乙肝病毒耐藥變異的檢測課件

乙肝病毒耐藥變異的檢測

及臨床意義乙肝病毒耐藥變異的檢測

及臨床意義

主要內(nèi)容乙肝病毒的活躍復(fù)制與乙肝肝硬化和肝癌密切相關(guān)；抗病毒治療是控制乙肝的有效治療核苷類藥物的主要臨床效果與耐藥發(fā)生病毒耐藥的主要檢測方法病毒耐藥的臨床意義與防治對策主要內(nèi)容乙肝病毒的活躍復(fù)制與乙肝肝HBVDNA高負(fù)荷是肝癌發(fā)生的重要相關(guān)因素

(臺灣隊(duì)列研究:3851例HBsAg陽性者經(jīng)13年隨訪)

ChenCJ.JHepatol2005,42:16(A35)HBVDNA高負(fù)荷是肝癌發(fā)生的重要相關(guān)因素

(臺11年前HBVDNA水平11年后肝硬化發(fā)生率36.2%>106104-10523.5%103-104300-1039.8%<3005.9%4.5%1991-1992年臺灣3582例沒有治療的HBV患者進(jìn)行平均11年隨訪研究HBVDNA肝硬化11年前HBVDNA水平11年后肝硬化發(fā)生率36.2%>1

慢性乙肝的抗病毒治療對于慢性乙肝，抗病毒治療已成為最主要和最有效的治療；國內(nèi)外的慢性乙肝防治指南均推薦實(shí)行抗病毒治療。慢性乙肝的抗病毒治療對于慢性乙肝，抗病毒治療已成為最

抗乙肝病毒治療藥物第一類：a干擾素：包括普通干擾素和聚乙二醇干擾素。主要藥理作用是直接抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；第二類：核苷(酸)類藥物：抑制病毒DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；抗乙肝病毒治療藥物第一類：a干擾素：包括普通干擾NAIFNNAIFNLVDFTCLdTClevudineADVTDFETVL-核苷無環(huán)磷酸鹽化合物環(huán)戊烷/烯抗HBV核苷類藥物的分類LVDFTCLdTClevudineADVTDFETVL-

核苷(酸)類藥物的分類左旋核苷類：拉米夫定，替比夫定環(huán)戊烷(烯)類：恩替卡韋無環(huán)磷酸鹽類(核苷酸類)：阿德福韋替諾福韋核苷(酸)類藥物的分類左旋核苷類：拉米夫定，替比夫定一年抗病毒治療HBVDNA測不出比率HBeAg陽性病例HBeAg陰性病例一年抗病毒治療HBVDNA測不出比率HBeAg陽性病例一年抗病毒治療ALT復(fù)常率HBeAg陽性病例HBeAg陰性病例一年抗病毒治療ALT復(fù)常率HBeAg陽性病例HBeA一年抗病毒治療HBeAg血清轉(zhuǎn)換率一年抗病毒治療HBeAg血清轉(zhuǎn)換率一年抗病毒治療HBsAg血清轉(zhuǎn)換率5%10%3%0%0%0%0%0%pegIFNLVDADVL-dtETVTDV一年抗病毒治療HBsAg血清轉(zhuǎn)換率5%10%3%0%0%0%

乙肝病毒的耐藥現(xiàn)象病毒的基因突變導(dǎo)致耐藥耐藥導(dǎo)致療效降低或喪失乙肝病毒的耐藥現(xiàn)象病毒的基因突變導(dǎo)致耐藥病毒的自發(fā)突變導(dǎo)致耐藥株出現(xiàn)病毒顆粒的高復(fù)制率：1012-13個(gè)病毒顆粒/天自發(fā)突變的高發(fā)生率—HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏糾錯(cuò)功能：10-5

