分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)手冊

PAGEPAGE9PAGEPAGE8分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)手冊目 錄TOC\o"1-1"\h\z\u實驗一 培養(yǎng)基的配制及實驗用品的滅菌 1實驗二 質(zhì)粒DNA的分離提取 2實驗三 質(zhì)粒DNA濃度和純度的測定 4實驗四 DNA的瓊脂糖電泳鑒定 4實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 5實驗六 重組子的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的初步篩6實驗七 PCR 7實驗八 DNA的酶切及電泳鑒定 8實驗一 培養(yǎng)基的配制及實驗用品的滅菌一、目的了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法二、原理應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。三、材料1、器皿及材料1.5mlEPPCR管、槍頭、槍頭盒2、藥品試劑胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂粉四、步驟1、LB液體培養(yǎng)基的配置及分裝配置：稱取胰蛋白胨2.5g，酵母提取物1.25g，NaCl2.5g，溶于200ml蒸餾水中，徹底溶解后，加蒸餾水定容至總體積250ml。100mlLB250ml5mlLB25支試管。2、LB固體培養(yǎng)基的配置稱取1.5g瓊脂粉，加入至100mlLB液體培養(yǎng)基中。3、包扎標(biāo)記稱，制備組別和姓名、日期等。4、其他實驗用品的包裝標(biāo)記在鋁飯盒中放入1.5mlEPPCR管及2個50ml離心管（旋松管蓋5個玻璃培養(yǎng)皿，標(biāo)記組別和姓名等。5、滅菌把上述配好的各種培養(yǎng)基、實驗用品放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20-30min，滅菌結(jié)束后放入干燥箱烘干備用。6、含氨芐青霉素的LB固體平板制備待LB60℃倒入滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后4℃保存?zhèn)溆谩５蛊桨宓姆椒ǎ河沂殖质⑴囵B(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹觯?瓶塞也可將試管塞或瓶塞放在左手左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養(yǎng)基約15m1，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。7、液體接菌培養(yǎng)10ul5mlLB態(tài)實驗。在滅菌的5mlLB液體培養(yǎng)基中加入5ul氨芐青霉素100mg/m，混勻后接入10ulTOP10大腸桿菌（含pLenti6-GFP質(zhì)粒37℃振蕩培養(yǎng)過夜，用于質(zhì)粒提取實驗。10ul(瓶塞，將槍頭中的細(xì)菌接種到試管或三角瓶中，將試管塞或瓶塞蓋好。五、結(jié)果六、思考1、制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？2、做過本次實驗后，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時要注意些什么問題？3、滅菌在微生物學(xué)實驗操作中有何重要意義？4、試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。5、高壓蒸汽滅菌時應(yīng)注意哪些事項？實驗二 質(zhì)粒DNA的分離提取一、目的掌握質(zhì)粒DNA二、原理從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA常用堿性SDS法，該法提取質(zhì)粒是基于質(zhì)粒與染色體DNA的變性存在差異而予以分離的。在強堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均變性（雙鏈解開DNA分子小，而且是共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，變性后兩條互補鏈不會完全分開。當(dāng)溶液PHDNA容易復(fù)性并溶解在溶液中，而染色體DNA-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來。轉(zhuǎn)移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的質(zhì)粒DNA。DNA其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈則形成線狀DNA(LinearDNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。三、儀器與試劑1、儀器恒溫?fù)u床、小型高速離心機2、試劑：快速質(zhì)粒小提試劑盒（世紀(jì)康為CW051，組分包括BufferP1：50mmol/L葡萄糖5mmol/L10mmol/LBufferP2：0.2mol/L新鮮配置。BufferN3：5mol/L60mL28.5mLBuffer75%乙醇的緩沖液Spin Column CM（吸附柱四、操作步驟110ul5mL含100ug/ml氨芐青霉素的LB3℃220rpm搖床培養(yǎng)過夜（實驗一中已完成。2、將1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管（Eppendorf離心管）內(nèi)，10000rpm離心30秒，棄上清。3、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul預(yù)冷的Buffer浮菌體沉淀。