基因工程原理和技術(shù)-1-2-課件

基因工程原理與技術(shù)授課教師：林良斌教授參考書：

1、《基因工程原理》吳乃虎主編

2、《植物基因工程原理與技術(shù)》王關(guān)林主編基因工程原理與技術(shù)1第一章緒論第一節(jié)基因工程的概念基因工程(geneengineering)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容。

基因工程是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，是指將一種或多種生物體的基因分離出來或人工合成基因，按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞中遺傳表達(dá)并獲得新的遺傳性狀而形成新的生物類型的生物技術(shù)。

基因工程的核心內(nèi)容是基因體外重組(DNA體外重組)?；蚬こ痰乃拇笠?或基本條件)：目的基因、載體、工具酶、受體。

相關(guān)名詞：遺傳工程、基因工程、基因操作、重組DNA技術(shù)、分子克隆、基因克隆、基因無性繁殖?；蚬こ痰耐怀鎏攸c(diǎn)：打破物種間基因交流的界限。

第一章緒論2第二節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展

基因工程誕生于1973年。一、基因工程誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)1、理論基礎(chǔ)

①DNA是遺傳物質(zhì)；

②DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；

③遺傳密碼的通用性和遺傳信息傳遞的方式。2、技術(shù)基礎(chǔ)

①限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割；

②DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；

③基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用。

第二節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展3二、基因工程的誕生1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg研究小組的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)。

1973年，斯坦福大學(xué)的S.Cohen研究小組的DNA體外重組和大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(見下兩張幻燈片)同年，加利福尼亞大學(xué)的H.Boyer也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，1973年被定為基因工程誕生的元年。

二、基因工程的誕生這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，4pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DN5培養(yǎng)平皿卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平板培養(yǎng)平皿卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平6三、基因工程的發(fā)展

分為艱難階段、逐漸成熟階段、迅速發(fā)展階段、鼎盛發(fā)展階段。1、基因工程的艱難階段(1973~1976，載體和受體系統(tǒng)的安全性改造)

基因工程的安全性問題，導(dǎo)致許多國家限制基因重組的實(shí)驗(yàn)。2、基因工程的逐漸成熟階段(1976~1982，基因工程藥物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽(見下圖)；1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功；1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并通過發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素。從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

三、基因工程的發(fā)展7大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目的基因基因載體從動(dòng)物腦中提取5mg---50萬只羊腦9升工程大腸桿菌培養(yǎng)液大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目的基因基因載體83、基因工程的迅速發(fā)展階段(1982~2000，動(dòng)植物基因工程育種與基因治療)

發(fā)展了一系列新的基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了多種轉(zhuǎn)化原核生物和動(dòng)物、植物細(xì)胞的載體。

1982年首次通過顯微注射培育出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因小鼠。

1983年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草。1990年美國政府首次批準(zhǔn)一項(xiàng)人體基因治療臨床研究計(jì)劃，對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷而患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。1991年，美國提出人類基因組計(jì)劃并實(shí)施。3、基因工程的迅速發(fā)展階段(1982~2000，動(dòng)植物基因工94、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))

2019年完成人類基因組計(jì)劃。至今，基因工程藥物上市的有幾十種，上百種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，目前至少有150種轉(zhuǎn)基因植物問世。自從1986年抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草被首次批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)以來,至今國際上已有30個(gè)國家批準(zhǔn)上千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn),涉及的植物種類達(dá)50多種。自從1994年轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿獲準(zhǔn)上市以來，目前至少有51種轉(zhuǎn)基因植物上市。

4、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))10據(jù)國際有關(guān)方面預(yù)測，到20l0年，全世界轉(zhuǎn)基因食物的種植面積將增至10000萬公頃。據(jù)國際有關(guān)方面預(yù)測，到20l0年，全世界11雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉(zhuǎn)基因植物要慢得多！主要原因是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作煩瑣、困難，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要求高，不易再生出個(gè)體。荷蘭的GenPharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉(zhuǎn)12

英國羅斯林研究所研制成功的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治療肺氣腫病。這種病在北美比較常見，病人以前只能依賴于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代療法，價(jià)格昂貴，而現(xiàn)在用轉(zhuǎn)基因羊來生產(chǎn)，每升這種羊奶可售6000美元。英國羅斯林研究所研制成功的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含13

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組獲得5只轉(zhuǎn)基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪稱血友病人救星的藥物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組獲得5只轉(zhuǎn)基因山14第三節(jié)基因工程研究的主要內(nèi)容一、基因工程研究的主要內(nèi)容主要包括：基礎(chǔ)研究（載體的研究、受體系統(tǒng)的研究、目的基因研究、工具酶的研究、轉(zhuǎn)化方法的研究、生物基因組學(xué)研究）和應(yīng)用研究等。1、載體的研究構(gòu)建各種用途載體及提高外源基因表達(dá)的效率。2、受體系統(tǒng)的研究

包括細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物。

受體系統(tǒng)的安全性及轉(zhuǎn)化效率。3、目的基因研究目的基因的分離、克隆及改造。

第三節(jié)基因工程研究的主要內(nèi)容154、工具酶的研究開發(fā)新的工具酶。5、轉(zhuǎn)化方法的研究開發(fā)各種受體細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化方法。6、生物基因組學(xué)研究具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的各種生物的基因組測序、挖掘新的基因等。7、應(yīng)用研究

包括基因工程藥物研究、基因疫苗研究、轉(zhuǎn)基因植物研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究以及在酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用。

