BD流式分選的原理和應用課件

BD流式分選的原理和應用BD流式分選的原理和應用流式細胞儀的原理流式細胞儀的應用BDFACSJazz個人型流式細胞分選儀綱要綱要BD公司簡介FairleghS.DickinsonMaxwellW.Becton美國BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設在新澤西州。全球500強企業(yè)之一1974年，BD與美國斯坦福大學合作研制出全球第一臺商用流式細胞分選儀，不斷推陳出新，在流式細胞領(lǐng)域始終保持領(lǐng)先地位。BD公司簡介FairleghS.DickinsonMax市場情況BD是全球最大的流式細胞儀生產(chǎn)商和供應商，在全球的占有率為85%，高端分選型流式細胞儀占有率大于90%。在全國各大醫(yī)院和科研院所，大部分為BD公司的儀器，總計數(shù)量已超過2000臺，如：清華大學，北京大學，中科院系統(tǒng)，軍科院系統(tǒng)，醫(yī)科院系統(tǒng)等等市場情況BD是全球最大的流式細胞儀生產(chǎn)商和供應商，在全球的占BD公司流式細胞儀FACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuriC6FACSAriaIIInfluxBD公司流式細胞儀FACSJazzLSRFortessaFA什么是流式細胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid什么是流式細胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)組成細胞功能大小細胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子、pH值、膜電位酶活性8檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)組成細胞功能大小細胞表面、胞漿、核特異性抗原流式細胞儀能告訴我們什么？細胞的相對大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘枺現(xiàn)SC）細胞的相對顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復雜性（側(cè)向散射光信號，SSC）相關(guān)的熒光強度流式細胞儀能告訴我們什么？細胞的相對大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘?，前向角散射光信號FSC前向角散射光信號FSC側(cè)向角散射光信號SSC側(cè)向角散射光信號SSC流式細胞儀的檢測信號-熒光激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素分子利用激發(fā)光提供的能量激發(fā)熒光分子的初級電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后返回基態(tài)軌道釋放能量（也就是發(fā)射光）。12流式細胞儀的檢測信號-熒光激發(fā)光譜（Excitation，E流式細胞儀的檢測信號-熒光使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量常用的熒光素：PE，F(xiàn)ITC，APC等13流式細胞儀的檢測信號-熒光使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，流式對照的設置流式對照的設置對照的設置流式細胞術(shù)顯示的熒光強度是相對的、可調(diào)節(jié)的，所以需要設置一系列對照來確定細胞是否陽性。