食用茵液體菌種發(fā)酵罐規(guī)范化操作規(guī)程

食用苗ＥＤＩＢＬＥＦＵＮＧＩ２伽１９（５）食用茵液體菌種發(fā)酵罐規(guī)范化操作規(guī)程王麗娥１趙文娟－秦濤２馬齊１吳江洪２劉永寶３（１陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安７１０６００；２陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西西安７１０６００１３遼寧朝陽(yáng)市食用菌研究所，遼寧朝陽(yáng)１２２０００）關(guān)鍵詞液體菌種發(fā)酵罐操作規(guī)程文章編號(hào)１０００－８３５７（２００９）０５—００６２－－０２食用菌液體菌種由于其有利于高效率、工廠化、規(guī)范化栽培，解決了食用菌集約化生產(chǎn)中的瓶頸制約難題，且與固體菌種相比具有生產(chǎn)周期短、菌齡一致、出菇齊、成本低、純度高、活力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到食用菌栽培者的青睞，已成為食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。但由于發(fā)酵罐的操作需要較強(qiáng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，提高發(fā)酵成功率一直是普通生產(chǎn)者的使用難題。筆者經(jīng)過(guò)幾年對(duì)７０型發(fā)酵罐的生產(chǎn)實(shí)踐，總結(jié)出了該設(shè)備高成功率的實(shí)用規(guī)范化操作規(guī)程，供大家借鑒。食用菌液體菌種生產(chǎn)流程：罐的清洗和檢查一煮罐一配料一滅濾芯、無(wú)菌水、接種槍管一上料一滅菌（安裝濾芯計(jì)時(shí)開(kāi)始時(shí)開(kāi)氣泵吹干濾芯）一降溫（先接進(jìn)氣管后放，并瓶）一發(fā)酵罐接種（第２天裝袋滅菌）一培養(yǎng)一接菌袋（瓶）。１清洗與檢查發(fā)酵罐在每次使用后或再次使用之前都必須進(jìn)行徹底清洗，除去罐擘的菌球、菌塊、料液及其它污物。對(duì)于內(nèi)壁粘附的污物可以用木棒包扎軟布揩拭，洗罐水從罐底接種閥排出。如有大的菌料（塊）不能排出，可卸下進(jìn)氣管的噴嘴排出菌料（塊）。清洗的標(biāo)準(zhǔn)：罐內(nèi)壁無(wú)懸掛物，無(wú)殘留菌球，排放的水清澈無(wú)污物。罐清洗完畢即可加水，加水量以超過(guò)加熱管為宜（絕對(duì)禁止加熱管干燒）。然后啟動(dòng)設(shè)備，觀察檢查控制柜、加熱管工作是否正常，各閥門(mén)有無(wú)滲漏，檢查合格方能開(kāi)始工作。２煮灌正常生產(chǎn)不須煮罐，上一次生產(chǎn)完只需將罐洗凈就可進(jìn)入下一批生產(chǎn)。如果有下列情況之一者須要煮罐：①新罐，初次使用須要煮罐；（Ｄ上一次污染雜菌的罐；③更換生產(chǎn)品種的罐；（９長(zhǎng)時(shí)間不用的罐。煮灌是對(duì)罐內(nèi)進(jìn)行預(yù)消毒的過(guò)程，具體操作方法：①關(guān)閉罐底部的接種閥和進(jìn)氣閥，把水從進(jìn)料口加入至視鏡中線，蓋上進(jìn)料１：３蓋，擰緊，關(guān)閉排氣口。