PCR與DNA提取一般方法-課件

PCR原理+流程烏桕DNA提取方法國內外相關文章PCR原理+流程烏桕DNA提取方法

PCR原理聚合酶鏈式反應簡稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction）(又稱：多聚酶鏈式反應），聚合酶鏈式反應，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增。又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。PC特點具有特異性強靈敏度高操作簡便省時等特點。特點具有特異性強用途可用于基因分離克隆和核酸序列分析等基礎研究還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方用途可用于基因分離(1)擴增各種蛋白的基因：(2)PCR后的測序：可以很快地測出常規(guī)的PCR產(chǎn)物或單鏈的DNA序列(3)用于分子進化和種系發(fā)育的研究，研究其分子進化及種系發(fā)育是很有用的4)分析和診斷遺傳性疾病(5)對人類HLA基因的多肽性分析，對于某些基因突變，如腫瘤發(fā)生的研究等均很有用。(1)擴增各種蛋白的基因：主要過程PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成主要過程PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成

模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至92℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作PCR的反應動力學

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR的反應動力學PCR擴增物PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。PCR擴增物PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部所需材料1.試劑和溶液(1)10×PCR緩沖液500mM氯化鉀100mMTris-Cl(室溫時pH8.3)15mM氯化鎂(2)10mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液－含有所有四種dNTPs(pH8.0)所需材料1.試劑和溶液3)耐熱的DNA聚合酶：①TaqDNA聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有5’→3’DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’外切酶活性。②rTthDNA聚合酶是Thermusthermophilus(Tth)和Thermococcuslitoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有5’→3’DNA聚合酶和3’→5’外切酶(校正)的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產(chǎn)量。3)耐熱的DNA聚合酶：(4)瓊脂糖凝膠(5)10μM的上游和下游引物(6)DNA模板(7)對照DNA(含有靶序列的DNA)(8)DNA長度標準參照物(4)瓊脂糖凝膠2.設備(1)0.2mlPCR擴增管2.設備(1)0.2mlPCR擴增管(2)可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)(2)可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)實驗操作1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴增管中：

成分

體積終濃度10×PCR緩沖液5μl1×10mMdNTP溶液(pH8.0)

1μl每種0.2mM10μM上游引物2.5μl0.5μM10μM下游引物2.5μl0.5μM5單位/μl耐熱DNA聚合酶0.5μl2.5單位DNA模板1-10μl1pg-1μg消毒的蒸餾水至50μl實驗操作1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴增管中2．將小管中的混合物混勻并加入50μl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。3．蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。2．將小管中的混合物混勻4．小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94oC溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。4．小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94oC溫育3分鐘，以使模5.按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：變性94oC30秒退火55oC30秒延伸72oC1分鐘/1kb5.按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：6．72oC溫育PCR樣本10分鐘，可于4oC維持。樣本可貯存于-20oC直至使用。7．采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標準的DNA作參照。6．72oC溫育PCR樣本10分鐘，可于4oC維持。樣本可貯

電泳電泳

PCR熒光定量PCR熒光定量

結果結果PCR與DNA提取一般方法-課件植物DNA提取方法1.CTAB法2.SDS法3.高鹽法植物DNA提取方法1.CTAB法烏桕DNA提取方法1.CTAB法2.SDS法烏桕DNA提取方法1.CTAB法

CTAB法提取植物基因組DNA這種方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的簡便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖類物質分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。CTAB法提取植物基因組DNA這種方法是由Mu一材料、試劑和儀器1材料新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料葉子和種子的胚乳為材料一材料、試劑和儀器1材料2試劑(1)2×CTAB溶液CTAB(W/V)2%Tris-HCL100MMOL/LPH8EDTA20MMOLPH8NACL1.4MOL/LPVP1%滅菌備用2試劑(1)2×CTAB溶液(2)氯仿/異戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)乙醇或異丙醇(5)β-巰基乙醇（6）氯仿/異戊醇（25/24/1）（7）70%乙醇(2)氯仿/異戊醇（24:1）3.儀器:a、離心機3.儀器:a、離心機b、恒溫水浴b、恒溫水浴c、電泳裝置c、電泳裝置實驗步驟1.在2mL離心管中，加入500μl的2×CTAB和20μlβ-巰基乙醇,65℃預熱。2、嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到預熱的離心管中，總體積達到1mL混勻后置65℃水浴中保溫45-60min，并不時輕輕轉動試管。注：凍存材料直接研磨，絕對不能化凍。而且粉末應在化凍前轉移否則內源性Dnase有可能降解基因組DNA。實驗步驟1.在2mL離心管中，加入500μl的2×CTAB和3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000rpm離心10min，移上清至另一新管中。4.向管中加入1/100體積的RNaseA溶液，置37℃20-30min。5.加入2倍體積的100%乙醇或0.7倍體積異丙醇，會出現(xiàn)絮狀沉淀，-20℃放置30min或-80℃放置10min，12000rpm離心10-15min回收DNA沉淀。6.用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌ddH2O中。7.0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下1000SDS法原理：SDS（十二烷基苯磺酸鈉）是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，同時SDS與蛋白質和多糖結合成復合物，釋放出核酸；通過提高鹽濃度并降低溫度，使SDS-蛋白質復合物的溶解度變得更小，從而使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理：SDS（十二烷基

