血紅素加氧酶1的表達對實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠的影響

血紅素加氧酶1的表達對實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠的影響

【摘要】nbsp;nbsp;目的：探討血紅素加氧酶1(HO1)的表達對實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠的影響。方法：32只健康雄性wistar大鼠，隨機分為4組，正常＋脂多糖(LPS)(對照組)、肝硬化＋生理鹽水對照組(TAA組)、肝硬化＋LPS組(TAA＋LPS組)、肝硬化＋LPS＋hemin(

作者：劉曉華，師水生

作者單位：(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001)【摘要】

目的：探討血紅素加氧酶1(HO1)的表達對實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠的影響。方法：32只健康雄性wistar大鼠，隨機分為4組，正常＋脂多糖(LPS)(對照組)、肝硬化＋生理鹽水對照組(TAA組)、肝硬化＋LPS組(TAA＋LPS組)、肝硬化＋LPS＋hemin(氯化高鐵血紅素)(HM組)。用硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)肝硬化模型時間共計10周，對照組自由飲清水。于模型造成后，向?qū)φ战M、TAA＋LPS組、HM組大鼠腹腔內(nèi)注入LPS3mg/kg；TAA組大鼠腹腔內(nèi)注入等量的生理鹽水；HM組于注射LPS12h前，腹腔注射HM(40mg/kg)，并在注入LPS6h后，各組動物經(jīng)腹主動脈穿刺采全血觀察血漿中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、一氧化氮(NO)及丙二醛(MDA)的表達。留肝組織用免疫組織化學法觀察HO1的表達。結(jié)果：對照組、TAA組、TAA＋LPS組、HM組血漿中的ALT/AST、MDA、NO依次升高差異有顯著性(P＜0.05)，對照組、TAA、TAA＋LPS、HM組各組大鼠的灰階值顯著依次降低，且有明顯差別(P＜0.05)。結(jié)論：在實驗性的肝硬化內(nèi)毒素中盡管HO1的表達增加，但它未起到保護作用，它與內(nèi)毒素對機體的損傷有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】

血紅素加氧酶1；氯化高鐵血紅素；肝硬化內(nèi)毒素血癥

Roleofhemeoxygenase1expressioninendoxtoxemiccirrhoticrats

LIUXiaohua，SHIShuisheng

(TheSecendHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuang030001，China)

Abstract

Objective：Toobservethepathologicalroleofhemeoxygenase1(HO1)inlipopolysaccharide(LPS)treatedcirrhoticrats.Methods：ThirtytwomalewistarratswererandomlydividedintoLPStareatnormalgroup，cirrhoticgroup，LPStartedcirrhoticratsgroup，heminandLPStartedcirrhoticratsgroup，eachgrouphad8rats.Livercirrhosiswasproducedbytheadministrationofthioacetamideforaperiodof10weeks.Attheendofthisperiod.Cirrhoticratsweresacrificed6hafterLPSinjection(3mg/kg，intraperitoneally).Plasmatransaminaseactivitiestotalnitrite(NO)andmalondialdehyde(MDA)levelsaswellasexpressionofliverHO1weredetermined.Results：LPSadministrationtocirrhoticratscausedfurtherincreasesinplasmatransaminaseactivities，andplasmatotalnitriteandMDAlevelsascomparedtooirrhoticrats.HeminandLPSadministrationtocirrhoticratscausedincreasesplasmatransaminaseactivitiesandplasmatotalnitriteandMDAlevelsascomparedtocirrhoticrats.HeminaugmentdamagesofliverinducedbyLPS.Conclusion：OurresultsindicatethatincreasedHO1mayhaveasynergisticeffectinLPSaugmentedhepatotoxicityincirrhoticrats.

Keywords

hemeoxygenase1；hemin；endoxtoxemiccirrhotic

肝硬化是我國常見病，肝硬化患者Kupffer細胞功能明顯下降，腸道菌群失調(diào)及腸黏膜通透性增加是形成內(nèi)毒素血癥重要原因，內(nèi)毒素不僅加重原有的肝損害，而且可誘導(dǎo)全身代謝和血流動力學紊亂。本研究以腹腔注射脂多糖(LPS)以增強肝硬化內(nèi)毒素血癥，觀察血紅素加氧酶1(HO1)的表達對肝硬化大鼠的影響。

