTGATTTTTCTGTTTTCCTCTGAC3'SalⅠ-LNX-FP-2175'ACGTCGACGTGTGACTGAGTTTCCTGTTATACTG3'SalⅠ-LNX-FP-2805'ACGTCGACCGATCCTGAACCCCTGTGTGC3'KpnⅠ-LNX-RP-13275'ATCCATGGTTAACGCATCACAGTCAGCCACAGC3'SalⅠ-LNX-FP-2445'GCGTCGACTC312、利用設(shè)計(jì)的PCR引物和腦庫cDNA模板進(jìn)行PCR3、切膠回收PCR產(chǎn)物，與T載體進(jìn)行連接2、利用設(shè)計(jì)的PCR引物和腦庫cDNA模板進(jìn)行PCR3、切膠32T載體結(jié)構(gòu)圖T載體結(jié)構(gòu)圖33連接體系如下：載體0.5ulPCR回收產(chǎn)物9.5ulSolutionⅠ10ul混勻后16℃水浴24小時(shí)連接。4、重組T載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以得到大量重組質(zhì)粒TOP10感受態(tài)的制備：連接體系如下：4、重組T載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以得到大量重組質(zhì)粒T34挑單克隆37度培養(yǎng)12小時(shí)37度培養(yǎng)2-3小時(shí)至對(duì)數(shù)生長后期OD590=0.375冰上放置10分鐘4度下3000g離心10分鐘棄上清CaCl210ML(0.1M,預(yù)冷）冰上放置10-30分鐘挑單克隆37度培養(yǎng)12小時(shí)37度培養(yǎng)2-3小時(shí)至對(duì)數(shù)生長后期35棄上清每50ml原培養(yǎng)液加入1.5ml預(yù)冷的15%的甘油和0.1M的CaCl250ul(100ul)分裝-80度保存常規(guī)轉(zhuǎn)化方法：即從-80℃冰箱取出感受態(tài)TOP10后，冰中解凍半小時(shí)，然后加入質(zhì)粒，混勻后冰中半小時(shí)，在42℃熱激90秒，冰中放5分鐘，加入800ul2YT液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20-30分鐘，5000rpm離心3分鐘，吸出850ul上清后混勻沉淀再涂Amp平板。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。棄上清每50ml原培養(yǎng)液加入1.5ml預(yù)冷的15%的甘油和036細(xì)菌培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的提取：1、挑取Amp平板中的單個(gè)菌落，在4ml2YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2YT的配制：稱取酵母粉3g，蛋白胨4.8g，NaCl1.5g，溶解后定溶至300ml，4ml每管分裝后，120℃滅菌35分鐘即成。

2、質(zhì)粒提?。阂话惆丛噭┖姓f明提取，包括離心沉淀細(xì)菌→含RNA酶的緩沖液重新懸浮細(xì)菌→加堿性裂解液裂解細(xì)菌→加中和液中和→離心沉淀蛋白質(zhì)等雜質(zhì)→上清用柱子結(jié)合質(zhì)?！礈煲合礈臁麴s水洗脫質(zhì)粒細(xì)菌培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的提?。?7第五章重組DNA技術(shù)課件385、對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定與酶切鑒定以及測(cè)序5、對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定與酶切鑒定以及測(cè)序396、將對(duì)的重組質(zhì)粒與表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切6、將對(duì)的重組質(zhì)粒與表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切40第五章重組DNA技術(shù)課件417、回收酶切載體與克隆片段，并進(jìn)行連接，再通過測(cè)序驗(yàn)證8、轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞檢查表達(dá)情況7、回收酶切載體與克隆片段，并進(jìn)行連接，再通過測(cè)序驗(yàn)證8、轉(zhuǎn)42第五章重組DNA技術(shù)課件43第五章重組DNA技術(shù)課件44演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！45第五章重組DNA技術(shù)以LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)行說明第五章重組DNA技術(shù)以LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建進(jìn)行46第一節(jié)重組DNA技術(shù)的主要工具一限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第一節(jié)重組DNA技術(shù)的主要工具一限制性核酸內(nèi)切酶47分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG分類Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)48BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC49重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能Taq酶用于PCRDNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功50第二節(jié)載體載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第二節(jié)載體載體定義常用載體51克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)