陰性對照陽性對照單染對照（補償對照）15對照的設置流式細胞術(shù)顯示的熒光強度是相對的、可調(diào)節(jié)的，所以需對照的設置-陰性對照空白對照：即不進行任何標記的細胞。主要用于確定待測標本的自發(fā)熒光同型對照：即用同型抗體作平行實驗。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體亞型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，F(xiàn)ab段不同）。用于確認細胞是否為抗原特異性染色，排除非特異染色。16對照的設置-陰性對照空白對照：即不進行任何標記的細胞。主要用對照的設置-陽性對照陽性對照即應用已知表達某種抗原的細胞（陽性細胞）進行平行實驗。通常用于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準確性。與陰性對照一起判斷測試樣品是否為特異性染色。17對照的設置-陽性對照陽性對照即應用已知表達某種抗原的細胞（陽對照的設置-單染對照（補償對照）補償對照-多色熒光分析會有光譜交叉，需要熒光補償幾色分析需要設置幾個補償對照18對照的設置-單染對照（補償對照）補償對照-多色熒光分析會有光單染對照（補償對照）-熒光補償方法530/400580/30FITCPE19單染對照（補償對照）-熒光補償方法530/400580/30流式細胞儀如何得到細胞20分選細胞從復雜的細胞群體中得到高純度的靶細胞，進一步深入研究流式細胞儀如何得到細胞20分選細胞高速分選原理21分選時，液流自驅(qū)動力的作用下斷成高度均一的液滴。在噴嘴下的幾毫米處，液滴從液流斷開。從顆粒被檢測到液滴斷開的時間稱為液滴延遲時間，由BD專利的Accudrop技術(shù)直接計算符合分選條件的顆粒一旦被檢測到，包含該顆粒的液滴將要從液流斷開時，液流被充電。斷開后的液滴仍然帶電，帶電的液滴通過被充電的偏轉(zhuǎn)板。受靜電吸引或排斥，帶電液滴將向左或向右偏轉(zhuǎn)。不帶電的液滴不偏轉(zhuǎn)而流入廢液槽。高速分選原理21分選時，液流自驅(qū)動力的作用下斷成高度均一的液22部分應用實例科學是復雜的，工具是簡單的22部分應用實例科學是復雜的，工具是簡單的轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋白)標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，在488nm激光激發(fā)下，表達GFP的細胞發(fā)綠色熒光。本實驗為U937細胞轉(zhuǎn)染GFP和目的基因，用BDFACSAriaIII分選高表達GFP目的基因的細胞。本案例用BDFACSAriaIII分選GFP陽性細胞，該樣本GFP陽性的目標細胞含量僅為1.9%，分選后回測，目的細胞純度高達99%。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選24分選后細胞在顯微鏡白光視野下可見，細胞膜清晰，狀態(tài)很好，在熒光顯微鏡下GFP所發(fā)綠光清晰可見，充分說明FACSAriaIII分選低表達細胞的高純度和高活性。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選24分選后細胞在顯微鏡白光視DNA含量檢測常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3（CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB等。結(jié)合位點不同染色方法不同激發(fā)波長不同PI在DNA檢測中應用最廣泛DNA染色過程中一定不要洗滌25DNA含量檢測常用DNA染料：Hoechst33342、HoDNA含量檢測細胞周期細胞凋亡染色體分選腫瘤干細胞分選26DNA含量檢測細胞周期26細胞周期G2MG0G1s

