FISH檢測標(biāo)本要求課件

FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用中山大學(xué)腫瘤防治中心分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室王芳邵建永FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用中山大學(xué)1細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交觀察：熒光顯微鏡原位觀察（細(xì)胞、組織）細(xì)胞核彩色探針信號目的：獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。

Fluorescenceinsituhybridization（FISH）細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)Fluorescenceinsituh2用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交原理用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中3FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合，可成功地幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析方法敏感，能迅速得到結(jié)果，24小時(shí)就可以完成檢測標(biāo)本來源豐富，間期細(xì)胞，分裂中期細(xì)胞、分化或未分化細(xì)胞及死亡或存活的細(xì)胞皆可以被檢測FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合4centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaintCSP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針WPP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針FISH探針的種類centromeretelomeresubtelomer5操作流程簡圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利于探針雜交。蛋白酶消化、HCl處理變性雜交洗滌復(fù)染操作流程簡圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利6FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用7乳腺癌

Her-2基因致癌基因：Her-2基因；位點(diǎn)：17q11.2-q12；編碼蛋白：跨膜蛋白（與表皮生長因子受體部分同源）；25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增；HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。乳腺癌Her-2基因致癌基因：Her-2基因；8Her-2基因的檢測方法檢測方法檢測指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHer-2蛋白費(fèi)用低光鏡即可觀察結(jié)果準(zhǔn)確性差，主觀性強(qiáng)，假陽性率高CISHHer-2DNA光鏡即可觀察結(jié)果對低度擴(kuò)增及染色體非整倍擴(kuò)增檢測靈敏度下降FISHHer-2DNA對于低倍、高倍染色體非整倍性擴(kuò)增檢測準(zhǔn)確性高，靈敏度特異性好，結(jié)果判斷客觀相對費(fèi)用較高Her-2基因的檢測方法檢測方法檢測指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHer9疾病名稱檢測探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLPHer2/CSP17

紅/綠Her2：17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1

CSP17:17號染色體著絲粒正常:2紅/2綠異常:紅信號大于2為異常細(xì)胞(綠色信號不少于2個(gè)的細(xì)胞)Her-2基因FISH

探針組疾病檢測探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLPHer210DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌11結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個(gè)細(xì)胞）

Ratio值＝20個(gè)細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/綠信號總數(shù)

Ratio＜1.8為陰性結(jié)果

Ratio＞2.2或眾多信號連接成簇時(shí)可不計(jì)算為陽性結(jié)果

比值2～4為低度擴(kuò)增4～10為中度擴(kuò)增>10為高度擴(kuò)增Ratio在1.8-2.2之間時(shí)，則需要再計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞核中的信號。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報(bào)告中注明。結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個(gè)細(xì)胞）12A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（R>10，高度擴(kuò)增）C.須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（R13Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時(shí)綠信號非整倍體R<1.8，無擴(kuò)增紅信號與綠信號均為兩點(diǎn)，R=1Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時(shí)綠信號非整倍體R<14熒光原位雜交與免疫組化檢測Her-2結(jié)果比較熒光原位雜交與免疫組化檢測Her-2結(jié)果比較15我實(shí)驗(yàn)室已完成病例小結(jié)IHC01+2+3+FISH無擴(kuò)增