置換/堿基/循環(huán)每天每個(gè)堿基位置上都可能發(fā)生突變治療前耐藥突變株可能已存在病毒的自發(fā)突變導(dǎo)致耐藥株出現(xiàn)病毒顆粒的高復(fù)制率：1012-1HBV耐藥株如何成為優(yōu)勢株?適者生存:在抗病毒治療過程中，對藥物不敏感而具有生存優(yōu)勢的變異株成為成為優(yōu)勢株抗病毒治療SSSSSSSRRRRRRRSSHBV耐藥株如何成為優(yōu)勢株?適者生存:在抗病毒治療過程中核苷類藥物的耐藥機(jī)制病毒每日每時(shí)都在發(fā)生各種突變，包括對核苷類藥物的耐藥突變；但一般而言，突變株病毒復(fù)制能力弱于野生株，因此未用過核苷類藥物的病人總是野生株占優(yōu)勢。核苷類藥物的耐藥機(jī)制病毒每日每時(shí)都在發(fā)生各種突變，包括在應(yīng)用核苷類藥物后，敏感的野生株受到藥物的強(qiáng)烈抑制，逐漸減少消失，而自發(fā)出現(xiàn)的耐藥變異株不受藥物抑制，逐漸增多成為優(yōu)勢株。因此核苷類藥物對耐藥株病毒起到了選擇作用，而不是誘導(dǎo)突變的作用。核苷類藥物的耐藥機(jī)制在應(yīng)用核苷類藥物后，敏感的野生株受到核苷類藥物的耐藥機(jī)制StephenLLocarnini等分析：

HIV的抗病毒治療也會導(dǎo)致病毒耐藥，這是人們早就熟知的問題。但相比較而言，HBV發(fā)生耐藥變異的速度要慢很多。拉米夫定治療乙肝一年的耐藥率約20％，而拉米夫定治療HIV

時(shí)，最快1周就可能發(fā)生耐藥突變；JosephJSasadeusz,StephenLLocarnini,GraemeMacdonaldMJA2007,186:204StephenLLocarnini核苷類藥物治療核苷初治患者耐藥發(fā)生率<<<基因型耐藥或耐藥導(dǎo)致的病毒學(xué)反彈*拉米夫定,阿德福韋,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率,替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率1.2核苷類藥物治療核苷初治患者耐藥發(fā)生率<<<基因型耐藥或耐藥導(dǎo)核苷(酸)類藥物治療后

病毒耐藥的檢測檢測病毒耐藥變異的最常用的方法有：直接測序法限制性片段長度多態(tài)性分析法線性探針反向雜交法基因芯片法核苷(酸)類藥物治療后

病毒耐藥的檢測檢測病毒耐DNA序列分析法對病毒全基因或P基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增將PCR產(chǎn)物制備克隆挑選一定數(shù)量的克隆測序DNA序列分析法對病毒全基因或P基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增目的基因PCR產(chǎn)物變異株野生株P(guān)CR產(chǎn)物克隆PCR產(chǎn)物克隆序列分析（每例標(biāo)本20-25個(gè)克隆）擴(kuò)增目的基因PCR產(chǎn)物變異株野生株P(guān)CR產(chǎn)物克隆PCR產(chǎn)物克

直接序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)

可以發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括已上市藥物的新的變異位點(diǎn)和新藥的變異位點(diǎn)；2.靈敏度低，只有當(dāng)變異株數(shù)量超過DNA總量的20%時(shí)才能測出；3.選取克隆數(shù)量少時(shí)容易出現(xiàn)誤差；直接序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括已上市

限制性片段長度多態(tài)性分析法

RestrictionFragmentLengthPolymorphism

提取總HBVDNA，擴(kuò)增P基因突變區(qū)的DNA序列；用錯(cuò)配引物對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，目的是引入酶切位點(diǎn)；3.用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析：野生株和變異株因引入酶切位點(diǎn)的不同，在酶切后表現(xiàn)為不同的分子長度片段，電泳時(shí)出現(xiàn)不同的條帶，以此診斷野生株或是變異株；限制性片段長度多態(tài)性分析法

RestrictionFra野生株序列：TATATG736737738739740741TATGTG736737738739740741YVDD變異序列：TATATT736737738739740741YIDD變異序列：NdeI酶切位點(diǎn)：CATATG736737738739740741孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-492野生株序列：TATATGT引入酶切引物后的序列：CATATG736737738739740741野生株NdeICATGTG736737738739740741YVDD變異株NdeIYIDD變異株CATATT736737738739740741NdeI短片段長片段長片段孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-492引入酶切引物后的序列：CATAT

分子量標(biāo)記2.野生株陽性對照3.野生株4.混合變異5.變異株6.變異株孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-49211589分子量標(biāo)記2.野生株陽性對照孫劍等第RFLP方法的優(yōu)缺點(diǎn)

靈敏度高，能檢出低至5%的變異株；方法簡便易行；只能檢出已知位點(diǎn)，不能發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)；并非所有的變異位點(diǎn)都能使用RFLP法，因?yàn)橛行┳儺惒淮嬖谔禺愋缘拿盖形稽c(diǎn)；5.有些突變破壞了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，導(dǎo)致內(nèi)切酶失敗6.酶反應(yīng)條件的限制導(dǎo)致有些突變不能酶切。RFLP方法的優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，能檢出低至5%的變異株；