200400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

DNA含量檢測27細胞周期細胞周期G2MG0G1s20040060080010小鼠精原細胞倍性分析分選28本實驗取小鼠睪丸細胞，用Hochest33342進行染色，BDFACSAriaSORP倍性分析后分選其中的初級精母細胞（4N），分選出的初級精母細胞后續(xù)用來抽提RNA。小鼠精原細胞倍性分析分選28本實驗取小鼠睪丸細胞，用Hoc小鼠精原細胞倍性分析分選29小鼠睪丸細胞倍性分析，可清楚看到各倍體細胞群：N、2N、4N。本案例用BDFACSAriaSORP的UV激光光進行Hochest33342染色的小鼠睪丸精原細胞倍體分析分選，從單參數(shù)直方圖可見，單倍體（N）峰、二倍體（2N）峰、四倍體（4N）峰區(qū)分很開，說明本實驗檢測精度高，CV值低。

小鼠精原細胞倍性分析分選29小鼠睪丸細胞倍性分析，可清楚看腫瘤細胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細胞DNA量相同，癌變細胞的DNA指數(shù)發(fā)生變化，非整倍體出現(xiàn)概率很高。用流式DNA峰圖鑒別細胞的倍體在病理學上是一種快速、直接的檢測方法。30腫瘤細胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細胞DNA量相同植物倍體的分析植物細胞的倍體非常復雜，常以多倍體形式存在。檢測時多采用對數(shù)形式。植物的倍性鑒定是多倍體研究的重要內(nèi)容之一。流式細胞術(shù)已應用于玉米、向日葵、甘薯、木薯、獼猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鑒定。這將有利于果樹和農(nóng)作物的培植和育種。31植物倍體的分析植物細胞的倍體非常復雜，常以多倍體形式存在。3細胞凋亡凋亡后期，細胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的DNA核小體片段從細胞中釋放，因此，凋亡細胞比活細胞含有更少的DNA。凋亡細胞的DNA峰會出現(xiàn)在正常細胞G0/G1峰之前，稱為sub-G1峰。Sub-G1峰的出現(xiàn)被認為是凋亡細胞的標志之一。32細胞凋亡凋亡后期，細胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的D腫瘤細胞凋亡檢測33方法：Jurkat細胞分別用DMSO（對照；<2%）或HU-331（一種誘導細胞凋亡的大麻素；CaymanChemicalCompany）處理6小時。然后用AccuriCellCyclePhaseDeterminationKit(KR-300)固定細胞并染色。腫瘤細胞凋亡檢測33方法：Jurkat細胞分別用DMSO（對細胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標記法細胞凋亡時會發(fā)生一系列形態(tài)學改變。質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到胞膜外側(cè)，可以通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）來檢測。為了區(qū)分凋亡和壞死兩種不同情況下的PS外翻，AnnexinⅤ常與鑒定細胞死活的染料（PI或7-AAD）聯(lián)合使用。細胞凋亡的PS與AnnexinⅤ結(jié)合，呈AnnexinⅤ陽性，同時凋亡細胞的細胞膜是完整的，PI不能進入，因此，凋亡細胞是AnnexinⅤ+/PI-。死細胞的PS與AnnexinⅤ結(jié)合也呈陽性，但死細胞的膜已經(jīng)破裂，PI能夠進入，所以死細胞是AnnexinⅤ+/PI+。34細胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標記法細胞凋亡時會發(fā)生一FITCAnnexinV/PI染色和流式細胞儀分析。Jurkat細胞（人T細胞白血病）用6μM的喜樹堿或0.1%DMSO（陰性對照）4小時，引導凋亡。細胞根據(jù)AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒的染色指南，用FITCAnnexinV和碘化丙啶（PI）染色。與DMSO對照組相比，喜樹堿處理會增加細胞的早期凋亡（PI陰性，AnnexinV陽性），即圖中綠色部分。死細胞（PI陽性，紅色部分）和活細胞（AnnexinV和PI陰性，黑色部分）群體很容易辨別。圖中的數(shù)據(jù)來自BDAccuriC6流式細胞的BDCFlow?Plus。35細胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標記法FITCAnnexinV/PI染色和流式細胞儀分析。Ju染色體分選36染色體分選36腫瘤干細胞分選37腫瘤細胞株的SP細胞。人HT-29結(jié)腸癌細胞使用Hoechst33342染色，裝有375nm激光器的BDFACSAriaⅢ上采集數(shù)據(jù)（左側(cè)散點圖）。作為對照樣品，SP表達被抑制（右側(cè)散點圖。）腫瘤干細胞分選37腫瘤細胞株的SP細胞。人HT-29結(jié)腸癌細BDFACSJazz個人型流式細胞分選儀可靠的性能，小巧的機身，實惠的價格開啟了細胞分選的新時代三激光8參數(shù)檢測個人分選精彩演繹BDFACSJazz個人型流式細胞分選儀可靠的性能，小巧BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（1）39光學系統(tǒng)原廠預優(yōu)化設置和直觀的操作

最高可達三激光6色，488nm激光器標配，405nm、561nm、640nm激光器選配

支持多種熒光染料

簡化的光路調(diào)節(jié)針孔攝像視頻窗口

檢測靈敏度：FITC<125MESF；PE<125MESFBDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（1）39光學系統(tǒng)40液流系統(tǒng)

聲學耦合噴嘴裝置

新型液流控制臺和分選軟件

噴嘴裝置：噴嘴使用螺口與系統(tǒng)耦合，取下噴嘴清理時不會影響光路系統(tǒng)的校準主要參數(shù)：

最小檢測大?。?um

最小上樣體積：200ul

分辨率：<3%CV

數(shù)據(jù)獲取速率：最高200,000事件/秒可更換液流管路BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（2）40液流系統(tǒng)主要參數(shù)：可更換液流管路BDFACSJazz配41分選參數(shù)：