1334020擴(kuò)增

22102943總數(shù)(n=15)(n=5)(n=14)(n=29)（n=63）Her2表達(dá)IHC（2+）標(biāo)本中，基因擴(kuò)增率為71.41%Her2表達(dá)IHC（3+）標(biāo)本中，基因擴(kuò)增率為100%（文獻(xiàn)報(bào)道：90-95%）我實(shí)驗(yàn)室已完成病例小結(jié)IHC01+16>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對比圖×40×100住院號：177319浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：+++FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增×100>30%的腫瘤細(xì)胞全部免疫組化（3+）與FISH對比圖×417免疫組化（2+）與FISH對比圖1.>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色×40住院號：175465浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：++FISH：Ratio>5，中度擴(kuò)增×100免疫組化（2+）與FISH對比圖1.>30%的腫瘤細(xì)胞全部18免疫組化（2+）與FISH對比圖2.>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色×40×100住院號：176921浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：++FISH：Ratio＝1.45，無擴(kuò)增免疫組化（2+）與FISH對比圖2.>30%的腫瘤細(xì)胞全部19>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖1×40×100住院號：175689浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：+FISH：Ratio＝1.62，無擴(kuò)增>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖120免疫組化（1+）與FISH對比圖2×40×100住院號：175895浸潤性導(dǎo)管癌Ⅲ級IHC：+FISH：簇狀擴(kuò)增>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖2×40×100住院號：1721免疫組化（－）與FISH對比圖1×100×40住院號：176846浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：－FISH：Ratio＝1.02，Her2基因無擴(kuò)增<30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色或不著色免疫組化（－）與FISH對比圖1×100×40住院號：17622免疫組化（－）與FISH對比圖2住院號：175472浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：－FISH：呈簇狀擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞不著色×40×100免疫組化（－）與FISH對比圖2住院號：175472腫瘤細(xì)胞23評價(jià)17號染色體的意義

17號染色體非整倍性：每個(gè)細(xì)胞中17號染色體多于或少于2個(gè)；乳腺癌遺傳學(xué)特征之一，可能預(yù)示預(yù)后不良；

17號染色體多體性是導(dǎo)致IHC3+但FISH檢測為陰性的主要原因；我實(shí)驗(yàn)室完成病例中17號染色體非整倍性發(fā)生率為33.3%。評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時(shí)應(yīng)考慮

17號染色體數(shù)目的變化評價(jià)17號染色體的意義

評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時(shí)應(yīng)考慮24IHC與FISH結(jié)果不一致原因分析IHC判斷標(biāo)準(zhǔn)的主觀性

內(nèi)對照探針——17號染色體著絲粒探針的建立，排除IHC假陰性

IHC2+及3+的基因檢測結(jié)果分離，無法控制由于17號染色體多體性造成假性擴(kuò)增

IHC自身無法克服的缺陷基因擴(kuò)增是Herceptin使用的關(guān)鍵性指標(biāo)IHC與FISH結(jié)果不一致原因分析IHC判斷標(biāo)準(zhǔn)的主觀性基25Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH方法檢測—1+3+2+—+Herceptin治療+再用FISH方法檢測Herceptin治療FISH檢測+—再用FISH方法檢測+Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH—1+26乳腺癌HER2FISH檢測報(bào)告模板乳腺癌HER2FISH檢測報(bào)告模板27FISH技術(shù)檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應(yīng)用FISH技術(shù)檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應(yīng)用28淋巴瘤的診斷與分型難HE＋I(xiàn)HC+cytogenesis=

解決!淋巴瘤的診斷與分型難HE＋I(xiàn)HC+cytogenesis29

不同類型的淋巴瘤有各自不同的染色體易位使控制細(xì)胞發(fā)育分化過程中的關(guān)鍵蛋白失活與淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)不同類型的淋巴瘤有各自不同的染色體易位使控制細(xì)胞發(fā)育分化過30IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)染色體易位IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)染色體易位IGH/CCND1t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色體易位IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色體易位BCR/ABLt(9;22)染色體易位【費(fèi)城染色體】目前開展的染色體易位檢測（6種）：IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)31

t(14;18)(q32;q21)

染色體易位意義：

t(14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能編碼完整BCL2蛋白，IGH基因附近的增強(qiáng)子使BCL2過表達(dá)

t(14;18)為FL的標(biāo)志（低級別更易出現(xiàn)）,檢出率達(dá)93%～100%DLBCL20%～

30%出現(xiàn)易位影響檢出率的原因：

石蠟標(biāo)本中DNA的降解

FL3b接近DLBCL，其易位率低，影響總體檢出率t(14;18)(q32;q21)染色體易位意義：3253CregionVregionJregion14q32region3MCRMBR18q21regionIGH/BCL2DualColor,DualFusionTranslocationProbe

