第四、五講細菌典型生理生化鑒定技術(shù)講解課件

細菌典型生理生化鑒定技術(shù)鄭培君細菌典型生理生化鑒定技術(shù)鄭培君1第一節(jié)細菌的生化試驗第一節(jié)細菌的生化試驗2一、概述（一）、什么是生化試驗?指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。一、概述（一）、什么是生化試驗?3（二）檢驗細菌的生化試驗范圍1、糖（醇）類代謝試驗2、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗3、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗4、呼吸酶類試驗5、毒性酶類試驗（二）檢驗細菌的生化試驗范圍1、糖（醇）類代謝試驗4（三）生化試驗的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的pH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。（三）生化試驗的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、5（四）生化試驗的注意事項1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~24h。2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應(yīng)的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。4、應(yīng)做必要的對照試驗。5、提高陽性檢出率，至少挑取2~3待檢的疑似菌落分別進行試驗。（四）生化試驗的注意事項1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~6二、糖醇類代謝試驗（一）糖醇類發(fā)酵試驗（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗（三）V-P試驗（四）甲基紅（MethylRed）試驗MR（五）七葉苷水解試驗（六）甘油品紅試驗二、糖醇類代謝試驗（一）糖醇類發(fā)酵試驗7（一）糖醇類發(fā)酵試驗

原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1~2種糖醇，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。（一）糖醇類發(fā)酵試驗原理：不同的細菌對各種糖醇的分解81、常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇1、常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖92、試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置36±1.0℃

培養(yǎng)1~3天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接103、結(jié)果觀察和記錄記錄：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“⊕”表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示3、結(jié)果觀察和記錄記錄：11氣泡導(dǎo)管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣泡產(chǎn)生氣泡導(dǎo)管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣12（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

1、原理：細菌對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。

氧化型細菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細菌。（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗1、原理：132、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37℃培養(yǎng)2~4h天，每天觀察結(jié)果。2、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在143、結(jié)果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色）氧化型不產(chǎn)酸（綠色）產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)堿型不產(chǎn)酸（綠色）不產(chǎn)酸（綠色）3、結(jié)果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色15（三）V-P試驗1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。（三）V-P試驗1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸162、試驗方法（1）奧梅拉（O’Meara）法（2）貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法

2、試驗方法（1）奧梅拉（O’Meara）法17（１）奧梅拉法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，每1mL培養(yǎng)液加奧梅拉O’Meara試劑0.1mL，搖動試管1~2min，靜置于37℃恒溫箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定結(jié)果。（１）奧梅拉法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋18（2）貝立脫法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)2天，每2mL培養(yǎng)液先加入6%a-萘酚純酒精溶液1mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.4mL，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1℃培養(yǎng)4h，如顯現(xiàn)紅色為陽性，呈黃色或有類似銅色者，可判定為陰性。（2）貝立脫法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡19（3）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。（3）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于203、結(jié)果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P+（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-3、結(jié)果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P21（四）甲基紅試驗（MR）1、原理細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細菌可使丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。（四）甲基紅試驗（MR）1、原理細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后222、試驗方法挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3~5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，23MR-VP試驗原理及照片V-PMR-VP試驗原理及照片V-P243、結(jié)果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。3、結(jié)果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱25MR+MR-MR+MR-26（五）七葉苷水解試驗１、原理：七葉苷被細菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細菌。（五）七葉苷水解試驗１、原理：七葉苷被細菌分解后，生成葡萄272、試驗方法將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。2、試驗方法將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷283、結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏撸瑸殛栃?，記錄?（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏?，為陽性，?9（六）甘油品紅試驗1、原理：某些細菌可分解甘油成為丙酮酸，并進一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細菌。（六）甘油品紅試驗1、原理：302、試驗方法取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種313、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+32（六）甘油品紅試驗1、原理：某些細菌可分解甘油成為丙酮酸，并進一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細菌。（六）甘油品紅試驗1、原理：332、試驗方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。2、試驗方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接343、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+35（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗（二）H2S試驗（三）尿素酶試驗（四）氨基酸脫羧酶試驗（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗（六）明膠（Gelatin）液化試驗三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗36（一）靛基質(zhì)試驗1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚）。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細菌。（一）靛基質(zhì)試驗1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白372、試驗方法：所用試劑:（1）柯凡克(Kovacs)試劑;（2）歐—波試劑2、試驗方法：所用試劑:38