線性探針反向雜交法

(INNO-LIPAHBVDRv1.2.3)

將反向雜交探針包被于檢測條上；擴(kuò)增標(biāo)本HBVDNA-P區(qū)(A-F)；將PCR產(chǎn)物與檢測條上的探針雜交；顯色，閱讀結(jié)果。線性探針反向雜交法

(INNO-LIPAINNO-LIPAHBVDR第一代產(chǎn)品：檢測LAM變異的180和204位點(diǎn)；第二代產(chǎn)品：180+204+80+173（LAM）

181+236（ADV）第三代產(chǎn)品：兩個(gè)檢測條，第一條是v.2，第二個(gè)條是檢測ETV變異和TDV變異，并加入了ADV原發(fā)無應(yīng)答的變異；INNO-LIPAHBVDR第一代產(chǎn)品：檢測L針對不同的藥物，不同的變異位點(diǎn)，不同的變異方式，不同的基因型。共包被有54條探針，檢出11個(gè)位點(diǎn)變異123，4567891011針對不同的藥物，123，4567891011線性探針反向雜交法優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，可檢出5%的變異株；商品化試劑，操作方便快捷，結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確；只能檢出已知位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)后必須增加新探針；因?yàn)椴《居卸喾N基因型，一個(gè)位點(diǎn)的突變，可能需要多個(gè)探針。最終為了檢出所有突變，需要大量不同的探針；6.商品試劑盒價(jià)格昂貴。線性探針反向雜交法優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，可檢出5%的變異株；

基因芯片法同線性探針反向雜交方法類似?；蛐酒址Q基因微矩陣(microarray)，它是將大量特定的基因片段(寡核苷酸片段)作為探針有序地、高密度地排列在固定載體上，然后與待測標(biāo)本進(jìn)行雜交，最后顯色，閱讀結(jié)果。基因芯片法同線性探針反向雜交方法類似?；蛐酒瑱z測模式單萬水等全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議論文匯編，2008基因芯片檢測模式單萬水等全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會

病毒耐藥變異檢測的臨床意義

治療開始前的耐藥病毒檢測可以幫助選擇初治藥物；2.治療后的耐藥監(jiān)測有助于及時(shí)采取挽救治療措施；3.根據(jù)耐藥變異位點(diǎn)的不同選擇合適的藥物；病毒耐藥變異檢測的臨床意義治療開始前的耐藥病毒檢測可以幫

乙肝病毒耐藥位點(diǎn)拉米夫定：L80IV173LL180MM204IM204V恩替卡韋：V173LL180MA184GS202IM204IM204VM250V替比夫定M204I阿德福韋：A181VN236T替諾福韋：A194TFTC：M204IM204V阿德福韋原發(fā)耐藥：I233V乙肝病毒耐藥位點(diǎn)拉米夫定：L80I與耐藥相關(guān)的病毒變異LAMETVLdTFTCADVTDVL80IV173LL180MA181VA184GA194TS202IM204IM204VN236TM250VI233VI233V:ADV原發(fā)無應(yīng)答注：與耐藥相關(guān)的病毒變異LAML80IV173L核苷(酸)類藥物耐藥后挽救治療方案

藥物耐藥挽救治療方案拉米夫定耐藥加阿德福韋換恩替卡韋(有恩替卡韋耐藥風(fēng)險(xiǎn))加替諾福韋或換Truvada(TDF+FTC)阿德福韋耐藥加拉米夫定換/加用恩替卡韋(如果事先沒有拉米夫定耐藥)換用Truvada

替比夫定耐藥加阿德福韋或者替諾福韋換用恩替卡韋(有恩替卡韋耐藥風(fēng)險(xiǎn))加替諾福韋或換Truvada恩替卡韋耐藥加/換用阿德福韋或替諾福韋換用TruvadaLokASF&McMahonBJ.AASLDPracticeGuideline2009Hepatology2009核苷(酸)類藥物耐藥后挽救治療方案