4、工具酶的研究16二、基因工程的基本操作程序

①分離獲得帶有目的基因的DNA片段及載體選擇與構(gòu)建。

②限制性核酸內(nèi)切酶分別切割外源DNA和載體。

③通過DNA連接酶將外源基因DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子。

④將重組DNA分子引入到受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化)。

⑤帶有重組體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的擴(kuò)增及選擇培養(yǎng)。

⑥轉(zhuǎn)化體的鑒定，獲得外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。⑦目的基因的進(jìn)一步研究分析，并設(shè)法使之實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)(基因功能研究或基因改造研究)。

二、基因工程的基本操作程序17基因工程原理和技術(shù)-1-2-課件18第四節(jié)基因工程的意義與發(fā)展前景一、基因工程研究的意義①大規(guī)模生產(chǎn)其他生物體內(nèi)含量極微但卻具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物分子；②設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種(新性狀乃至全新物種

)；③搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息資源(基因)。二、基因工程發(fā)展前景基因工程問世以來短短的三十年，顯示出了巨大的活力，基因工程的前景將更加燦爛輝煌。今后，基因工程的重點(diǎn)研究方向是基因組學(xué)、基因工程藥物、動(dòng)植物生物反應(yīng)器和環(huán)保等方面。

第四節(jié)基因工程的意義與發(fā)展前景19第二章基因工程的工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶類。根據(jù)其用途分為四類：限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、修飾酶。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、宿主的限制-修飾現(xiàn)象(見下圖)

限制作用(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。這是維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

修飾作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。這是宿主細(xì)胞識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的作用機(jī)制。第二章基因工程的工具酶20R/M系統(tǒng)①DNA甲基化酶②限制性核酸內(nèi)切酶R/M系統(tǒng)的作用①限制作用②修飾作用R/M系統(tǒng)211953年，Arber發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象，預(yù)見限制性核酸內(nèi)切酶的存在；1970年，H.O.Smith從流感嗜血桿菌中分離出第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII。Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。1953年，Arber發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象，預(yù)22基因工程原理和技術(shù)-1-2-課件23

根據(jù)限制-修飾系統(tǒng)的遺傳分析，大腸桿菌K12有以下4種表型：①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修飾功能。②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修飾功能，這類突變株經(jīng)常用于基因工程的受體。③rk-mk-：限制和修飾缺陷型，既無限制功能，又無修飾功能，也常用于基因工程的受體。④rk+mk-：修飾缺陷型，缺乏修飾自身DNA的功能，但具有限制功能，故也稱為“自殺性表型”(suicidephenotype)。根據(jù)限制-修飾系統(tǒng)的遺傳分析，大腸桿菌K12有24二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型

限制性核酸內(nèi)切酶是指一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。

簡稱限制性內(nèi)切酶或限制性酶，目前已經(jīng)鑒定出三種不同類型。至今，已發(fā)現(xiàn)近4000種限制酶。rebase.neb特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)功能輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)切割方式應(yīng)用價(jià)值舉例異源三聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割無EcoK、EcoB同源三聚體限制Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割廣泛EcoRI、HindIII…異源二聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割小EcoPI二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)異源三聚25三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系統(tǒng)，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改。①限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母(大寫，斜體)代表該酶的宿主菌屬名(genus)第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)前兩個(gè)字母。②第四個(gè)字母代表宿主菌的菌株名的第一個(gè)字母(小寫，正體)或染色體外成分(質(zhì)?；蚴删w，大寫，正體)。③若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示(正體)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名26四、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性1、II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列

一般為4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，稱為稀有切割限制酶。有些為反向重復(fù)序列(間斷回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的識(shí)別序列中，某一位或二位堿基并非嚴(yán)格專一，如HindII可識(shí)別4種核苷酸序列。

酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG四、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列Ba272、II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶均在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位的酯鍵，產(chǎn)生3’端為羥基、5’端為磷酸基團(tuán)的片段。有三種切割方式：①在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的5’末端切割，產(chǎn)生5’黏性末端，如EcoRI2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式28②在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的3’端切割，則產(chǎn)生3’黏性末端，如PstI②在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的3’端切割，則產(chǎn)生3’黏性末端，29③在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如PvuII有些識(shí)別序列為間斷型回文序列的II限制酶，其切點(diǎn)位于不確定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC③在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如PvuII30有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別序列，如MboII識(shí)別GAAGA序列，切割位點(diǎn)則是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指識(shí)別序列相同、切割方式相同或不同、來源不同的II限制性核酸內(nèi)切酶。如：HpaII與MspI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)都相同(C↓CGG)，但MspI還可以識(shí)別已甲基化的序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不同。有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離31同尾酶是指來源各異、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的黏性末端的II限制性核酸內(nèi)切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸內(nèi)功酶不具有甲基化功能如EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶與EcoRI甲基化酶，兩者均識(shí)別GAATTC序列，而前者能對(duì)G↓AATTC序列進(jìn)行切割，后者的作用是使第二個(gè)A甲基化。目前已經(jīng)分離到許多II型限制性核酸內(nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)的甲基化酶。同尾酶是指來源各異、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同324、II型限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的切割有一些II限制性核酸內(nèi)切酶，除雙鏈DNA外，還可以特異識(shí)別并切割單鏈DNA的相應(yīng)位點(diǎn)，只是切割效率比較低。如HhaI能切割單鏈?zhǔn)删wФX174和M13mp18DNA，只是切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途①產(chǎn)生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重組克隆；②建立DNA分子的限制酶圖譜；③構(gòu)建基因文庫；④構(gòu)建載體。4、II型限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的切割33六、II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)1、標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立