②啟動(dòng)電源，按控制柜滅菌鍵４ｓ，屏幕上兩個(gè)加熱指示燈亮，此時(shí)設(shè)備進(jìn)入滅菌狀態(tài)。⑧當(dāng)溫度達(dá)到１０００Ｃ時(shí)排放冷氣，微微打開(kāi)排氣閥直至滅菌結(jié)束。（④當(dāng)控制柜顯示屏上的顯示溫度１２３℃、壓力表壓力０．１２ＭＰａ時(shí)，控制柜自動(dòng)計(jì)時(shí)，顯示屏上交叉顯示溫度和計(jì)時(shí)時(shí)間。當(dāng)時(shí)間達(dá)３５ｍｉｎ后，控制柜自動(dòng)報(bào)警，此時(shí)按控制柜報(bào)警停止鍵，并關(guān)閉排氣閥，悶２０ｍｉｎ后，打開(kāi)排氣閥、接種口、進(jìn)氣口，把罐內(nèi)的水放掉，煮罐結(jié)束。在煮罐的同時(shí)進(jìn)行煮料、滅濾芯及接種槍。３濾芯、濾芯上蓋及進(jìn)氣管、接種槍及軟管的滅菌拆下濾收稿日期：２００８一１２—３０一稿，２００９－０３－０１修改稿。基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)院項(xiàng)目，編號(hào)２００６Ｋ一０６。ｅ—ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｌｉ—ｅ３＠１６３．ｃｏｍ一６２一萬(wàn)方數(shù)據(jù)芯外殼滅菌，也可整體滅菌。進(jìn)氣管口用８－１０層醫(yī)用脫脂紗布包扎。接種槍及軟管口用８－１０層醫(yī)用脫脂紗布包扎。裝鍋時(shí)，濾芯向下，濾芯上蓋接口處的出氣管無(wú)折角、盤(pán)管無(wú)折角，口向上，瓶上蓋一層聚丙烯塑料膜。Ｏ．０５ＭＰａ排氣循環(huán)２次或打開(kāi)排氣閥待冒大氣５－１０ｍｉｎ，０．１１ＭＰａ溫度１２１℃計(jì)時(shí)４０ｍｉｎ，保持Ｏ．１１４）．１５ｌｑｌＰａ，低于０．１１ＭＰａ要重新計(jì)時(shí)。４上料關(guān)閉下端進(jìn)氣閥和接種閥（出料口），將漏斗插入進(jìn)料口，將料液由進(jìn)料口倒人或用水泵抽入處理好的發(fā)酵罐中，加泡敵３瓶蓋（礦泉水瓶蓋）約１２ｍＬ，用水沖洗煮料鍋，裝料量為罐體總?cè)莘e的６０％－８０％，７０型加量（４５土５）Ｌ。加料高度以高于視鏡上邊緣１０ｃｍ為宜（至標(biāo)牌ｌ一半處，最高不超過(guò)標(biāo)牌１）。擰緊進(jìn)料口蓋，以防泄氣。５培養(yǎng)基滅菌關(guān)閉所有閥門(mén)，啟動(dòng)電源，按控制柜滅菌鍵４ｓ，加熱Ｉ、Ⅱ的指示燈亮，此時(shí)進(jìn)入滅菌狀態(tài)?？刂乒耧@示屏的顯示溫度１０００Ｃ時(shí)排放冷氣，微微打開(kāi)排氣閥直至滅菌結(jié)束。在加熱前期（１００。Ｃ前）料液很少翻騰，發(fā)酵罐底部料液因沉淀粘度增大更易于粘附于加熱棒上變糊，料液中出現(xiàn)有少量糊塊或小片。為防止產(chǎn)生糊料，可在培養(yǎng)基達(dá)到１００％前，使未過(guò)濾的空氣直接通入以起到攪拌作用。當(dāng)控制柜顯示屏上的溫度１２３０Ｃ、壓力表壓力０．１２ＭＰａ時(shí)，控制柜自動(dòng)計(jì)時(shí)，顯示屏上交叉顯示溫度和滅菌時(shí)間。