含有能被宿主細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)識(shí)別的表達(dá)元件、從而可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因合成目的蛋白的載體。克隆載體(cloningvector)52載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制的起始點(diǎn)，能自主復(fù)制；選擇標(biāo)記，具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。表達(dá)載體還要有表達(dá)元件。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制的起始點(diǎn)，能自主復(fù)制；53質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)54第五章重組DNA技術(shù)課件55第五章重組DNA技術(shù)課件56第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本原理基本原理獲取目的基因，選擇載體DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接切割目的基因和載體重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本原理基本原理獲取目的基因，57以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程以58一目的基因的獲取1.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)2.cDNA文庫(cDNAlibrary)3.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)4.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

一目的基因的獲取1.基因組DNA文庫(genomicDN59三目的基因與載體的連接二克隆載體的選擇和構(gòu)建1.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端三目的基因與載體的連接二克隆載體的選擇和構(gòu)建1.平60目的基因限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目的基因限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶重組體載體612.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接單酶切末端連接雙酶切末端連接2.粘性末端連接62BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割同一限制酶切位點(diǎn)連接重組體載體自連目的基因自連目錄BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCT4DNA連接酶GATC63不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg643.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3.同聚物加尾連接655′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶T(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTP5′3′載體DNA5′3′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶T(664.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

4.人工接頭(linker)連接67人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG5′-EcoRⅠEco68受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)：重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。四重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞受體菌條件導(dǎo)入方式四重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞69五篩選和鑒定重組體

1.平板篩選2.酶切分析3.PCR分析4.核酸分子雜交分析五篩選和鑒定重組體70(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)71雞的β肌球蛋白的克隆和檢出雞的β肌球蛋白的克隆和檢出72重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為分分離目的基因切限制酶73重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒限制酶消化開環(huán)74第三節(jié)LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建1、查找基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物1tttcctggtctggagcgaccaatgccgtcctccttcctccaggcacctgttcaccgaagt61tgaggctggtcacaactccggcggcccaaggagctgctcggttcacccacaaggaatgag121agctgcctgcctgctgctgcttggagagccccagacagtcgcttgaagaggtgtgtggat181gtctcctagatcttgacttgctcctgaggaaatattgtgtgactgagtttcctgttatac241tgctctccaatccatcatgaaccagccagagtctgccaacgatcctgaacccctgtgtgc301agtgtgtggccaagcccactccttggaggaaaaccacttctacagctatccagaggaagt361ggatgatgacctcatctgccacatctgcctgcaggctttgctggaccccctggacactcc421gtgtggacacacctactgcaccctctgcctcaccaacttcctggtggagaaggacttctg481tcccatggaccgcaagcctctggttctgcagcactgcaagaagtccagcatcctggtcaa541caaactcctcaacaagctactggtgacctgcccattcagggagcactgcacccaggtgtt601gcagcgctgtgacctcgagcatcactttcaaaccagctgtaaaggtgcctcccactacgg661cctgaccaaagataggaagaggcgctcacaagatggctgtccagacggctgtgcgagcct721cacagccacggctccctccccagaggtttctgcagctgccaccatctccttaatgacaga781cgagcctggcctagacaaccctgcctacgtgtcctcggcagaggacgggcagccagcaat841cagcccagtggactctggccggagcaaccgaactagggcacggccctttgagagatccac901tattagaagcagatcatttaaaaaaataaatcgagctttgagtgttcttcgaaggacaaa961gagcgggagtgcagttgccaaccatgccgaccagggcagggaaaattctgaaaacaccac1021tgcccctgaagtctttccaaggttgtaccacctgattccagatggtgaaa………….第三節(jié)LNX1基因的表達(dá)載體構(gòu)建1、查找基因序列，根據(jù)基75SalⅠ-LNX-FP-2445'GCGTCGACTCTCCAATCCATCATGAACCAG3'SalⅠ-LNX-FP-13095'ATGTCGACGTGGCTGACTGTGATGCGTG3'KpnⅠ-LNX-RP-24775'ATCCATGGGATTTTTCTGTTTTCCTCTGACCC3'SalⅠ-短LNX-FP-2835'ACGTCGACAAGGCAGCACACTGCTCGGAG3'SalⅠ-短LNX-FP-2745'ACGTCGACGCCAGGGAGAAGGCAGCACAC3'KpnⅠ-短LNX-RP-22405'ATCCATGGTGTGATTTTTCTGTTTTCCTCTGA