反應(yīng)體積一般為20μl(根據(jù)DNA量可適當(dāng)擴(kuò)大)。

①10×酶切緩沖液2μl(大部分酶反應(yīng)緩沖液基本相似：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根據(jù)酶活力大小及工作性質(zhì)確定酶量，不超過反應(yīng)總體積10％

③DNA樣品(μ

g~mg)④無菌水

限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)活力單位(U)為：在合適的溫度和緩沖液中，在20μ

L反應(yīng)體系中，1h完全降解1ug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需要的酶量。六、II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)342、酶解反應(yīng)①混勻②酶解(溫度、時(shí)間)③酶解鑒定④終止a、加EDTA至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；c、65℃水浴保溫20min(有些最適反應(yīng)溫度較高的酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的不完全酶解(見下圖)不完全酶解對(duì)于構(gòu)建物理圖譜和基因組文庫是非常必要的。其方法有減少酶量、增加反應(yīng)體積、縮短反應(yīng)時(shí)間和降低反應(yīng)溫度等。

2、酶解反應(yīng)35incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3incomplete1231+3incompletedig364、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶；②加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時(shí)將會(huì)抑制酶的活性；③整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶；④盡可能使反應(yīng)體積減到最小，即盡可能少加水；⑤當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量；⑥當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液。若沒有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。4、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)37七、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性與酶切效果的因素

1、酶的純度；要求不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染。

2、DNA樣品的純度；DNA樣品中的蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。樣品中DNase會(huì)降解DNA，影響酶切。3、酶切反應(yīng)的溫度、時(shí)間；多數(shù)II型限制酶最適反應(yīng)溫度是37℃，但SmaI為25℃或30℃，SfiI為50℃，TaqI為65℃

。反應(yīng)溫度過高或過低都會(huì)影響酶活性，甚至導(dǎo)致酶失活。七、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性與酶切效果的因素384、DNA的甲基化程度；限制性核酸內(nèi)切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。這一特性有特殊用途：①改變某些限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列；②產(chǎn)生新的限制酶識(shí)別序列；③保護(hù)限制性核酸內(nèi)切酶的切點(diǎn)；④利用一些同裂酶對(duì)甲基化的敏感性不同，研究細(xì)胞DNA位點(diǎn)專一性甲基化的程度和分布。

大腸桿菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中的DNA胞嘧啶甲基化酶(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA，可防止DNA的甲基化。4、DNA的甲基化程度；395、DNA分子的構(gòu)型

限制性內(nèi)切酶對(duì)不同構(gòu)型DNA分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比線性DNA酶解所需要的酶量高許多，甚至可高達(dá)20倍。有些限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)于同一DNA分子上不同位置的識(shí)別序列，切割效率明顯不同。例如，EcoR

I、HindIII對(duì)λDNA的酶切。6、反應(yīng)緩沖液主要成分：pH(Tris-HCl)、離子強(qiáng)度(NaCl)、Mg2+；

輔助成分：β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)防止酶氧化；

牛血清蛋白(BSA)組分V對(duì)于某些酶是必需的，可防止酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性。5、DNA分子的構(gòu)型40

星號(hào)活性是指在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列相似的序列的特性。

例如EcoRI在高pH(＞8)、低鹽(50mmol/L)和高濃度甘油(＞5％)存在的情況下，其識(shí)別序列由GAATTC改變?yōu)镹AATTN。以EcoRI表示其星號(hào)活性。

引起星號(hào)活性的原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量過大，大于100U/微克DNA；③低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L；④高pH，大于8.0；⑤含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)陽離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。星號(hào)活性是指在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸41第二節(jié)DNA連接酶

1967年幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶。一、定義與反應(yīng)機(jī)理

DNA連接酶是指能催化雙鏈DNA分子內(nèi)或分子間的5’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵而使DNA鏈連接的一類酶。大腸桿菌和其他細(xì)菌：NAD+動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體：ATP第二節(jié)DNA連接酶大腸桿菌和其他細(xì)菌：NAD+42T4DNA連接酶連接DNA/RNA雜合分子中DNA鏈的切口DNA連接酶無連接T4DNA連接酶連接DNA/RNA雜合分子中DNA鏈的切口43DNA連接酶的作用機(jī)理DNA連接酶的作用機(jī)理44二、DNA連接酶的種類1、T4噬菌體DNA連接酶(T4DNA連接酶)

T4DNA連接酶DNA/RNARNA

平頭末端的Km比黏性末端的Km高約1000倍。提高平頭末端連接效率的方法：①加大酶濃度(10~100倍于粘性末端)；②加大底物濃度；③加入適量的一價(jià)陽離子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低濃度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最適終濃度為0.5mmol/L。二、DNA連接酶的種類T4DNA連接酶DNA/RNARNA452、大腸桿菌DNA連接酶