53CregionVregionJregion14q33探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合易位探針雜交后顯示1O1G2F信號細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合易位探針雜交后顯示2O2G信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位

IGH

/BCL2green/orange

IGH:

14q32

BCL2:

18q21

正常:2O/2G異常:1O/1G/1F陽性標(biāo)準(zhǔn):>7%的細(xì)胞出現(xiàn)黃色融合信號探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合細(xì)胞核I34病例1：會診84363，男，74y腹腔腫物；FISH：54%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：FLⅡ~Ⅲ。4×40×100×病例1：會診84363，男，74y4×40×100×35病例2：會診84362，女、36頸部腫物抗炎治療后（出現(xiàn)變性壞死）診斷：DLBCLFISH：陽性，10%的細(xì)胞可見融合信號

40×IHC:BCL2100×病例2：會診84362，女、3640×IHC:BCL210036

t(8;14)(q24;q32)

染色體易位意義：

t(8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能編碼完整MYC蛋白，IGH基因附近的增強(qiáng)子使MYC過表達(dá)應(yīng)用范圍：所有Burkitt淋巴瘤都有t(8;14)易位診斷不典型Burkitt淋巴瘤須有t(8;14)易位的MYC異?？梢娪诶^發(fā)于濾泡性淋巴瘤的前驅(qū)B淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤t(8;14)(q24;q32)染色體易位意義：37MYC8q24region14q32regionCregionVregionVregionCregionIGH/MYC,CEP8TriColor,DualFusionTranslocationProbe

MYC8q24region14q32regionCre38探針雜交示意圖正常細(xì)胞核IGH/MYC,CEP8

三色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G2A信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位LSIIGH

green14q32

LSIMYC

orange8q24CEP8

aqua8p11.1-q11.1正常:2G/2O/2A異常:1G/1R/2F/1A或>2A腫瘤細(xì)胞核IGH/MYC雙色雙融合易位探針雜交后顯示1O1G2F信號探針雜交示意圖正常細(xì)胞核IGH/MYC,CEP8三色雙融3910×40×病例3:399318，女、5y頸淋巴結(jié)活檢；

ISH:EBERs（+）；

FISH:45%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：散發(fā)性經(jīng)典型BL。10×40×病例3:399318，女、5y40病例4:405618，女，21y盆腔腫物穿刺；

ISH:EBERs（+）；

FISH:23%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：考慮為散發(fā)性經(jīng)典型BL。4×40×

活檢穿刺標(biāo)本病例4:405618，女，21y4×40×活檢穿刺標(biāo)本41病例5:399625，男、42yISH:EBERs（-）；

經(jīng)多學(xué)科大會診；診斷：較符合散發(fā)性非典型BL；FISH:25%的細(xì)胞可見融合信號；

4×40×

活檢穿刺標(biāo)本病例5:399625，男、42y4×40×活檢穿刺標(biāo)本42t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位意義

t(11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增強(qiáng)子使CyclinD1過表達(dá)應(yīng)用范圍套細(xì)胞淋巴瘤的診斷性指標(biāo)也出現(xiàn)過零星其它淋巴瘤t(11;14)易位的檢出t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位意義43IGH/CCND1DualColor,DualFusionTranslocationProbe

11q13region14q32regionCregionVregionJchainIGH/CCND1DualColor,DualFusi44簡潔示意圖簡潔示意圖45探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交后顯示1R1G2F信號細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位

IGH/CCND1green/orange

IGH:14q32

CCND1:

11q13

正常:2O/2G異常:1O/1G/2F探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融細(xì)胞核IG4610×40×IHC:CyclinD1病例6:393301，男，40y；肘部腫物；

IHC：CyclinD1弱陽性；經(jīng)科內(nèi)會診；

FISH:21%的細(xì)胞可見融合信號；診斷：MCL10×40×IHC:CyclinD1病例6:393301，47所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號（×100）所示箭頭為染色體易位4810×CyclinD140×病例7:386766，女，67y扁桃體活檢2塊，直徑0.3CM