專利的BDFACSAccudrop技術(shù)

可拆卸偏轉(zhuǎn)電極板

收集方式支持克隆及單細胞分析等多種應用

分選倉內(nèi)情況清晰可見BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（3）41分選參數(shù)：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（342軟件系統(tǒng)：

更好的操控性能

直觀的工作流程

強大的數(shù)據(jù)分析

索引分選讓克隆研究更加高效BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（4）42軟件系統(tǒng)：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（443保護設施：

Baker定制生物安全柜，符合嚴格的國際行業(yè)標準

同時保護樣本、操作者和實驗室環(huán)境

完全符合生物安全標準

有效的氣流控制BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（5）43保護設施：BDFACSJazz配置及核心技術(shù)指標（5定期維護保養(yǎng)經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員定期的用戶交流會議各種形式及內(nèi)容的小型專業(yè)講座實際操作上機培訓在線技術(shù)交流服務與支持定期維護保養(yǎng)服務與支持BD流式分選的原理和應用BD流式分選的原理和應用流式細胞儀的原理流式細胞儀的應用BDFACSJazz個人型流式細胞分選儀綱要綱要BD公司簡介FairleghS.DickinsonMaxwellW.Becton美國BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設在新澤西州。全球500強企業(yè)之一1974年，BD與美國斯坦福大學合作研制出全球第一臺商用流式細胞分選儀，不斷推陳出新，在流式細胞領(lǐng)域始終保持領(lǐng)先地位。BD公司簡介FairleghS.DickinsonMax市場情況BD是全球最大的流式細胞儀生產(chǎn)商和供應商，在全球的占有率為85%，高端分選型流式細胞儀占有率大于90%。在全國各大醫(yī)院和科研院所，大部分為BD公司的儀器，總計數(shù)量已超過2000臺，如：清華大學，北京大學，中科院系統(tǒng)，軍科院系統(tǒng)，醫(yī)科院系統(tǒng)等等市場情況BD是全球最大的流式細胞儀生產(chǎn)商和供應商，在全球的占BD公司流式細胞儀FACSJazzLSRFortessaFACSCantoIIAccuriC6FACSAriaIIInfluxBD公司流式細胞儀FACSJazzLSRFortessaFA什么是流式細胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid什么是流式細胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)組成細胞功能大小細胞表面、胞漿、核特異性抗原粒度細胞活性DNA、RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子、pH值、膜電位酶活性52檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)組成細胞功能大小細胞表面、胞漿、核特異性抗原流式細胞儀能告訴我們什么？細胞的相對大?。ㄇ跋蚪巧⑸涔庑盘枺現(xiàn)SC）細胞的相對顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復雜性（側(cè)向散射光信號，SSC）相關(guān)的熒光強度流式細胞儀能告訴我們什么？細胞的相對大小（前向角散射光信號，前向角散射光信號FSC前向角散射光信號FSC側(cè)向角散射光信號SSC側(cè)向角散射光信號SSC流式細胞儀的檢測信號-熒光激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素分子利用激發(fā)光提供的能量激發(fā)熒光分子的初級電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后返回基態(tài)軌道釋放能量（也就是發(fā)射光）。