計(jì)時(shí)開(kāi)始時(shí)排料，在３５ｍｉｎ內(nèi)前、中、后期（０、１７、３０ｍｉｎ）排３次料，排料方法是微開(kāi)進(jìn)氣口和接種口閱門(mén)，有少量氣、料排出即可，每次排料３～５ｍｉｎ。３次共排料３－５Ｌ，少于３Ｌ達(dá)不到目的，大于５Ｌ浪費(fèi)（每升可接５０袋）。排料目的，一是排出閥門(mén)處生料，二是對(duì)閥門(mén)管路進(jìn)行殺菌。當(dāng)滅菌計(jì)時(shí)到３５ｍｉｎ，控制柜自動(dòng)報(bào)警，此時(shí)按控制柜停止報(bào)警鍵，培養(yǎng)基滅菌結(jié)束。滅菌時(shí)，打掃煮料用具，安裝空氣過(guò)濾器（濾芯必須在使用之前３０ｍｉｎ滅好菌），在滅菌計(jì)時(shí)打開(kāi)氣泵（氣泵自打開(kāi)后一直不可停），此時(shí)不接進(jìn)氣管，使壓縮機(jī)于吹３０ｒａｉｎ，目的是吹于濾芯。６培養(yǎng)基冷卻培養(yǎng)基冷卻，是把培養(yǎng)基溫度由１２３℃降至２５～２８℃的過(guò)程。可采用兩種冷卻方法：一是通冷水，利用循環(huán)冷卻水進(jìn)行冷卻降溫。二是接管通氣，在培養(yǎng)料滅菌最后一次放料后，用火焰灼燒進(jìn)氣口１０－２０ｓ，迅速接上進(jìn)氣管，但由于此時(shí)罐壓還很高，不能立即通氣，可通過(guò)調(diào)整貯氣罐（也叫油水分離器）底閥使氣壓維持在Ｏ．１２ＭＰａ左右，同時(shí)緩慢開(kāi)大培養(yǎng)罐頂部的排氣閥，待罐壓降至Ｏ．１ＭＰａ時(shí)即可關(guān)閉貯氣罐底閥，微開(kāi)排氣閥，“先接后放”，待貯氣罐的壓力高于罐壓０．０２ｌＶＩＰａ開(kāi)閥進(jìn)氣，使培養(yǎng)基在氣體的攪拌下迅速降溫，并一直通氣供氧直至培養(yǎng)結(jié)束。待高于培養(yǎng)溫度２℃關(guān)掉冷卻水，可延長(zhǎng)加熱管壽命。正常情況下，７０型發(fā)酵罐冷卻至培養(yǎng)溫食用曹度約需６０ｒａｉｎ。ＥＤＩＢＬＥＦＵＮＧＩ２伽１９（５）長(zhǎng)會(huì)越來(lái)越淡，后期只有一種淡淡的菌液清香味。木耳、金針菇香味淡，白靈菇香味濃，靈芝有藥味，香菇淡酒糟味。注：實(shí)際接袋時(shí)間以取樣為準(zhǔn)：靜置５ｍｉｎ，菌球既不漂浮，也不沉淀，菌液澄清透明，菌球、菌液界限明顯，袋內(nèi)溫度降至３０℃以下（第ｌ天接液體罐，第２天裝袋）。若無(wú)菌袋，關(guān)閉啟動(dòng)電源，冷水降至１５℃下，可保持２ｄ。１０接菌包液體菌種培養(yǎng)好后，在火焰的保護(hù)下接好接種７罐內(nèi)接種首先要準(zhǔn)備好火圈（棉花纏緊，用紗布套上）、火機(jī)、９５％Ｉ業(yè)酒精、手套（耐熱、耐火，不可用石棉手套，和預(yù)濕手套等用品。然后開(kāi)大排氣閥，罐壓接近０時(shí)關(guān)閉。利用火焰保護(hù)進(jìn)行罐內(nèi)接種，把火圈放在進(jìn)料１３的上方點(diǎn)燃?？扉_(kāi)進(jìn)料１３蓋（氣泵不能關(guān)閉）。從火焰的中部將橡膠塞拔下，迅速倒入菌種，迅速把進(jìn)料口蓋過(guò)火焰燒后蓋好，擰緊，熄滅火焰，移走火圈接種完畢。管，不停泵，關(guān)小排氣閥，待壓力穩(wěn)定在０．０３—０．