IHC：CyclinD1弱陽性；

FISH:45%的細(xì)胞可見融合信號；診斷：不排除MCL的可能，重取活檢；形態(tài)不典型+IHC不理想10×CyclinD140×病例7:386766，女，6749所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號（×100）所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號（×100）50FISH檢測標(biāo)本要求課件51FISH檢測標(biāo)本要求新鮮活檢或手術(shù)切除標(biāo)本；石蠟包埋組織或石蠟切片（3－5um）；腫瘤穿刺活檢組織或細(xì)胞涂片；骨髓穿刺組織盡量送涂片，不用活檢組織（因?yàn)槊撯}需要使用鹽酸，破壞DNA）；腫瘤細(xì)胞陽性的胸腹水涂片；一般在3個(gè)工作日后可以發(fā)出檢測報(bào)告；FISH檢測標(biāo)本要求新鮮活檢或手術(shù)切除標(biāo)本；52EBV-DNA定量PCR結(jié)果的穩(wěn)定性分析EBV-DNA定量PCR結(jié)果的穩(wěn)定性分析53EBV-DNA定量PCR標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增曲線107106105104EBV-DNA定量PCR標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增曲線107106105154鼻咽癌檢測結(jié)果比較5個(gè)不同樣品重復(fù)檢測；擴(kuò)增可靠性99.4%；每個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行5次重復(fù)，結(jié)果重復(fù)性很好；同時(shí)擴(kuò)增，結(jié)果存在顯著差異的為8％；不同時(shí)間擴(kuò)增，結(jié)果存在顯著差異的為6.7％。鼻咽癌檢測結(jié)果比較5個(gè)不同樣品重復(fù)檢測；555個(gè)樣品，每個(gè)樣品分5管抽提DNA后，同時(shí)進(jìn)行定量PCR檢測結(jié)果86987±21134(24%)62902.67786.2834080716EB0782113.151026.4144080716EB0788629.721107.8715080716EB0780556.481006.95605080716EB07120732.721509.159080716EB076579±2729(41%)7632.0595.40062080716EB061822.5322.78165080716EB068748.75109.359375080716EB067055.7888.19726080716EB067633.7695.42204080716EB06138±370(268%)0.000080716EB050.000080716EB050.000080716EB05827.3410.341734080716EB050.000080716EB05FinalresultsQuantitySampleName3335827±485146(14%)3038537.2037981.715080716EB093244077.6040550.97080716EB093300465.2841255.816080716EB094161768.8052022.11080716EB092934283.7636678.547080716EB09489681±47968(10%)497186.246214.828080716EB08498939.186236.7397080716EB08458680.945733.5117080716EB08433556.405419.455080716EB08560041.807000.5225080716EB085個(gè)樣品，每個(gè)樣品分5管抽提DNA后，同時(shí)進(jìn)行定量PCR檢測56×102×103×104×105×106×102×103×104×105×106575個(gè)樣品，每個(gè)樣品分3管，在不同時(shí)間（相隔一個(gè)星期）分別抽提DNA后，進(jìn)行定量PCR檢測結(jié)果5個(gè)樣品，每個(gè)樣品分3管，在不同時(shí)間（相隔一個(gè)星期）分別抽提58×103×103×104×105×1065個(gè)樣品，每個(gè)樣品分3管，在不同時(shí)間（相隔一個(gè)星期）分別抽提DNA后，進(jìn)行定量PCR檢測結(jié)果×103×103×104×105×1065個(gè)樣品，59Thankyouforyourattention!!Thankyouforyourattention!!60FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用中山大學(xué)腫瘤防治中心分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室王芳邵建永FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用中山大學(xué)61細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交觀察：熒光顯微鏡原位觀察（細(xì)胞、組織）細(xì)胞核彩色探針信號目的：獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。