E.coliDNA連接酶DNA/RNAE.coliDNA連接酶無連接3、T4噬菌體RNA連接酶

用途：RNA末端標(biāo)記pNpNNNNT4RNA連接酶2、大腸桿菌DNA連接酶E.coliDNA連接酶DNA/46三、DNA連接酶的反應(yīng)體系DNA連接酶的活性單位較通用的是韋氏(Weiss)單位，一個(gè)韋氏單位是指在37℃，20min內(nèi)催化從γ,β-32P-ATP的焦磷酸根置換出1nmol32P所需要的酶量。M-L單位：以d(A-T)n作為底物黏性末端連接單位：以λDNA/HindIII片段為底物一個(gè)韋氏單位相當(dāng)于0.2個(gè)M-L單位或者60個(gè)黏性末端連接單位。

反應(yīng)體系：10μL或20μL，DNA片段，連接酶，Buffer，溫度(12~16℃或<30℃)，時(shí)間(4~16h)

Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT三、DNA連接酶的反應(yīng)體系47四、影響連接反應(yīng)的因素1、DNA末端的濃度連接產(chǎn)物的分子構(gòu)型(線形或環(huán)狀)與DNA濃度及DNA分子長度存在密切關(guān)系。在一定濃度下，小分子DNA片段進(jìn)行分子內(nèi)連接，有利于形成環(huán)化分子。對(duì)于長度一定的DNA分子，其濃度增加有利于分子間連接。此外，分子間連接還與兩種片段的末端濃度的比例有關(guān)。原則上一種片段的濃度大于另一一種片段的濃，如：在克隆中，插入片段:載體片段=2:1。2、反應(yīng)溫度

介于最適溫度與其Tm之間。＞30℃會(huì)導(dǎo)致T4DNA連接酶的不穩(wěn)定。

3、ATP濃度ATP最適的終濃度為0.5mmol/L，濃度過高會(huì)抑制連接。四、影響連接反應(yīng)的因素48第三節(jié)DNA聚合酶

DNA聚合酶分為：①依賴于DNA的DNA聚合酶；②依賴于RNA的DNA聚合酶。常用的DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶。酶聚合反應(yīng)速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性持續(xù)合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速無低低T4DNA聚合酶中速無高低T7DNA聚合酶快速無高高修飾T7DNA聚合酶快速無低或無高TaqDNA聚合酶快速有無高逆轉(zhuǎn)錄酶低速無無中第三節(jié)DNA聚合酶酶聚合反應(yīng)速度5’→3’外切酶活性3’49一、大腸桿菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：雙鏈DNA帶磷酸基團(tuán)的5’端或DNA/RNA雜合分子中的RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作用DNAPolI一、大腸桿菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外50主要用途：切口平移法制備DNA探針反應(yīng)體系：在25μl反應(yīng)體系中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs主要用途：切口平移法制備DNA探針DNaseI，Mg2+Po51二、Klenow片段

Klenow酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺失5`→3`核酸外切酶活性。其主要用途如下：①補(bǔ)平限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’黏性末端；

二、Klenow片段52②標(biāo)記3’凹陷末端的DNA分子或平末端；DNA末端標(biāo)記一般標(biāo)記活性不高，極少用于分子雜交探針的標(biāo)記，主要用于DNA序列測定等所需片段的標(biāo)記。

②標(biāo)記3’凹陷末端的DNA分子或平末端；53③合成cDNA第二鏈；④雙脫氧末端終止法測定DNA序列；⑤在單鏈模板上延伸寡核苷酸引物，以合成雜交探針和進(jìn)行體外突變。

平末端標(biāo)記③合成cDNA第二鏈；平末端標(biāo)記54三、T4噬菌體DNA聚合酶

具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺少5’→3’外切酶活性。其3’→5’外切酶活性比Klenow酶高100~1000倍。

在無dNTP時(shí)，可以從任何3`-OH端外切(即可降解dsDNA，只是其活性比ssDNA低很多)，在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸，在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。T4DNA聚合酶的置換合成作用無dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶三、T4噬菌體DNA聚合酶T4DNA聚合酶的置換合成作用無55T4DNA聚合酶的用途：①切平核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’黏性末端T4DNA聚合酶的用途：56②末端標(biāo)記。特別是不需要核酸外切酶幫助就可進(jìn)行平末端標(biāo)記，這種探針標(biāo)記方法稱為置換(取代)合成法。

置換合成法將產(chǎn)生一組末端完全標(biāo)記、而從末端到中點(diǎn)其標(biāo)記量遞減的分子。

②末端標(biāo)記。特別是不需要核酸外切酶幫助就可進(jìn)行57四、T7噬菌體DNA聚合酶與測序酶

T7DNA聚合酶具有5`→3`聚合酶活性及很強(qiáng)的單鏈、雙鏈DNA的3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性。其最大特點(diǎn)是有最強(qiáng)的持續(xù)合成能力。其用途如下：

①用于長模板(M13DNA)的引物延伸；(不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸)②通過延伸或取代合成法標(biāo)記DNA3’末端；

③將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。對(duì)天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之降低或完全失去3’→5’的外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。因此，修飾的T7DNA聚合酶主要用于雙脫氧測序，又稱作為測序酶。此外，還用于末端標(biāo)記、探針制備(可催化較低水平<0.1μmol/L的dNTP參入)、體外誘變中DNA鏈的合成。

四、T7噬菌體DNA聚合酶與測序酶58五、TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺少3’→5’外切酶活性。其最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定(95℃以上高溫半小時(shí)不失活)，最適反應(yīng)溫度高(7075℃)。因此，其主要用途是PCR及DNA測序(具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA)。保真的PCR酶有TmaDNA聚合酶(Thermotoamaritima