試劑(1)提取緩沖液Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）EDTA50mmol/L（pH8.0）NaCl500mmol/L滅菌后加β-巰基乙醇至10mmol/L試劑(1)提取緩沖液T(2)裂解液20%SDS(3)高鹽溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)異丙醇(6)滅菌ddH2O或TE(2)裂解液20%SDS

實驗程序1、取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。2、向管中加入50μL20%SDS溶液，混勻，不可過于強烈震蕩以防基因組DNA斷裂，65℃保溫10min，并不時搖動。3、加入150μL5mol/LKAc，混勻，置冰上20-30min。實驗程序1、取幼嫩4、4℃,15000rpm離心15min,轉移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30min。5、12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。6、加入1/10體積的RNaseA，37℃保溫20min，除去RNA7、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30min。12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。8、用400μL70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。4、4℃,15000rpm離心15min,轉移上清到另一9、電泳檢測完整性。采用瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察電泳圖來判斷DNA完整性若：電泳圖呈現(xiàn)干凈、光滑的單一一條帶，沒有拖尾現(xiàn)象，則說明DNA的完整性很好。可用于后續(xù)PCR分子生物學操作。若：電泳圖有拖尾現(xiàn)象，不止單一一條帶，則DNA完整性不是很好，用于后續(xù)實驗操作效果較差。DNA完整性良好9、電泳檢測完整性。采用瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察電泳圖來判國內外相關文章國內外相關文章

烏桕基因組DNA提取方法研究

張帥

王曉光

鄧先珍

羅治建

程軍勇

盧小三【摘要】：以改良CTAB法和SDS法提取烏桕基因組DNA,對提取條件進行了正交試驗,優(yōu)化出烏桕基因組DNA提取的適宜條件,采用紫外分光光度檢測、瓊脂糖凝膠電泳分析及限制性內切酶進行了檢測。結果表明:改良CTAB法的A1、B2、C2、D2組合提取的基因組DNA純度高,無拖尾現(xiàn)象,OD260/280值在1.8～2.0,OD260/230在2.0。烏桕基因組DNA提取方法研究【作者單位】：華中農(nóng)業(yè)大學;湖北省林業(yè)科學研究院;【分類號】：S792.99cqvip/Read/Read.aspx?id=32358846材料：烏桕嫩葉采自湖北省九峰山，種子采自湖北省英山縣30年生烏桕優(yōu)叔【作者單位】：華中農(nóng)業(yè)大學;湖北省林業(yè)科學研究院;方法：采用若干烏桕葉片和種子，采用改良的CTAB法和SDS發(fā)分別提取烏桕基因組DNA，并對提取液分別進行紫外光分光光度計檢測、檢測糖凝膠電泳檢測、限制性內切酶EcoRI檢測結果：在條件相同的情況下，使用改良的CTAB法提取的烏桕嫩葉和種子DNA泳帶平直清晰，亮度高，呈塊壯，無明顯拖尾痕跡，點樣孔較干凈，采用SDS發(fā)提取的DNA泳帶呈塊狀，點樣孔處殘留少量雜質。純度不高。適量的β-ME（壞）、PVP（好）都對烏桕的DNA提取效果有影響PCR與DNA提取一般方法-課件PCR原理+流程烏桕DNA提取方法國內外相關文章PCR原理+流程烏桕DNA提取方法

PCR原理聚合酶鏈式反應簡稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction）(又稱：多聚酶鏈式反應），聚合酶鏈式反應，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增。又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。PC特點具有特異性強靈敏度高操作簡便省時等特點。特點具有特異性強用途可用于基因分離克隆和核酸序列分析等基礎研究還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方用途可用于基因分離(1)擴增各種蛋白的基因：(2)PCR后的測序：可以很快地測出常規(guī)的PCR產(chǎn)物或單鏈的DNA序列(3)用于分子進化和種系發(fā)育的研究，研究其分子進化及種系發(fā)育是很有用的4)分析和診斷遺傳性疾病(5)對人類HLA基因的多肽性分析，對于某些基因突變，如腫瘤發(fā)生的研究等均很有用。(1)擴增各種蛋白的基因：主要過程PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成主要過程PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成