０５ＭＰａ時(shí)接種。８培養(yǎng)啟動(dòng)設(shè)備控制柜進(jìn)入培養(yǎng)狀態(tài)，微開(kāi)排氣閥使罐壓至０．０２—０．０４ＭＰａ，并檢查培養(yǎng)溫度和空氣流量１．２ｍ伲以上，即可進(jìn)入培養(yǎng)階段。根據(jù)品種溫型，選擇培養(yǎng)程序，常規(guī)品種選培養(yǎng)Ｉ檔（２４～２６℃），高溫品種選培養(yǎng)Ⅱ檔（２８～３１℃）。設(shè)備啟動(dòng)后自動(dòng)進(jìn)入培養(yǎng)Ｉ程序，按鍵控制柜自動(dòng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)Ⅱ程序，在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)菌絲的溶氧要求控制供氧量，一般來(lái)講控制空氣流量在１１２一１．５ｍ柏（若低檢查管路，更換墊），對(duì)于各種食用菌菌種都較為合適。為降低氣泵工作壓力，可將流量計(jì)調(diào)至最大，此時(shí)罐內(nèi)壓力為Ｏ．０２ＭＰａ，過(guò)濾系統(tǒng)的壓力在Ｏ．０４～Ｏ．０６ＭＰａ。罐壓低于０．０２ＭＰａ易染雜菌，高于０．０４ＭＰａ１１注意事項(xiàng)①濾芯，耐蒸汽殺菌１３０ｑＣ２００ｈ。當(dāng)不用時(shí)，應(yīng)拆下用報(bào)紙包上放在陰涼干燥處保存。使用時(shí)禁止料液倒流損壞濾芯，如發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐倒流現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)把濾芯用熱水浸泡（不能刮、不能刷洗），打開(kāi)壓縮機(jī)通氣流將各孑Ｌ的料液吹出，陰涼處涼干。②培養(yǎng)過(guò)程中突然停電，應(yīng)立即關(guān)閉排氣閥和進(jìn)氣閥，并用打氣筒在貯氣罐的進(jìn)氣口打氣（進(jìn)氣罐內(nèi)的氣體必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾器的過(guò)濾），待賈ｌ：氣罐的壓力達(dá)到Ｏ．１０ＭＰａ時(shí)，打開(kāi)進(jìn)氣閥進(jìn)氣，可聽(tīng)到“咕嚕、咕嚕”的進(jìn)氣聲。當(dāng)氣體進(jìn)罐的聲音漸弱時(shí)，關(guān)閉進(jìn)氣閥，再次打氣。如此反復(fù)操作，直到罐壓升至０．０５－０．１０ＭＰａ時(shí)保壓即可，待來(lái)電正常供氣培養(yǎng)。也可會(huì)降低壽命，氣體氣泡直徑變小，溶氧減少，高壓時(shí)Ｃ０２溶解度大于０：。每天放貯氣罐底下水。９取樣觀察接種２４ｈ以后，每隔１２ｈ可從接種口取樣１次，觀察菌種萌發(fā)和生長(zhǎng)情況．一般三看一聞：一看菌液顏色，正常菌液顏色純正。雖有淡黃、橙黃、淺棕色等顏色，但不混濁，大多越來(lái)越淡（蜜環(huán)菌、雞腿菇、木耳變深）；二看菌液澄清度，大多澄清透明（木耳、靈芝有些亂菌絲），培養(yǎng)前期略顯渾濁，培養(yǎng)后期菌液中沒(méi)有細(xì)小顆粒及絮狀物，因而菌液會(huì)越來(lái)越澄清透明，否則為不正常；三看菌球周?chē)淌欠衩黠@及菌球數(shù)量的增長(zhǎng)情況，食用菌菌球都有小小毛刺，或長(zhǎng)或短，或軟或硬（白金針菇硬刺）。