1

資料與方法

1.1

實驗動物與模型復(fù)制

健康雄性wistar大鼠，體重(300±20)g(由山西醫(yī)科大學生理教研室提供)。對照組自由飲清水，其余各組自由飲加有硫代乙酰胺(TAA)的水，0.03％的TAA誘導(dǎo)飼喂5周時間，再改為0.04％的TAA誘導(dǎo)飼喂5周。

1.2

藥品與試劑

HO1的誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素(hemin)購自sigma公司、精制大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)購自Sigma公司、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學工程研究所。

1.3

動物分組與給藥

將32只大鼠隨機分為：正常＋LPS(對照組)、TAA組、TAA＋LPS組、HM組。除TAA組外其余各組腹腔注射LPS(3mg/kg)，TAA組給等容量的生理鹽水；HM組于注射LPS12h前，腹腔注射hemin(40mg/kg)。并于注射LPS6h后，各組動物用7％水合氯醛5mL/kg麻醉后，用采血針與真空采血管經(jīng)腹主動脈穿刺采全血，高速離心機離心(3500r/min)后，血漿置于－80℃冰箱冷凍備檢。采血后，迅速取出肝臟，沖凈余血，將肝組織迅速投入4％的多聚甲醛中浸泡固定24h，做石蠟切片以備用。

1.4

檢測指標及方法

1.4.1

組織學檢查

肝組織切片分別做HE染色，光鏡下觀察肝臟病理變化、膠原分布情況及假小葉的生成。

1.4.2

免疫組織化學

采用SABC法。結(jié)果判定：在顯微鏡下觀察肝組織免疫組織化學切片中HO1染色陽性細胞的分布和著色情況。為區(qū)別肝組織中HO1表達差異，用BI2000圖像分析系統(tǒng)，測定HO1陽性細胞的著色灰度值?；叶戎翟叫。f明著色越深，反映細胞內(nèi)HO1蛋白表達量越多。以灰度值來進行量化后的統(tǒng)計學分析。

1.4.3

肝功能指標檢測

采用常規(guī)生化法測天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)。

1.4.4

硫代巴比妥酸法(TBA)測血漿中MDA含量

用硝酸還原酶法測血漿NO濃度，按試劑盒說明操作。

1.4.5

統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)表示用±s，應(yīng)用SPSS12.0軟件，采用單因素方差分析，取P＝0.05為顯著性檢驗水準。

2

結(jié)

果

2.1

組織學觀察結(jié)果

除對照組外，其余3組肝組織均符合肝硬化的病理學改變。余3組肝細胞增生，胞體大，細胞核深染，細胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)和增生的肝細胞周圍纖維組織增生，分割形成假小葉，小葉中央靜脈擴張。對照組肝組織正常。

2.2

肝組織HO1灰階值測定結(jié)果(見表1)表1

實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠HO1、NO、MDA的變化

方差分析表明：對照組、TAA組、TAA＋LPS組、HM組大鼠的灰階值顯著依次降低，且相鄰兩組差異有顯著性(P＜0.05)，表明LPS可以使HO1的表達進一步增強。HM可以誘導(dǎo)HO1的表達。

2.3

血漿ALT、AST、MDA、NO2＋NO3的變化

對照組、TAA組、TAA＋LPS組、HM組的血漿中的ALT與AST(見表2)、MDA、NO依次升高(見表1)，且各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表2

實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠ALT及AST的變化

3

討

論

HO1是一種應(yīng)激蛋白基因，是血紅素降解過程中的限速酶。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)3種HO同工酶，其中HO1為誘導(dǎo)型，廣泛分布于肝臟、脾臟、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和骨髓等組織，可被炎癥因子、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激、重金屬及內(nèi)毒素等所誘導(dǎo)。HO1可催化血紅素降解，生成等摩爾的膽綠素、CO和鐵，膽綠素在其還原酶的催化下變?yōu)槟懠t素。近年來認為，內(nèi)源性CO和NO一樣是一種氣體信號傳導(dǎo)分子和神經(jīng)遞質(zhì)，由于低劑量CO在多種疾病中表現(xiàn)出抗凋亡、抗增殖、抗炎癥、抗移植排斥反應(yīng)等生物學效應(yīng)，因而備受關(guān)注，因此與HO一起稱為HO/CO系統(tǒng)。HO1催化產(chǎn)物的抗氧化損傷的作用也越來越受到人們的重視［1］。