4250ulBuffer，溫和地上下顛倒混勻4-6變得清亮粘稠。注意：溫和混勻，不要劇烈震蕩，以免造成基因組DAN污染，此步驟所用時間應(yīng)不超過5分鐘，避免質(zhì)粒受到破壞。5、向離心管中加入350ulBufferN3，立即溫和地上下顛倒混勻4-6次，充分混勻，此時應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，13000rpm離心10分鐘。注意：BufferN3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。651的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。7、向吸附柱中加入750ulBufferPW，13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。82分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（PCR等。9、將吸附柱置于一個新的EP管中，向吸附膜的中間部位加入30ul5分鐘，13000rpm離心2分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩嶒炄|(zhì)粒DNA濃度和純度的測定一、目的1、了解分光光度法測定DNA濃度和純度的原理2、掌握分光光度法測定DNA二、原理質(zhì)粒DNA樣品的濃度和純度是后續(xù)實驗的關(guān)鍵，因此要對分離純化的質(zhì)粒進(jìn)行濃度、純度的測定。核酸的濃度和純度。其中紫外吸收法簡單快捷、靈敏度高，是實驗室中最常用的方法。核酸分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在250-280nm紫外光區(qū)具有強烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右，因此可利用核酸的紫外吸收興致進(jìn)行定量測定。目前常利用分光光度計測定260nm1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA50ug/ml；單鏈DNA或RNA40ug/ml；可以此來計算核酸樣品的濃度（通常1ug/ml的DNA260nm0.020；1ug/mlRNA0.022，以此為標(biāo)準(zhǔn)，可測得溶液中的核酸含量。260nm280nm的紫外線吸收值的比值酸樣品的純度。純DNAA260/A280的A260/A2802.0DNA和RNA的比值分別1.82.0時，則表示此樣品不純，可能含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。若DNA1.8，說明樣品中有RNA污染。當(dāng)然也會出現(xiàn)既含有RNADNA1.8的情況，所以需要結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)一步進(jìn)行測定?！居嬎恪?DNA濃度（ug/ml）=A260×1ug/ml×稀釋倍/0.020DNA純度=A260/A280（要求比值在1.8-2.0范圍內(nèi)三、儀器與試劑紫外分光光度計、微量移液器、石英比色皿、質(zhì)粒溶液、蒸餾水四、步驟1、樣品準(zhǔn)備：取實驗二中提取得到的質(zhì)粒溶液200ul，加入蒸餾水1800ul，混勻后待用。2、以蒸餾水調(diào)零，用紫外分光光度計測定質(zhì)粒溶液在260nm、280nm的吸光度值。3、計算出DNA的濃度及純度，分析是否有RNA或蛋白質(zhì)污染。實驗四 DNA的瓊脂糖電泳鑒定一、目的二、原理核酸帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動，移動快慢與分子大小成反比。電泳后，核酸在凝膠中的位置通過“染色”來顯現(xiàn)。染色劑溴化乙錠E，它能插入DNA積疊的堿基之間，導(dǎo)致和DNA-DNA復(fù)合物發(fā)射出橘紅色熒光。三、儀器與試劑1、儀器電泳儀；電泳槽；紫外核酸檢測儀2、試劑TAE電泳緩沖液5×：每升含Tris242，冰乙酸57.1m0.5mol/LDNAladderDM2000plus6×DNAloadingbuffer（上樣緩沖液四、操作步驟1、將制膠板水平放置于模具內(nèi)，插入合適的梳子；2、稱取1g瓊脂糖于100ml1×TAE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50oC時倒入制膠板中；3、凝膠凝固后，小心拔去梳子，將制膠板放入電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液；4、吸取提取的質(zhì)粒DNA5ul，6×上樣緩沖液1ul，混勻后點入加樣孔中，另外吸取5ulDNAMarker依次點入加樣孔中；5、蓋好蓋子，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動，100V約30分鐘；61ug/mlEB5紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、目的二、原理在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA(如電擊法，CaCl2),,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新(即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2,,可加入占總體積15-70(半年),因此CaCl2三、儀器與試劑1、儀器恒溫?fù)u床；冷凍離心機；制冰機；分光光度計；超凈工作臺；滅菌的離心管50ml和2、試劑（10.1mol/LCaC2溶液稱取1.11gCaC2(),溶于50ml定容至100ml高壓滅菌。（2）含15%甘油的0.1mol/LCaCl2:稱取1.11gCaCl2(無水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。