Fluorescenceinsituhybridization（FISH）細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)Fluorescenceinsituh62用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交原理用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中63FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合，可成功地幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析方法敏感，能迅速得到結(jié)果，24小時(shí)就可以完成檢測標(biāo)本來源豐富，間期細(xì)胞，分裂中期細(xì)胞、分化或未分化細(xì)胞及死亡或存活的細(xì)胞皆可以被檢測FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合64centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaintCSP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針WPP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針FISH探針的種類centromeretelomeresubtelomer65操作流程簡圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利于探針雜交。蛋白酶消化、HCl處理變性雜交洗滌復(fù)染操作流程簡圖制片預(yù)處理FISH結(jié)果分析破壞細(xì)胞膜利66FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用FISH技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用67乳腺癌

Her-2基因致癌基因：Her-2基因；位點(diǎn)：17q11.2-q12；編碼蛋白：跨膜蛋白（與表皮生長因子受體部分同源）；25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增；HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。乳腺癌Her-2基因致癌基因：Her-2基因；68Her-2基因的檢測方法檢測方法檢測指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHer-2蛋白費(fèi)用低光鏡即可觀察結(jié)果準(zhǔn)確性差，主觀性強(qiáng)，假陽性率高CISHHer-2DNA光鏡即可觀察結(jié)果對低度擴(kuò)增及染色體非整倍擴(kuò)增檢測靈敏度下降FISHHer-2DNA對于低倍、高倍染色體非整倍性擴(kuò)增檢測準(zhǔn)確性高，靈敏度特異性好，結(jié)果判斷客觀相對費(fèi)用較高Her-2基因的檢測方法檢測方法檢測指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHer69疾病名稱檢測探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLPHer2/CSP17

紅/綠Her2：17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1

CSP17:17號染色體著絲粒正常:2紅/2綠異常:紅信號大于2為異常細(xì)胞(綠色信號不少于2個(gè)的細(xì)胞)Her-2基因FISH

探針組疾病檢測探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLPHer270DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌DAPI染色后與HE切片對比圖觀察浸潤部分導(dǎo)管內(nèi)癌71結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個(gè)細(xì)胞）

Ratio值＝20個(gè)細(xì)胞核中紅信號總數(shù)/綠信號總數(shù)

Ratio＜1.8為陰性結(jié)果

Ratio＞2.2或眾多信號連接成簇時(shí)可不計(jì)算為陽性結(jié)果

比值2～4為低度擴(kuò)增4～10為中度擴(kuò)增>10為高度擴(kuò)增Ratio在1.8-2.2之間時(shí)，則需要再計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞核中的信號。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測報(bào)告中注明。結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤性部分的20個(gè)細(xì)胞）72A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（R>10，高度擴(kuò)增）C.須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（R73Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時(shí)綠信號非整倍體R<1.8，無擴(kuò)增紅信號與綠信號均為兩點(diǎn)，R=1Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號數(shù)>2，同時(shí)綠信號非整倍體R<74熒光原位雜交與免疫組化檢測Her-2結(jié)果比較熒光原位雜交與免疫組化檢測Her-2結(jié)果比較75我實(shí)驗(yàn)室已完成病例小結(jié)IHC01+2+3+FISH無擴(kuò)增

1334020擴(kuò)增

22102943總數(shù)(n=15)(n=5)(n=14)(n=29)（n=63）Her2表達(dá)IHC（2+）標(biāo)本中，基因擴(kuò)增率為71.41%Her2表達(dá)IHC（3+）標(biāo)本中，基因擴(kuò)增率為100%（文獻(xiàn)報(bào)道：90-95%）我實(shí)驗(yàn)室已完成病例小結(jié)IHC01+76>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對比圖×40×100住院號：177319浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：+++FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增×100>30%的腫瘤細(xì)胞全部免疫組化（3+）與FISH對比圖×477免疫組化（2+）與FISH對比圖1.>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色×40住院號：175465浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：++FISH：Ratio>5，中度擴(kuò)增×100免疫組化（2+）與FISH對比圖1.>30%的腫瘤細(xì)胞全部78免疫組化（2+）與FISH對比圖2.>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色×40×100住院號：176921浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：++FISH：Ratio＝1.45，無擴(kuò)增免疫組化（2+）與FISH對比圖2.>30%的腫瘤細(xì)胞全部79>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖1×40×100住院號：175689浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：+FISH：Ratio＝1.62，無擴(kuò)增>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖180免疫組化（1+）與FISH對比圖2×40×100住院號：175895浸潤性導(dǎo)管癌Ⅲ級IHC：+FISH：簇狀擴(kuò)增>30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對比圖2×40×100住院號：1781免疫組化（－）與FISH對比圖1×100×40住院號：176846浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：－FISH：Ratio＝1.02，Her2基因無擴(kuò)增<30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色或不著色免疫組化（－）與FISH對比圖1×100×40住院號：17682免疫組化（－）與FISH對比圖2住院號：175472浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：－FISH：呈簇狀擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞不著色×40×100免疫組化（－）與FISH對比圖2住院號：175472腫瘤細(xì)胞83評價(jià)17號染色體的意義