模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至92℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

引物的延伸DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作PCR的反應動力學

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR的反應動力學PCR擴增物PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。PCR擴增物PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部所需材料1.試劑和溶液(1)10×PCR緩沖液500mM氯化鉀100mMTris-Cl(室溫時pH8.3)15mM氯化鎂(2)10mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液－含有所有四種dNTPs(pH8.0)所需材料1.試劑和溶液3)耐熱的DNA聚合酶：①TaqDNA聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有5’→3’DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’外切酶活性。②rTthDNA聚合酶是Thermusthermophilus(Tth)和Thermococcuslitoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有5’→3’DNA聚合酶和3’→5’外切酶(校正)的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產(chǎn)量。3)耐熱的DNA聚合酶：(4)瓊脂糖凝膠(5)10μM的上游和下游引物(6)DNA模板(7)對照DNA(含有靶序列的DNA)(8)DNA長度標準參照物(4)瓊脂糖凝膠2.設備(1)0.2mlPCR擴增管2.設備(1)0.2mlPCR擴增管(2)可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)(2)可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀)實驗操作1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴增管中：

成分

體積終濃度10×PCR緩沖液5μl1×10mMdNTP溶液(pH8.0)

1μl每種0.2mM10μM上游引物2.5μl0.5μM10μM下游引物2.5μl0.5μM5單位/μl耐熱DNA聚合酶0.5μl2.5單位DNA模板1-10μl1pg-1μg消毒的蒸餾水至50μl實驗操作1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴增管中2．將小管中的混合物混勻并加入50μl礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。3．蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。2．將小管中的混合物混勻4．小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94oC溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。4．小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94oC溫育3分鐘，以使模5.按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：變性94oC30秒退火55oC30秒延伸72oC1分鐘/1kb5.按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：6．72oC溫育PCR樣本10分鐘，可于4oC維持。樣本可貯存于-20oC直至使用。7．采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標準的DNA作參照。6．72oC溫育PCR樣本10分鐘，可于4oC維持。樣本可貯

電泳電泳

PCR熒光定量PCR熒光定量

結果結果PCR與DNA提取一般方法-課件植物DNA提取方法1.CTAB法2.SDS法3.高鹽法植物DNA提取方法1.CTAB法烏桕DNA提取方法1.CTAB法2.SDS法烏桕DNA提取方法1.CTAB法

CTAB法提取植物基因組DNA這種方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的簡便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖類物質分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。CTAB法提取植物基因組DNA這種方法是由Mu一材料、試劑和儀器1材料新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料葉子和種子的胚乳為材料一材料、試劑和儀器1材料2試劑(1)2×CTAB溶液CTAB(W/V)2%Tris-HCL100MMOL/LPH8EDTA20MMOLPH8NACL1.4MOL/LPVP1%滅菌備用2試劑(1)2×CTAB溶液(2)氯仿/異戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)乙醇或異丙醇(5)β-巰基乙醇（6）氯仿/異戊醇（25/24/1）（7）70%乙醇(2)氯仿/異戊醇（24:1）3.儀器:a、離心機3.儀器:a、離心機b、恒溫水浴b、恒溫水浴c、電泳裝置c、電泳裝置實驗步驟1.在2mL離心管中，加入500μl的2×CTAB和20μlβ-巰基乙醇,65℃預熱。2、嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到預熱的離心管中，總體積達到1mL混勻后置65℃水浴中保溫45-60min，并不時輕輕轉動試管。注：凍存材料直接研磨，絕對不能化凍。而且粉末應在化凍前轉移否則內源性Dnase有可能降解基因組DNA。實驗步驟1.在2mL離心管中，加入500μl的2×CTAB和3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000rpm離心10min，移上清至另一新管中。4.向管中加入1/100體積的RNaseA溶液，置37℃20-30min。5.加入2倍體積的100%乙醇或0.7倍體積異丙醇，會出現(xiàn)絮狀沉淀，-20℃放置30min或-80℃放置10min，12000rpm離心10-15min回收DNA沉淀。6.用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌ddH2O中。7.0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下1000SDS法原理：SDS（十二烷基苯磺酸鈉）是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，同時SDS與蛋白質和多糖結合成復合物，釋放出核酸；通過提高鹽濃度并降低溫度，使SDS-蛋白質復合物的溶解度變得更小，從而使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理：SDS（十二烷基

試劑(1)提取緩沖液Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）EDTA50mmol/L（pH8.0）NaCl500mmol/L滅菌后加β-巰基乙醇至10mmol/L試劑(1)提取緩沖液T(2)裂解液20%SDS(3)高鹽溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)異丙醇(6)滅菌ddH2O或TE(2)裂解液20%SDS

實驗程序1、取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。2、向管中加入50μL