海棲熱袍菌)、TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis

海棲熱球菌)、PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus

激烈火球菌)、PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesi

沃氏火球菌)。五、TaqDNA聚合酶59六、逆轉(zhuǎn)錄酶①5’→3’聚合酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA或DNA為模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；

六、逆轉(zhuǎn)錄酶60②RNA酶H活性。能從5’或3’方向特異地降解DNA/RNA雜交分子中的RNA鏈。

②RNA酶H活性。能從5’或3’方向特異地降61商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶主要是鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶。

其用途有：

①合成cDNA第一鏈，構(gòu)建cDNA文庫；②RT-PCR；③以RNA為模板制備DNA探針；④補(bǔ)平和標(biāo)記5’-末端突出的DNA片段；⑤代替Klenow酶用于DNA序列分析。商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶主要是鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒(62第四節(jié)修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)末端轉(zhuǎn)移酶能在二價(jià)陽離子作用下，催化DNA的聚合作用，但不需要模板，將脫氧核糖核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶效率高Co2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低第四節(jié)修飾酶AAAAAAMg2+dATP末端轉(zhuǎn)移63用途：①給載體和外源DNA(如cDNA或隨機(jī)切割DNA)接上同聚物尾，以便連接；②末端標(biāo)記用途：①給載體和外源DNA(如cDNA或隨機(jī)切割DNA)接64二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脫氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖核酸酶1、核糖核酸酶A(RNaseA)RNaseA是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端磷酸酯鍵。其反應(yīng)條件極寬，且極難失活。在低鹽濃度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割單鏈和雙鏈RNA、DNA/RNA中的RNA；當(dāng)NaCl濃度為300mmol/L或更高時(shí)，RNaseA就特異性切割單鏈RNA。

二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脫氧核糖核酸酶65RNaseA的用途:①確定RNA或DNA中的單堿基突變的位置；②核糖核酸酶保護(hù)分析法檢測特定RNA(特異降解單鏈RNA，對(duì)雜交雙鏈RNA不起作用)，其靈敏度比核酸酶S1保護(hù)分析法高數(shù)倍；③轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的分析

④降解DNA樣品中的RNA分子。2、核糖核酸酶T1

RNaseT1也是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上鳥嘌呤殘基的3’端磷酸酯鍵。其催化活性與用途類似于RNaseA。RNaseA的用途:663、核糖核酸酶HRNaseH特異地降解DNA/RNA雜交雙鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生具有3’-OH和5’-磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸，不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。

其用途是產(chǎn)生cDNA第二鏈合成的引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA連接酶3、核糖核酸酶HRNaseHPolIdNTPPol67(二)

脫氧核糖核酸酶I

DNaseI是一種內(nèi)切脫氧核糖核酸酶，可從嘧啶核苷酸5’-端磷酸隨機(jī)降解單鏈或雙鏈DNA，生成具有5’-磷酸末端的寡核苷酸。Mg2+Mn2+用途：①產(chǎn)生大腸桿菌DNA聚合酶I切口平移的切口；②在Mn2+存在下，產(chǎn)生構(gòu)建基因組文庫的大片段DNA；③DNasel足跡法測定DNA結(jié)合蛋白在DNA上的精確結(jié)合位點(diǎn)；④除去RNA樣品中的DNA。(二)脫氧核糖核酸酶IMg2+Mn2+用途：①產(chǎn)生大腸68(三)S1核酸酶作用特點(diǎn)：①需要Zn2+和酸性條件(pH4.0~4.5)；②降解單鏈DNA或RNA，但降解DNA的速度大于降解RNA的速度(7倍)；③降解方式為內(nèi)切和外切，內(nèi)切為主；④酶量過大時(shí)也可降解雙鏈核酸，為單鏈的1/75000。用途：①切掉DNA片段的單鏈突出末端產(chǎn)生平頭末端；②在雙鏈cDNA合成時(shí)切除發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)；③S1核酸酶作圖分析。

如內(nèi)含子的數(shù)目、大小、位置分析及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與終止位點(diǎn)分析等。

(三)S1核酸酶69內(nèi)含子數(shù)量及大小的分析DNAmRNA分子雜交RERES1核酸酶變性凝膠電泳MABM：分子量MarkerA：未經(jīng)S1酶處理B：經(jīng)S1酶處理但不能定位內(nèi)含子內(nèi)含子數(shù)量及大小的分析DNAmRNA分子雜交RERES1核酸70轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的定位分析RERERE酶切堿性磷酸酯酶多核苷酸激酶**變性后與mRNA雜交*S1核酸酶*變性凝膠電泳MAB轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的定位分析RERERE酶切堿性磷酸酯酶**變性后與71三、核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是一類從多核苷酸鏈的末端開始逐個(gè)降解核苷酸的酶。

單鏈核酸外切酶：E.coliexoⅠ、exoⅦ雙鏈核酸外切酶：exoⅢ單雙鏈核酸外切酶：Bal31核酸酶1、大腸桿菌核酸外切酶VII

3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性用途:①抹平DNA末端；②回收dA/dT接尾克隆的cDNA。三、核酸外切酶單鏈核酸外切酶：E.coliexoⅠ、e722、大腸桿菌核酸外切酶III