四、操作步驟（一）細(xì)菌的培養(yǎng)10ulTOP10大腸桿菌菌液，接種于5mlLB,37℃下過夜振蕩培養(yǎng)（成1:100-1:50100mlLB,372-3小時至OD600＝0.4-0.6左右。（二）(CaCl2法)1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下4000rpm離心10分鐘。2、棄去上清，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下4000rpm離心10分鐘。3,2ml0.1mol/LCaCl2,,,懸液。4、感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份，可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，也可貯存于4℃可保存一周。五、注意事項1、實驗中所用的器皿均需要高壓滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。2、實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺上進(jìn)行。3、應(yīng)收獲對數(shù)生長期的細(xì)胞用于制備感受態(tài)，OD600不應(yīng)高于0.64、制備感受態(tài)細(xì)胞需要高純度的CaCl2，并用超純水配制。5、整個實驗一定要在冰浴條件下操作，溫度時高時低會影響轉(zhuǎn)化效率。實驗六 重組子的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的初步篩選一、目的學(xué)習(xí)將DNA二、原理轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程DNA分子必須經(jīng)轉(zhuǎn)DNA,,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后(Transformant,即帶有異源DNA)。本實驗用外源質(zhì)粒pLenti6-GFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOO10而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因缺乏抵抗抗生素的能力而死亡。三、步驟1、新制備或4℃保存的感受態(tài)細(xì)胞懸液,加入質(zhì)粒DNA溶液2-3ul(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘。2、42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。3、向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。4、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板,正面向上放置半小,待菌液完全培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng),37℃培養(yǎng)16-24小時。5、結(jié)果：培養(yǎng)皿中可見一個個菌落即為轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆。四、注意事項1、轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度成正比，如果加入外源DNA下降，所以一般情況下DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。2、42℃熱處理很關(guān)鍵，溫度要準(zhǔn)確，轉(zhuǎn)移速度要快。實驗七 PCR一、目的掌握PCR二、原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟:1(Denature):目的雙鏈DNA94;2、退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;3(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA以目的DNA.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA,25-35輪循環(huán)就可使DNA106本實驗是從pLenti6-GFP質(zhì)粒上擴增GFP（綠色熒光蛋白）基因。三、儀器與試劑1、儀器：PCR儀2、試劑2TaqDNA聚合酶預(yù)混液（含PCRbufferM2、TaqdNT、染料模板DNA（plenti6-GFP質(zhì)粒）引物（各10uGFP-F: GGATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGFP-R: 四、操作步驟1、PCR反應(yīng)體系（20ul）2×PCRbuffer（含Taq酶及染料）10μl模板1μlGFP-F（10μM）1μlGFP-R（10μM）1μl滅菌水7μl2、PCR反應(yīng)程序預(yù)變性 94℃ 5min變性 94℃ 30s退火 55℃ 30s30個循環(huán)延伸 72℃ 1min終延伸 72℃ 10min3、產(chǎn)物分析取10μlPCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠孔中，100V電泳，至指示帶電泳至2/3凝膠處時停止電泳，取出凝膠，凝膠成像儀中觀察并拍照。五、思考題、降低退火溫度對反應(yīng)有何影響？2、延長變性時間對反應(yīng)有何影響？3、循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？4、如果出現(xiàn)非特異性帶,可能有哪些原因？實驗八 DNA的酶切及電泳鑒定一、目的掌握DNA二、原理限制性內(nèi)切