在４８－７２ｈ菌球濃度增長(zhǎng)較快，體積百分比濃度≥８０％即可接袋。若變渾濁、霉味、酒味，顏色深說(shuō)用氧氣瓶代替打氣筒持續(xù)向罐內(nèi)供氣培養(yǎng)，直至來(lái)電再進(jìn)入正常培養(yǎng)狀態(tài)。圖１７０型發(fā)酵罐明已壞。一聞是聞菌液氣味，料液的香甜味隨著培養(yǎng)時(shí)間的延■｝■｝■｝ｊ■日ｋ■｝，｜｝—｝ｊ■１■｝肇ｊ■｝■ｋｊ■｝■Ｐ，ｋ■Ｐ■ｔ■｝婦業(yè)坐螺ｊ＊誓ｅ囊業(yè)業(yè)業(yè)ｊ■?●ｋ■｝生謄業(yè)ｑＦ峰ｊ●｝蕾｝，ｋ蕾｝■‘■｝■｝妊■｝！●ｋ—ｔｊｋ誓ｔ—－■ｔ＇Ｉ蟹（上接Ｐ３１）終培養(yǎng)液ｐＨ值為３．２５，培養(yǎng)時(shí)不要添加有機(jī)氮源，不要用生長(zhǎng)速度太快的培養(yǎng)基，菌絲球生長(zhǎng)得較緊密較好，菌球太小抵抗不利條件的能力有限。菌根食用菌類(lèi)菌種按現(xiàn)有菌種保藏方法保藏，往往容易因菌絲失水干枯而死亡，利用液體菌種保藏菌根食用菌類(lèi)菌【２】ＣＯＲＢＥＲＹＹ，ＬＥＴＡＣＯＮＦ．。ＳｔｏｒａｇｅｏｆｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｆｕｆＩｇｉｂｙｆｒｅｅｚｉｎｇｆＪ］．ＡｎｎａｌｅｓｄｅｓＳｃｉｅｎｃｅｓＦｏｒｅｓｔｉ§ｒｅｓ，１９９７，５４，２１１－２１７．［３】ＤａｎｅｌｌＥ．，ＦｌｙｇｈＧ，，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｅｔｏｍｙｅｏｒｒｈｉｚａｌｍｕｓｈ?ｒｏｏｍＣａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ１３４２．ｅｉｂａｒｉｕｓ【Ｊ】．Ｍｙｃ０１．Ｒｅｓ．２００２，１０６（１１）；１３４０一種可能是一種可以值得探討的方法。ＨＩ參考文獻(xiàn)【１】顧金剛．微生物菌種資源收集整理保藏技術(shù)規(guī)程ＩＭ］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社。２００５．ＷａｎｇＹ．Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｍａｔｓｕｔａｋｅ．ＰｈＤｔｈｅｓｉｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＯｔｔｏ，Ｄｕｎｅｄｉｎ，ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ，１９９５．１５］高振江，吳薇，馬浩，等．一種食用菌液體菌種的保存方法【Ｐ】．中國(guó)專(zhuān)利ＣＮｌ３２１１７２（２，２００７．【６】方可武．一種食用菌液體菌種的貯存方法【Ｐ】．９２１０８７３３．０，１９９３．心—ｐｑ—、妒。ｐｐｑ—、一一心—ｑｐｐｑ—～—、—＾ｑ妒ｐ嚕—～—、—、ｐｑ—乜—、≯＾÷Ｐｐｐｑ—ｑ—、，＾—＾∞ｐｑ—、—、—＾，斗＿—、，、—＾曲ｐｐ心ｐ乜—、—＾。ｐｐｐ礦‘，～—、ｐｐｔ，（上揍Ｐ３７）參考文獻(xiàn)（Ｉ）：２２－２３．【１】