藥物耐藥挽救治療方案拉米拉米夫定耐藥的處理優(yōu)先選擇：拉米夫定+阿德福韋酯聯(lián)合治療次選1.：恩替卡韋1mg(倍量)次選2.：替諾福韋300mg次選3.：替比夫定+阿德福韋酯聯(lián)合治療次選4.：恩替卡韋0.5mg+阿德福韋酯次選5.：替比夫定（經(jīng)耐藥位點(diǎn)測定為YVDD變異）不宜選擇：單用阿德福韋酯不宜選擇：恩替卡韋0.5mg或替比夫定拉米夫定耐藥的處理優(yōu)先選擇：拉米夫定+阿德福韋酯聯(lián)合治療

替比夫定耐藥的處理優(yōu)先選擇：替比夫定+阿德福韋酯聯(lián)合治療次選1.：恩替卡韋1mg(倍量)次選2：替諾福韋300mg次選3.：恩替卡韋0.5mg+阿德福韋酯不宜選擇：單用阿德福韋酯不宜選擇：恩替卡韋0.5mg或拉米夫定替比夫定耐藥的處理優(yōu)先選擇：替比夫定+阿德福韋酯聯(lián)

阿德福韋酯耐藥的處理優(yōu)先選擇：恩替卡韋或替比夫定次選1.：阿德福韋酯+拉米夫定次選2：拉米夫定次選3.：恩替卡韋0.5mg+阿德福韋酯阿德福韋酯耐藥的處理優(yōu)先選擇：恩替卡韋或替比夫定

恩替卡韋耐藥處理優(yōu)先選擇：恩替卡韋0.5mg+阿德福韋酯次選：替諾福韋300mg不宜選擇：換用阿德福韋酯，或拉米夫定，或替比夫定不宜選擇：恩替卡韋1.0mg恩替卡韋耐藥處理優(yōu)先選擇：恩替卡韋0.5mg+阿德福韋酯乙肝病毒耐藥變異的檢測

及臨床意義乙肝病毒耐藥變異的檢測

及臨床意義

主要內(nèi)容乙肝病毒的活躍復(fù)制與乙肝肝硬化和肝癌密切相關(guān)；抗病毒治療是控制乙肝的有效治療核苷類藥物的主要臨床效果與耐藥發(fā)生病毒耐藥的主要檢測方法病毒耐藥的臨床意義與防治對策主要內(nèi)容乙肝病毒的活躍復(fù)制與乙肝肝HBVDNA高負(fù)荷是肝癌發(fā)生的重要相關(guān)因素

(臺灣隊(duì)列研究:3851例HBsAg陽性者經(jīng)13年隨訪)

ChenCJ.JHepatol2005,42:16(A35)HBVDNA高負(fù)荷是肝癌發(fā)生的重要相關(guān)因素

(臺11年前HBVDNA水平11年后肝硬化發(fā)生率36.2%>106104-10523.5%103-104300-1039.8%<3005.9%4.5%1991-1992年臺灣3582例沒有治療的HBV患者進(jìn)行平均11年隨訪研究HBVDNA肝硬化11年前HBVDNA水平11年后肝硬化發(fā)生率36.2%>1

慢性乙肝的抗病毒治療對于慢性乙肝，抗病毒治療已成為最主要和最有效的治療；國內(nèi)外的慢性乙肝防治指南均推薦實(shí)行抗病毒治療。慢性乙肝的抗病毒治療對于慢性乙肝，抗病毒治療已成為最

抗乙肝病毒治療藥物第一類：a干擾素：包括普通干擾素和聚乙二醇干擾素。主要藥理作用是直接抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；第二類：核苷(酸)類藥物：抑制病毒DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；抗乙肝病毒治療藥物第一類：a干擾素：包括普通干擾NAIFNNAIFNLVDFTCLdTClevudineADVTDFETVL-核苷無環(huán)磷酸鹽化合物環(huán)戊烷/烯抗HBV核苷類藥物的分類LVDFTCLdTClevudineADVTDFETVL-

核苷(酸)類藥物的分類左旋核苷類：拉米夫定，替比夫定環(huán)戊烷(烯)類：恩替卡韋無環(huán)磷酸鹽類(核苷酸類)：阿德福韋替諾福韋核苷(酸)類藥物的分類左旋核苷類：拉米夫定，替比夫定一年抗病毒治療HBVDNA測不出比率HBeAg陽性病例HBeAg陰性病例一年抗病毒治療HBVDNA測不出比率HBeAg陽性病例一年抗病毒治療ALT復(fù)常率HBeAg陽性病例HBeAg陰性病例一年抗病毒治療ALT復(fù)常率HBeAg陽性病例HBeA一年抗病毒治療HBeAg血清轉(zhuǎn)換率一年抗病毒治療HBeAg血清轉(zhuǎn)換率一年抗病毒治療HBsAg血清轉(zhuǎn)換率5%10%3%0%0%0%0%0%pegIFNLVDADVL-dtETVTDV一年抗病毒治療HBsAg血清轉(zhuǎn)換率5%10%3%0%0%0%