56流式細胞儀的檢測信號-熒光激發(fā)光譜（Excitation，E流式細胞儀的檢測信號-熒光使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量常用的熒光素：PE，F(xiàn)ITC，APC等57流式細胞儀的檢測信號-熒光使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，流式對照的設置流式對照的設置對照的設置流式細胞術(shù)顯示的熒光強度是相對的、可調(diào)節(jié)的，所以需要設置一系列對照來確定細胞是否陽性。陰性對照陽性對照單染對照（補償對照）59對照的設置流式細胞術(shù)顯示的熒光強度是相對的、可調(diào)節(jié)的，所以需對照的設置-陰性對照空白對照：即不進行任何標記的細胞。主要用于確定待測標本的自發(fā)熒光同型對照：即用同型抗體作平行實驗。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體亞型一致的免疫球蛋白（即Fc段相同，F(xiàn)ab段不同）。用于確認細胞是否為抗原特異性染色，排除非特異染色。60對照的設置-陰性對照空白對照：即不進行任何標記的細胞。主要用對照的設置-陽性對照陽性對照即應用已知表達某種抗原的細胞（陽性細胞）進行平行實驗。通常用于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準確性。與陰性對照一起判斷測試樣品是否為特異性染色。61對照的設置-陽性對照陽性對照即應用已知表達某種抗原的細胞（陽對照的設置-單染對照（補償對照）補償對照-多色熒光分析會有光譜交叉，需要熒光補償幾色分析需要設置幾個補償對照62對照的設置-單染對照（補償對照）補償對照-多色熒光分析會有光單染對照（補償對照）-熒光補償方法530/400580/30FITCPE63單染對照（補償對照）-熒光補償方法530/400580/30流式細胞儀如何得到細胞64分選細胞從復雜的細胞群體中得到高純度的靶細胞，進一步深入研究流式細胞儀如何得到細胞20分選細胞高速分選原理65分選時，液流自驅(qū)動力的作用下斷成高度均一的液滴。在噴嘴下的幾毫米處，液滴從液流斷開。從顆粒被檢測到液滴斷開的時間稱為液滴延遲時間，由BD專利的Accudrop技術(shù)直接計算符合分選條件的顆粒一旦被檢測到，包含該顆粒的液滴將要從液流斷開時，液流被充電。斷開后的液滴仍然帶電，帶電的液滴通過被充電的偏轉(zhuǎn)板。受靜電吸引或排斥，帶電液滴將向左或向右偏轉(zhuǎn)。不帶電的液滴不偏轉(zhuǎn)而流入廢液槽。高速分選原理21分選時，液流自驅(qū)動力的作用下斷成高度均一的液66部分應用實例科學是復雜的，工具是簡單的22部分應用實例科學是復雜的，工具是簡單的轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選67用帶GFP(綠色熒光蛋白)標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，在488nm激光激發(fā)下，表達GFP的細胞發(fā)綠色熒光。本實驗為U937細胞轉(zhuǎn)染GFP和目的基因，用BDFACSAriaIII分選高表達GFP目的基因的細胞。本案例用BDFACSAriaIII分選GFP陽性細胞，該樣本GFP陽性的目標細胞含量僅為1.9%，分選后回測，目的細胞純度高達99%。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選23用帶GFP(綠色熒光蛋轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選68分選后細胞在顯微鏡白光視野下可見，細胞膜清晰，狀態(tài)很好，在熒光顯微鏡下GFP所發(fā)綠光清晰可見，充分說明FACSAriaIII分選低表達細胞的高純度和高活性。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP細胞的分選24分選后細胞在顯微鏡白光視DNA含量檢測常用DNA染料：Hoechst33342、Hoechst33258、DAPI、色霉素A3（CA3）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）、7-AAD、DRAQ5、EB等。結(jié)合位點不同染色方法不同激發(fā)波長不同PI在DNA檢測中應用最廣泛DNA染色過程中一定不要洗滌69DNA含量檢測常用DNA染料：Hoechst33342、HoDNA含量檢測細胞周期細胞凋亡染色體分選腫瘤干細胞分選70DNA含量檢測細胞周期26細胞周期G2MG0G1s

200400

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8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