17號染色體非整倍性：每個(gè)細(xì)胞中17號染色體多于或少于2個(gè)；乳腺癌遺傳學(xué)特征之一，可能預(yù)示預(yù)后不良；

17號染色體多體性是導(dǎo)致IHC3+但FISH檢測為陰性的主要原因；我實(shí)驗(yàn)室完成病例中17號染色體非整倍性發(fā)生率為33.3%。評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時(shí)應(yīng)考慮

17號染色體數(shù)目的變化評價(jià)17號染色體的意義

評價(jià)Her-2基因狀態(tài)的同時(shí)應(yīng)考慮84IHC與FISH結(jié)果不一致原因分析IHC判斷標(biāo)準(zhǔn)的主觀性

內(nèi)對照探針——17號染色體著絲粒探針的建立，排除IHC假陰性

IHC2+及3+的基因檢測結(jié)果分離，無法控制由于17號染色體多體性造成假性擴(kuò)增

IHC自身無法克服的缺陷基因擴(kuò)增是Herceptin使用的關(guān)鍵性指標(biāo)IHC與FISH結(jié)果不一致原因分析IHC判斷標(biāo)準(zhǔn)的主觀性基85Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH方法檢測—1+3+2+—+Herceptin治療+再用FISH方法檢測Herceptin治療FISH檢測+—再用FISH方法檢測+Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH—1+86乳腺癌HER2FISH檢測報(bào)告模板乳腺癌HER2FISH檢測報(bào)告模板87FISH技術(shù)檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應(yīng)用FISH技術(shù)檢測染色體易位在淋巴瘤分型中的應(yīng)用88淋巴瘤的診斷與分型難HE＋I(xiàn)HC+cytogenesis=

解決!淋巴瘤的診斷與分型難HE＋I(xiàn)HC+cytogenesis89

不同類型的淋巴瘤有各自不同的染色體易位使控制細(xì)胞發(fā)育分化過程中的關(guān)鍵蛋白失活與淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)不同類型的淋巴瘤有各自不同的染色體易位使控制細(xì)胞發(fā)育分化過90IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)染色體易位IGH/MYCt(8;14)(q24;q32)染色體易位IGH/CCND1t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位API2/MALT1t(11;18)(q21;q21)染色體易位IGH/MALT1t(14;18)(q32;q21)染色體易位BCR/ABLt(9;22)染色體易位【費(fèi)城染色體】目前開展的染色體易位檢測（6種）：IGH/BCL2t(14;18)(q32;q21)91

t(14;18)(q32;q21)

染色體易位意義：

t(14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能編碼完整BCL2蛋白，IGH基因附近的增強(qiáng)子使BCL2過表達(dá)

t(14;18)為FL的標(biāo)志（低級別更易出現(xiàn)）,檢出率達(dá)93%～100%DLBCL20%～

30%出現(xiàn)易位影響檢出率的原因：

石蠟標(biāo)本中DNA的降解

FL3b接近DLBCL，其易位率低，影響總體檢出率t(14;18)(q32;q21)染色體易位意義：9253CregionVregionJregion14q32region3MCRMBR18q21regionIGH/BCL2DualColor,DualFusionTranslocationProbe

53CregionVregionJregion14q93探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合易位探針雜交后顯示1O1G2F信號細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合易位探針雜交后顯示2O2G信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位