乙肝病毒的耐藥現(xiàn)象病毒的基因突變導(dǎo)致耐藥耐藥導(dǎo)致療效降低或喪失乙肝病毒的耐藥現(xiàn)象病毒的基因突變導(dǎo)致耐藥病毒的自發(fā)突變導(dǎo)致耐藥株出現(xiàn)病毒顆粒的高復(fù)制率：1012-13個(gè)病毒顆粒/天自發(fā)突變的高發(fā)生率—HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏糾錯(cuò)功能：10-5

置換/堿基/循環(huán)每天每個(gè)堿基位置上都可能發(fā)生突變治療前耐藥突變株可能已存在病毒的自發(fā)突變導(dǎo)致耐藥株出現(xiàn)病毒顆粒的高復(fù)制率：1012-1HBV耐藥株如何成為優(yōu)勢株?適者生存:在抗病毒治療過程中，對藥物不敏感而具有生存優(yōu)勢的變異株成為成為優(yōu)勢株抗病毒治療SSSSSSSRRRRRRRSSHBV耐藥株如何成為優(yōu)勢株?適者生存:在抗病毒治療過程中核苷類藥物的耐藥機(jī)制病毒每日每時(shí)都在發(fā)生各種突變，包括對核苷類藥物的耐藥突變；但一般而言，突變株病毒復(fù)制能力弱于野生株，因此未用過核苷類藥物的病人總是野生株占優(yōu)勢。核苷類藥物的耐藥機(jī)制病毒每日每時(shí)都在發(fā)生各種突變，包括在應(yīng)用核苷類藥物后，敏感的野生株受到藥物的強(qiáng)烈抑制，逐漸減少消失，而自發(fā)出現(xiàn)的耐藥變異株不受藥物抑制，逐漸增多成為優(yōu)勢株。因此核苷類藥物對耐藥株病毒起到了選擇作用，而不是誘導(dǎo)突變的作用。核苷類藥物的耐藥機(jī)制在應(yīng)用核苷類藥物后，敏感的野生株受到核苷類藥物的耐藥機(jī)制StephenLLocarnini等分析：

HIV的抗病毒治療也會導(dǎo)致病毒耐藥，這是人們早就熟知的問題。但相比較而言，HBV發(fā)生耐藥變異的速度要慢很多。拉米夫定治療乙肝一年的耐藥率約20％，而拉米夫定治療HIV

時(shí)，最快1周就可能發(fā)生耐藥突變；JosephJSasadeusz,StephenLLocarnini,GraemeMacdonaldMJA2007,186:204StephenLLocarnini核苷類藥物治療核苷初治患者耐藥發(fā)生率<<<基因型耐藥或耐藥導(dǎo)致的病毒學(xué)反彈*拉米夫定,阿德福韋,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率,替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率1.2核苷類藥物治療核苷初治患者耐藥發(fā)生率<<<基因型耐藥或耐藥導(dǎo)核苷(酸)類藥物治療后

病毒耐藥的檢測檢測病毒耐藥變異的最常用的方法有：直接測序法限制性片段長度多態(tài)性分析法線性探針反向雜交法基因芯片法核苷(酸)類藥物治療后

病毒耐藥的檢測檢測病毒耐DNA序列分析法對病毒全基因或P基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增將PCR產(chǎn)物制備克隆挑選一定數(shù)量的克隆測序DNA序列分析法對病毒全基因或P基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增目的基因PCR產(chǎn)物變異株野生株P(guān)CR產(chǎn)物克隆PCR產(chǎn)物克隆序列分析（每例標(biāo)本20-25個(gè)克?。U(kuò)增目的基因PCR產(chǎn)物變異株野生株P(guān)CR產(chǎn)物克隆PCR產(chǎn)物克

直接序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)

可以發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括已上市藥物的新的變異位點(diǎn)和新藥的變異位點(diǎn)；2.靈敏度低，只有當(dāng)變異株數(shù)量超過DNA總量的20%時(shí)才能測出；3.選取克隆數(shù)量少時(shí)容易出現(xiàn)誤差；直接序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括已上市