3’→5’外切酶活性ExoIIIMg2+核酸外切酶活性PPExoIIIMg2+3’磷酸酶活性ExoIIIMg2+

ssDNA無反應(yīng)無嘌呤或無嘧啶位點(diǎn)ExoIIIMg2+核酸內(nèi)切酶活性RNA/DNA2、大腸桿菌核酸外切酶III3’→573構(gòu)建單向缺失突變體庫3’突出黏性末端5’突出黏性末端ExoIIIS1核酸酶克隆單向缺失突變體克隆構(gòu)建單向缺失突變體庫3’突出黏性末端5’突出黏性末端Exo743、Bal31核酸酶

Bal31核酸酶主要為3’外切酶活性，同時(shí)伴有5’外切及較弱的內(nèi)切活性，需要Mg2+和Ca2+。

①對(duì)于單鏈DNA，具有特異的內(nèi)切酶活性，可從3’-OH末端迅速降解DNA，而5’端切割速率較慢；②對(duì)于雙鏈DNA，具有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性，以3’外切酶活性迅速降解一條鏈，隨后在互補(bǔ)鏈上進(jìn)行緩慢的5’端內(nèi)切反應(yīng)，產(chǎn)物大部分為5’端突出5個(gè)堿基的雙鏈分子(80%~90%)，少量為帶平頭末端的雙鏈分子(10%~20%)。對(duì)雙鏈RNA分子也能發(fā)生類似反應(yīng)；③當(dāng)共價(jià)閉合環(huán)型雙鏈DNA上出現(xiàn)單鏈缺口時(shí)，通過其內(nèi)切酶活性，將其切開成線性雙鏈DNA，并按上述方式進(jìn)一步降解。

用途：與ExoIII相同，構(gòu)建雙向缺失突變體庫，分析大片段DNA。3、Bal31核酸酶75四、T4噬菌體多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈的DNA或RNA的5’-OH末端。催化速度：雙鏈>單鏈>雙鏈切口或缺口；

5’突出末端>平末端>5’凹陷末端。T4多核苷酸激酶的激酶活性(正向反應(yīng))四、T4噬菌體多核苷酸激酶催化速度：雙鏈>單鏈>雙鏈切口或缺76交換反應(yīng)(過量ADP存在時(shí))交換反應(yīng)(過量ADP存在時(shí))77T4多核苷酸激酶的3’磷酸酶活性

PPPPPPPNpPNPOHNpOHNOHOHT4多核苷酸激酶Mg2+pH6.0T4多核苷酸激酶的3’磷酸酶活性PPPPPPPNpPNPO78T4多核苷酸激酶的用途①DNA的5’末端標(biāo)記(如DNA的化學(xué)測序)；②使DNA5’末端磷酸化，以便連接(如銜接頭的克隆方式)。

+T4多核苷酸激酶的用途①DNA的5’末端標(biāo)記(如DNA的化學(xué)79五、堿性磷酸酶催化核酸分子的脫磷作用，使DNA或RNA或核苷酸的5’磷酸變?yōu)?’-OH末端。細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)、小牛腸堿性磷酸酶(CIP)CIP的活性比BAP高10~20倍，反應(yīng)后易失活(68℃10min)

五、堿性磷酸酶80堿性磷酸酶的用途①5’末端標(biāo)記前的處理；②去除載體片段的5’磷酸基因，防止載體自身連接。

堿性磷酸酶的用途81基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶特異切割DNA，產(chǎn)生具有特定末端的DNA片段DNA連接酶DNA片段間連接，產(chǎn)生重組DNA分子DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子切口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等TaqDNA聚合酶PCR反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或末端標(biāo)記堿性磷酸酶防止載體自身連接末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾連接基因工程中常用的工具酶工具酶功82基因工程原理與技術(shù)授課教師：林良斌教授參考書：

1、《基因工程原理》吳乃虎主編

2、《植物基因工程原理與技術(shù)》王關(guān)林主編基因工程原理與技術(shù)83第一章緒論第一節(jié)基因工程的概念基因工程(geneengineering)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容。

基因工程是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，是指將一種或多種生物體的基因分離出來或人工合成基因，按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞中遺傳表達(dá)并獲得新的遺傳性狀而形成新的生物類型的生物技術(shù)。

基因工程的核心內(nèi)容是基因體外重組(DNA體外重組)?；蚬こ痰乃拇笠?或基本條件)：目的基因、載體、工具酶、受體。

相關(guān)名詞：遺傳工程、基因工程、基因操作、重組DNA技術(shù)、分子克隆、基因克隆、基因無性繁殖?；蚬こ痰耐怀鎏攸c(diǎn)：打破物種間基因交流的界限。

第一章緒論84第二節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展

基因工程誕生于1973年。一、基因工程誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)1、理論基礎(chǔ)

①DNA是遺傳物質(zhì)；

②DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；

③遺傳密碼的通用性和遺傳信息傳遞的方式。2、技術(shù)基礎(chǔ)

①限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割；

②DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；

③基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用。

第二節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展85二、基因工程的誕生1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg研究小組的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)。

1973年，斯坦福大學(xué)的S.Cohen研究小組的DNA體外重組和大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(見下兩張幻燈片)同年，加利福尼亞大學(xué)的H.Boyer也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，1973年被定為基因工程誕生的元年。

二、基因工程的誕生這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，86pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DN87培養(yǎng)平皿卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平板培養(yǎng)平皿卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平88三、基因工程的發(fā)展

分為艱難階段、逐漸成熟階段、迅速發(fā)展階段、鼎盛發(fā)展階段。1、基因工程的艱難階段(1973~1976，載體和受體系統(tǒng)的安全性改造)