本實驗的結(jié)果顯示，肝硬化內(nèi)毒素血癥時，肝臟HO1活性升高，應(yīng)用HO1活性誘導(dǎo)劑hemin后，HO1的表達明顯升高，但是ALT與AST也進一步升高，說明肝臟損傷進一步增加。HO1在很多情況下是起保護作用的，但是本實驗卻顯示與肝臟損傷有關(guān)。國外Melley等［2］在對動脈碳氧血紅蛋白與危重患者預(yù)后的臨床研究調(diào)查結(jié)果顯示：盡管HO1在很多情況下是起保護作用的，但是過度表達或許是有害的，HO1的表達有一個最佳適合范圍。Kvam等［3］提出HO1表達有一個閾值，適度的HO1水平有利于機體抵抗氧化應(yīng)激損傷，而HO1的過度表達會對機體有損傷作用。國內(nèi)李玉明等［4］在研究膿毒血癥時，大鼠肝臟血紅素加氧酶的變化及作用，發(fā)現(xiàn)在膿毒血癥晚期，肝臟HO1活性雖依然保持高水平，MDA含量卻較早期進一步升高，推測HO1的作用可能與其濃度和活性相關(guān)。

MDA含量可反應(yīng)體內(nèi)過氧化的程度，間接反應(yīng)細胞損傷的程度。MDA反應(yīng)機體氧化的指標。本實驗的結(jié)果顯示，肝硬化內(nèi)毒素血癥時，肝臟HO活性升高，由于內(nèi)毒素等毒性物質(zhì)的作用致NO、MDA含量增加；應(yīng)用HO活性誘導(dǎo)劑hemin后，HO1的表達明顯升高、NO、MDA含量進一步增加，ALT與AST也進一步升高。其機制可能與HO1與一氧化氮合酶(iNOS)的相互促進作用，造成體內(nèi)NO的過量生成有關(guān)。有研究表明炎癥條件下誘導(dǎo)型iNOS的過量表達會使NO水平升高，產(chǎn)生細胞毒性，造成病理損傷?；钚匝?ROS)存在下，NO衍生得到的活性氮(RNS)，如過氧亞硝酸根離子(ONOO－)等，是導(dǎo)病理損傷作用的重要環(huán)節(jié)。ONOO－可使酪氨酸(Tyr)或蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生硝化反應(yīng)，生成3硝基酪氨酸3NT，并提出內(nèi)源性硝化劑可導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)的損傷。3NT已作為RNS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的相關(guān)生物標志［5］。DogruAbbasoglu等［6］研究發(fā)現(xiàn)在實驗性肝硬化內(nèi)毒素血癥時，血漿中的MDA、3NT是增加的，同時發(fā)現(xiàn)HO1的表達也是增加的。他們認為在肝硬化內(nèi)毒素血癥時機體的氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡與內(nèi)毒素的毒性一起影響肝硬化的預(yù)后。Sarady等［7］研究發(fā)現(xiàn)，低劑量CO暴露的大鼠對LPS引起的急性肝損傷均有明顯的保護作用，主要表現(xiàn)在與iNOS的關(guān)系上。在肝CO促進肝臟iNOS的誘導(dǎo)和NO的生成。NO通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定HOmRNA而提高HO1的表達［8］。HO1/CO與iNOS/NO在調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境平衡方面相互作用，即NO可誘導(dǎo)HO1生成CO，在肝臟CO又正反饋促進iNOS產(chǎn)生NO，二者形成復(fù)雜的代謝環(huán)路。由于NO與ROS－反應(yīng)的速度是正常狀態(tài)下超氧化物歧化酶與ROS反應(yīng)速度的3倍，使得NO首先捕捉ROS以極快的速度反應(yīng)生成ONOO－［9］。推測誘導(dǎo)HO1可能通過促進iNOS表達，進而產(chǎn)生NO在局部聚集的毒性作用，參與肝硬化內(nèi)毒素血癥損傷機制，提示促進iNOS/NO效應(yīng)是HO1肝硬化內(nèi)毒素血癥損傷機體的原因。

總之，本研究表明，在實驗性的肝硬化內(nèi)毒素時，肝臟HO1的表達增加，盡管HO1在很多情況下是起保護作用的，但是過度表達是有害的。為肝硬化伴內(nèi)毒素的治療提供了新的思路。

【參考文獻】

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