限制性片段長度多態(tài)性分析法

RestrictionFragmentLengthPolymorphism

提取總HBVDNA，擴(kuò)增P基因突變區(qū)的DNA序列；用錯(cuò)配引物對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，目的是引入酶切位點(diǎn)；3.用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析：野生株和變異株因引入酶切位點(diǎn)的不同，在酶切后表現(xiàn)為不同的分子長度片段，電泳時(shí)出現(xiàn)不同的條帶，以此診斷野生株或是變異株；限制性片段長度多態(tài)性分析法

RestrictionFra野生株序列：TATATG736737738739740741TATGTG736737738739740741YVDD變異序列：TATATT736737738739740741YIDD變異序列：NdeI酶切位點(diǎn)：CATATG736737738739740741孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-492野生株序列：TATATGT引入酶切引物后的序列：CATATG736737738739740741野生株NdeICATGTG736737738739740741YVDD變異株NdeIYIDD變異株CATATT736737738739740741NdeI短片段長片段長片段孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-492引入酶切引物后的序列：CATAT

分子量標(biāo)記2.野生株陽性對照3.野生株4.混合變異5.變異株6.變異株孫劍等第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)1999，6:489-49211589分子量標(biāo)記2.野生株陽性對照孫劍等第RFLP方法的優(yōu)缺點(diǎn)

靈敏度高，能檢出低至5%的變異株；方法簡便易行；只能檢出已知位點(diǎn)，不能發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)；并非所有的變異位點(diǎn)都能使用RFLP法，因?yàn)橛行┳儺惒淮嬖谔禺愋缘拿盖形稽c(diǎn)；5.有些突變破壞了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，導(dǎo)致內(nèi)切酶失敗6.酶反應(yīng)條件的限制導(dǎo)致有些突變不能酶切。RFLP方法的優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，能檢出低至5%的變異株；

線性探針反向雜交法

(INNO-LIPAHBVDRv1.2.3)

將反向雜交探針包被于檢測條上；擴(kuò)增標(biāo)本HBVDNA-P區(qū)(A-F)；將PCR產(chǎn)物與檢測條上的探針雜交；顯色，閱讀結(jié)果。線性探針反向雜交法

(INNO-LIPAINNO-LIPAHBVDR第一代產(chǎn)品：檢測LAM變異的180和204位點(diǎn)；第二代產(chǎn)品：180+204+80+173（LAM）

181+236（ADV）第三代產(chǎn)品：兩個(gè)檢測條，第一條是v.2，第二個(gè)條是檢測ETV變異和TDV變異，并加入了ADV原發(fā)無應(yīng)答的變異；INNO-LIPAHBVDR第一代產(chǎn)品：檢測L針對不同的藥物，不同的變異位點(diǎn)，不同的變異方式，不同的基因型。共包被有54條探針，檢出11個(gè)位點(diǎn)變異123，4567891011針對不同的藥物，123，4567891011線性探針反向雜交法優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，可檢出5%的變異株；商品化試劑，操作方便快捷，結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確；只能檢出已知位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)新位點(diǎn)后必須增加新探針；因?yàn)椴《居卸喾N基因型，一個(gè)位點(diǎn)的突變，可能需要多個(gè)探針。最終為了檢出所有突變，需要大量不同的探針；6.商品試劑盒價(jià)格昂貴。線性探針反向雜交法優(yōu)缺點(diǎn)靈敏度高，可檢出5%的變異株；

基因芯片法同線性探針反向雜交方法類似。基因芯片又稱基因微矩陣(microarray)，它是將大量特定的基因片段(寡核苷酸片段)作為探針有序地、高密度地排列在固定載體上，然后與待測標(biāo)本進(jìn)行雜交，最后顯色，閱讀結(jié)果。基因芯片法同線性探針反向雜交方法類似。基因芯片檢測模式單萬水等全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議論文匯編，2008基因芯片檢測模式單萬水等全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會

病毒耐藥變異檢測的臨床意義

治療開始前的耐藥病毒檢測可以幫助選擇初治藥物；2.治療后的耐藥監(jiān)測有助于及時(shí)采取挽救治療措施；3.根據(jù)耐藥變異位點(diǎn)的不同選擇合適的藥物；病毒耐藥變異檢測的臨床意義治療開始前的耐藥病毒檢測可以幫

乙肝病毒耐藥位點(diǎn)拉米夫定：L80IV173LL180MM204IM204V恩替卡韋：V173LL180MA184GS202IM204IM204VM250V替比夫定M204I阿德福韋：A181V