基因工程的安全性問題，導(dǎo)致許多國家限制基因重組的實(shí)驗(yàn)。2、基因工程的逐漸成熟階段(1976~1982，基因工程藥物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽(見下圖)；1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功；1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并通過發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素。從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

三、基因工程的發(fā)展89大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目的基因基因載體從動(dòng)物腦中提取5mg---50萬只羊腦9升工程大腸桿菌培養(yǎng)液大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目的基因基因載體903、基因工程的迅速發(fā)展階段(1982~2000，動(dòng)植物基因工程育種與基因治療)

發(fā)展了一系列新的基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了多種轉(zhuǎn)化原核生物和動(dòng)物、植物細(xì)胞的載體。

1982年首次通過顯微注射培育出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因小鼠。

1983年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草。1990年美國政府首次批準(zhǔn)一項(xiàng)人體基因治療臨床研究計(jì)劃，對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷而患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。1991年，美國提出人類基因組計(jì)劃并實(shí)施。3、基因工程的迅速發(fā)展階段(1982~2000，動(dòng)植物基因工914、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))

2019年完成人類基因組計(jì)劃。至今，基因工程藥物上市的有幾十種，上百種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，目前至少有150種轉(zhuǎn)基因植物問世。自從1986年抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草被首次批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)以來,至今國際上已有30個(gè)國家批準(zhǔn)上千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn),涉及的植物種類達(dá)50多種。自從1994年轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿獲準(zhǔn)上市以來，目前至少有51種轉(zhuǎn)基因植物上市。

4、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))92據(jù)國際有關(guān)方面預(yù)測，到20l0年，全世界轉(zhuǎn)基因食物的種植面積將增至10000萬公頃。據(jù)國際有關(guān)方面預(yù)測，到20l0年，全世界93雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉(zhuǎn)基因植物要慢得多！主要原因是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作煩瑣、困難，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要求高，不易再生出個(gè)體。荷蘭的GenPharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉(zhuǎn)94

英國羅斯林研究所研制成功的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治療肺氣腫病。這種病在北美比較常見，病人以前只能依賴于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代療法，價(jià)格昂貴，而現(xiàn)在用轉(zhuǎn)基因羊來生產(chǎn)，每升這種羊奶可售6000美元。英國羅斯林研究所研制成功的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含95

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組獲得5只轉(zhuǎn)基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪稱血友病人救星的藥物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組獲得5只轉(zhuǎn)基因山96第三節(jié)基因工程研究的主要內(nèi)容一、基因工程研究的主要內(nèi)容主要包括：基礎(chǔ)研究（載體的研究、受體系統(tǒng)的研究、目的基因研究、工具酶的研究、轉(zhuǎn)化方法的研究、生物基因組學(xué)研究）和應(yīng)用研究等。1、載體的研究構(gòu)建各種用途載體及提高外源基因表達(dá)的效率。2、受體系統(tǒng)的研究

包括細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物。

受體系統(tǒng)的安全性及轉(zhuǎn)化效率。3、目的基因研究目的基因的分離、克隆及改造。

第三節(jié)基因工程研究的主要內(nèi)容974、工具酶的研究開發(fā)新的工具酶。5、轉(zhuǎn)化方法的研究開發(fā)各種受體細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化方法。6、生物基因組學(xué)研究具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的各種生物的基因組測序、挖掘新的基因等。7、應(yīng)用研究

包括基因工程藥物研究、基因疫苗研究、轉(zhuǎn)基因植物研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究以及在酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用。

4、工具酶的研究98二、基因工程的基本操作程序

①分離獲得帶有目的基因的DNA片段及載體選擇與構(gòu)建。

②限制性核酸內(nèi)切酶分別切割外源DNA和載體。

③通過DNA連接酶將外源基因DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子。

④將重組DNA分子引入到受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化)。

⑤帶有重組體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的擴(kuò)增及選擇培養(yǎng)。

⑥轉(zhuǎn)化體的鑒定，獲得外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞。⑦目的基因的進(jìn)一步研究分析，并設(shè)法使之實(shí)現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)(基因功能研究或基因改造研究)。

二、基因工程的基本操作程序99基因工程原理和技術(shù)-1-2-課件100第四節(jié)基因工程的意義與發(fā)展前景一、基因工程研究的意義①大規(guī)模生產(chǎn)其他生物體內(nèi)含量極微但卻具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物分子；②設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種(新性狀乃至全新物種

)；③搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息資源(基因)。二、基因工程發(fā)展前景基因工程問世以來短短的三十年，顯示出了巨大的活力，基因工程的前景將更加燦爛輝煌。今后，基因工程的重點(diǎn)研究方向是基因組學(xué)、基因工程藥物、動(dòng)植物生物反應(yīng)器和環(huán)保等方面。

第四節(jié)基因工程的意義與發(fā)展前景101第二章基因工程的工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶類。根據(jù)其用途分為四類：限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、修飾酶。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、宿主的限制-修飾現(xiàn)象(見下圖)

限制作用(restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。這是維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

修飾作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。這是宿主細(xì)胞識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的作用機(jī)制。第二章基因工程的工具酶102R/M系統(tǒng)①DNA甲基化酶②限制性核酸內(nèi)切酶R/M系統(tǒng)的作用①限制作用②修飾作用R/M系統(tǒng)1031953年，Arber發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象，預(yù)見限制性核酸內(nèi)切酶的存在；1970年，H.O.Smith從流感嗜血桿菌中分離出第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII。Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。1953年，Arber發(fā)現(xiàn)限制-修飾現(xiàn)象，預(yù)104基因工程原理和技術(shù)-1-2-課件105