DNA含量檢測71細胞周期細胞周期G2MG0G1s20040060080010小鼠精原細胞倍性分析分選72本實驗取小鼠睪丸細胞，用Hochest33342進行染色，BDFACSAriaSORP倍性分析后分選其中的初級精母細胞（4N），分選出的初級精母細胞后續(xù)用來抽提RNA。小鼠精原細胞倍性分析分選28本實驗取小鼠睪丸細胞，用Hoc小鼠精原細胞倍性分析分選73小鼠睪丸細胞倍性分析，可清楚看到各倍體細胞群：N、2N、4N。本案例用BDFACSAriaSORP的UV激光光進行Hochest33342染色的小鼠睪丸精原細胞倍體分析分選，從單參數(shù)直方圖可見，單倍體（N）峰、二倍體（2N）峰、四倍體（4N）峰區(qū)分很開，說明本實驗檢測精度高，CV值低。

小鼠精原細胞倍性分析分選29小鼠睪丸細胞倍性分析，可清楚看腫瘤細胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細胞DNA量相同，癌變細胞的DNA指數(shù)發(fā)生變化，非整倍體出現(xiàn)概率很高。用流式DNA峰圖鑒別細胞的倍體在病理學上是一種快速、直接的檢測方法。74腫瘤細胞的非整倍體分析二倍體異倍體四倍體正常細胞DNA量相同植物倍體的分析植物細胞的倍體非常復雜，常以多倍體形式存在。檢測時多采用對數(shù)形式。植物的倍性鑒定是多倍體研究的重要內(nèi)容之一。流式細胞術(shù)已應用于玉米、向日葵、甘薯、木薯、獼猴桃、葡萄、棉花和李子的倍性鑒定。這將有利于果樹和農(nóng)作物的培植和育種。75植物倍體的分析植物細胞的倍體非常復雜，常以多倍體形式存在。3細胞凋亡凋亡后期，細胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的DNA核小體片段從細胞中釋放，因此，凋亡細胞比活細胞含有更少的DNA。凋亡細胞的DNA峰會出現(xiàn)在正常細胞G0/G1峰之前，稱為sub-G1峰。Sub-G1峰的出現(xiàn)被認為是凋亡細胞的標志之一。76細胞凋亡凋亡后期，細胞膜通透性增大，DNA降解，降解產(chǎn)生的D腫瘤細胞凋亡檢測77方法：Jurkat細胞分別用DMSO（對照；<2%）或HU-331（一種誘導細胞凋亡的大麻素；CaymanChemicalCompany）處理6小時。然后用AccuriCellCyclePhaseDeterminationKit(KR-300)固定細胞并染色。腫瘤細胞凋亡檢測33方法：Jurkat細胞分別用DMSO（對細胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標記法細胞凋亡時會發(fā)生一系列形態(tài)學改變。質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）重新分布，由胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到胞膜外側(cè)，可以通過膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）來檢測。為了區(qū)分凋亡和壞死兩種不同情況下的PS外翻，AnnexinⅤ常與鑒定細胞死活的染料（PI或7-AAD）聯(lián)合使用。細胞凋亡的PS與AnnexinⅤ結(jié)合，呈AnnexinⅤ陽性，同時凋亡細胞的細胞膜是完整的，PI不能進入，因此，凋亡細胞是AnnexinⅤ+/PI-。死細胞的PS與AnnexinⅤ結(jié)合也呈陽性，但死細胞的膜已經(jīng)破裂，PI能夠進入，所以死細胞是AnnexinⅤ+/PI+。78細胞凋亡-AnnexinⅤ/PI雙標記法細胞凋亡時會發(fā)生一FITCAnnexinV/PI染色和流式細胞儀分析。Jurkat細胞（人T細胞白血病）用6μM的喜樹堿或0.1%DMSO（陰性對照）4小時，引導凋亡。細胞根據(jù)AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒的染色指南，用FITCAnnexinV和碘化丙啶（PI）染色。與DMSO對照組相比，喜樹堿處理會增加細胞的早期凋亡（PI陰性，AnnexinV陽性），即圖中綠色部分。死細胞（PI陽性，紅色部分）和活細胞（AnnexinV和PI陰性，黑色部分）群體很容易辨別。圖中的數(shù)據(jù)來自BDAccuri