IGH

/BCL2green/orange

IGH:

14q32

BCL2:

18q21

正常:2O/2G異常:1O/1G/1F陽性標(biāo)準(zhǔn):>7%的細(xì)胞出現(xiàn)黃色融合信號探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/BCL2雙色雙融合細(xì)胞核I94病例1：會診84363，男，74y腹腔腫物；FISH：54%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：FLⅡ~Ⅲ。4×40×100×病例1：會診84363，男，74y4×40×100×95病例2：會診84362，女、36頸部腫物抗炎治療后（出現(xiàn)變性壞死）診斷：DLBCLFISH：陽性，10%的細(xì)胞可見融合信號

40×IHC:BCL2100×病例2：會診84362，女、3640×IHC:BCL210096

t(8;14)(q24;q32)

染色體易位意義：

t(8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能編碼完整MYC蛋白，IGH基因附近的增強(qiáng)子使MYC過表達(dá)應(yīng)用范圍：所有Burkitt淋巴瘤都有t(8;14)易位診斷不典型Burkitt淋巴瘤須有t(8;14)易位的MYC異?？梢娪诶^發(fā)于濾泡性淋巴瘤的前驅(qū)B淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤t(8;14)(q24;q32)染色體易位意義：97MYC8q24region14q32regionCregionVregionVregionCregionIGH/MYC,CEP8TriColor,DualFusionTranslocationProbe

MYC8q24region14q32regionCre98探針雜交示意圖正常細(xì)胞核IGH/MYC,CEP8

三色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G2A信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位LSIIGH

green14q32

LSIMYC

orange8q24CEP8

aqua8p11.1-q11.1正常:2G/2O/2A異常:1G/1R/2F/1A或>2A腫瘤細(xì)胞核IGH/MYC雙色雙融合易位探針雜交后顯示1O1G2F信號探針雜交示意圖正常細(xì)胞核IGH/MYC,CEP8三色雙融9910×40×病例3:399318，女、5y頸淋巴結(jié)活檢；

ISH:EBERs（+）；

FISH:45%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：散發(fā)性經(jīng)典型BL。10×40×病例3:399318，女、5y100病例4:405618，女，21y盆腔腫物穿刺；

ISH:EBERs（+）；

FISH:23%的細(xì)胞可見融合信號；

診斷：考慮為散發(fā)性經(jīng)典型BL。4×40×

活檢穿刺標(biāo)本病例4:405618，女，21y4×40×活檢穿刺標(biāo)本101病例5:399625，男、42yISH:EBERs（-）；

經(jīng)多學(xué)科大會診；診斷：較符合散發(fā)性非典型BL；FISH:25%的細(xì)胞可見融合信號；

4×40×

活檢穿刺標(biāo)本病例5:399625，男、42y4×40×活檢穿刺標(biāo)本102t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位意義

t(11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增強(qiáng)子使CyclinD1過表達(dá)應(yīng)用范圍套細(xì)胞淋巴瘤的診斷性指標(biāo)也出現(xiàn)過零星其它淋巴瘤t(11;14)易位的檢出t(11;14)(q13;

q32)

染色體易位意義103IGH/CCND1DualColor,DualFusionTranslocationProbe

11q13region14q32regionCregionVregionJchainIGH/CCND1DualColor,DualFusi104簡潔示意圖簡潔示意圖105探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交后顯示1R1G2F信號細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G信號檢測探針標(biāo)記顏色探針定位

IGH/CCND1green/orange

IGH:14q32

CCND1:

11q13

正常:2O/2G異常:1O/1G/2F探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融細(xì)胞核IG10610×40×IHC:CyclinD1病例6:393301，男，40y；肘部腫物；

IHC：CyclinD1弱陽性；經(jīng)科內(nèi)會診；

FISH:21%的細(xì)胞可見融合信號；診斷：MCL10×40×IHC:CyclinD1病例6:393301，107所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號（×100）所示箭頭為染色體易位10810×CyclinD140×病例7:386766，女，67y扁桃體活檢2