根據(jù)限制-修飾系統(tǒng)的遺傳分析，大腸桿菌K12有以下4種表型：①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修飾功能。②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修飾功能，這類突變株經(jīng)常用于基因工程的受體。③rk-mk-：限制和修飾缺陷型，既無限制功能，又無修飾功能，也常用于基因工程的受體。④rk+mk-：修飾缺陷型，缺乏修飾自身DNA的功能，但具有限制功能，故也稱為“自殺性表型”(suicidephenotype)。根據(jù)限制-修飾系統(tǒng)的遺傳分析，大腸桿菌K12有106二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型

限制性核酸內(nèi)切酶是指一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。

簡稱限制性內(nèi)切酶或限制性酶，目前已經(jīng)鑒定出三種不同類型。至今，已發(fā)現(xiàn)近4000種限制酶。rebase.neb特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)功能輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)切割方式應(yīng)用價(jià)值舉例異源三聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割無EcoK、EcoB同源三聚體限制Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割廣泛EcoRI、HindIII…異源二聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割小EcoPI二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)異源三聚107三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系統(tǒng)，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改。①限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母(大寫，斜體)代表該酶的宿主菌屬名(genus)第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)前兩個(gè)字母。②第四個(gè)字母代表宿主菌的菌株名的第一個(gè)字母(小寫，正體)或染色體外成分(質(zhì)?；蚴删w，大寫，正體)。③若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示(正體)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名108四、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性1、II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列

一般為4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，稱為稀有切割限制酶。有些為反向重復(fù)序列(間斷回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的識(shí)別序列中，某一位或二位堿基并非嚴(yán)格專一，如HindII可識(shí)別4種核苷酸序列。

酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG四、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列Ba1092、II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶均在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位的酯鍵，產(chǎn)生3’端為羥基、5’端為磷酸基團(tuán)的片段。有三種切割方式：①在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的5’末端切割，產(chǎn)生5’黏性末端，如EcoRI2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式110②在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的3’端切割，則產(chǎn)生3’黏性末端，如PstI②在識(shí)別序列的對(duì)稱軸的3’端切割，則產(chǎn)生3’黏性末端，111③在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如PvuII有些識(shí)別序列為間斷型回文序列的II限制酶，其切點(diǎn)位于不確定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC③在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如PvuII112有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別序列，如MboII識(shí)別GAAGA序列，切割位點(diǎn)則是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指識(shí)別序列相同、切割方式相同或不同、來源不同的II限制性核酸內(nèi)切酶。如：HpaII與MspI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)都相同(C↓CGG)，但MspI還可以識(shí)別已甲基化的序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不同。有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離113同尾酶是指來源各異、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的黏性末端的II限制性核酸內(nèi)切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸內(nèi)功酶不具有甲基化功能如EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶與EcoRI甲基化酶，兩者均識(shí)別GAATTC序列，而前者能對(duì)G↓AATTC序列進(jìn)行切割，后者的作用是使第二個(gè)A甲基化。目前已經(jīng)分離到許多II型限制性核酸內(nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)的甲基化酶。同尾酶是指來源各異、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同1144、II型限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的切割有一些II限制性核酸內(nèi)切酶，除雙鏈DNA外，還可以特異識(shí)別并切割單鏈DNA的相應(yīng)位點(diǎn)，只是切割效率比較低。如HhaI能切割單鏈?zhǔn)删wФX174和M13mp18DNA，只是切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途①產(chǎn)生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重組克隆；②建立DNA分子的限制酶圖譜；③構(gòu)建基因文庫；④構(gòu)建載體。4、II型限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的切割115六、II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)1、標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的建立

反應(yīng)體積一般為20μl(根據(jù)DNA量可適當(dāng)擴(kuò)大)。

①10×酶切緩沖液2μl(大部分酶反應(yīng)緩沖液基本相似：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根據(jù)酶活力大小及工作性質(zhì)確定酶量，不超過反應(yīng)總體積10％

③DNA樣品(μ

g~mg)④無菌水

限制性核酸內(nèi)切酶的一個(gè)活力單位(U)為：在合適的溫度和緩沖液中，在20μ

L反應(yīng)體系中，1h完全降解1ug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需要的酶量。六、II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)1162、酶解反應(yīng)①混勻②酶解(溫度、時(shí)間)③酶解鑒定④終止a、加EDTA至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；c、65℃水浴保溫20min(有些最適反應(yīng)溫度較高的酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的不完全酶解(見下圖)不完全酶解對(duì)于構(gòu)建物理圖譜和基因組文庫是非常必要的。其方法有減少酶量、增加反應(yīng)體積、縮短反應(yīng)時(shí)間和降低反應(yīng)溫度等。

2、酶解反應(yīng)117incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3incomplete1231+3incompletedig1184、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)①商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶；②加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過5%時(shí)將會(huì)抑制酶的活性；③整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶；④盡可能使反應(yīng)體積減到最小，即盡可能少加水；⑤當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量；⑥當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液。若沒有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。4、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)119七、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性與酶切效果的因素

1、酶的純度；要求不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染。

2、DNA樣品的純度；DNA樣品中的蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。樣品中DNase會(huì)降解DNA，影響酶切。3、酶切反應(yīng)的溫度、時(shí)間；多數(shù)II型限制酶最適反應(yīng)溫度是37℃，但