將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24~48h時后，加入柯凡克試劑數(shù)滴，輕搖試管，呈紅色者為陽性?；蜓卦嚬鼙诰徛尤霘W-波試劑約0.5mL覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽性反應(yīng)，無紅色者為陰性反應(yīng)。將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于3639靛基質(zhì)試驗原理及照片靛基質(zhì)+靛基質(zhì)試驗原理及照片靛基質(zhì)+403、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)，記+無紅色者，為陰性反應(yīng)，記-3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)，記+41（二）硫化氫（H2S）試驗1、原理：某些細菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細菌。（二）硫化氫（H2S）試驗1、原理：422、試驗方法：挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)上，于36±1℃培養(yǎng)24~48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法：挑取待檢菌，用穿刺接433、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+44（三）尿素酶試驗1、原理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。

（三）尿素酶試驗1、原理：452、試驗方法：

挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。2、試驗方法：挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌46尿素酶試驗圖陽性尿素酶試驗圖陽性473、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+48（四）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：某些細菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,可使賴氨酸、鳥氨酸生產(chǎn)脫羧作用,生成胺類物質(zhì)和CO2。胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。（四）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：492、試驗方法取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內(nèi)，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培503、結(jié)果觀察與記錄試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+試驗管、對照管都呈黃色，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+51試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃52陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色原理：對照管呈黃色，說明有細菌生長。在培養(yǎng)的早期（10~12h），細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，pH又回升至堿性，指示劑顯紫色。陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色53陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程：紫色→黃色→紫色陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程：54（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗1、原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細菌。（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗1、原理：552、試驗方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在36±1℃培養(yǎng)18~24h后，加入氯化鐵溶液4~5滴，轉(zhuǎn)動試管，使試劑與菌苔表面充分接觸，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸563、結(jié)果觀察與記錄試驗管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+無色為陰性，記-。3、結(jié)果觀察與記錄試驗管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+57加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色+加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色+58（六）明膠液化試驗

1、原理有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質(zhì)，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。（六）明膠液化試驗1、原理592、試驗方法挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置20~30min后，再觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，603、結(jié)果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。明膠凝固，為陰性，-。3、結(jié)果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。61四、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗檸檬酸鹽利用試驗丙二酸鹽利用試驗四、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗檸檬酸鹽利用試驗62（一）枸櫞酸鹽利用試驗

1、原理：某些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍由淡綠轉(zhuǎn)為深藍色，為陽性。（一）枸櫞酸鹽利用試驗

1、原理：632、試驗方法挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集643、結(jié)果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色65檸檬酸鹽試驗原理及斜面照片陽性+檸檬酸鹽試驗原理及斜面照片陽性+66（二）丙二酸鹽利用試驗1.原理:某些細菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源,丙二酸鹽被分解成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍色，為陽性，以此鑒別細菌。（二）丙二酸鹽利用試驗1.原理:672、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二683、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性,記+;培養(yǎng)基無顏色變化,為陰性,記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性,記+;69五、呼吸酶類試驗氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗氰化鉀試驗五、呼吸酶類試驗氧化酶試驗70（一）氧化酶試驗1.原理:氧化酶使細胞色素C氧化后，氧化型細胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物,再和α-萘酚結(jié)合,生成吲哚酚藍,呈藍色反應(yīng)，為陽性。（一）氧化酶試驗1.原理:71試劑1%α-萘酚-乙醇液1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1%α-萘酚-乙醇液722、試驗方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1~2滴在培養(yǎng)物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒內(nèi)判定試驗結(jié)果。2、試驗方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1~2滴733、結(jié)果觀察與記錄在30秒內(nèi)呈藍色反應(yīng),為陽性,記+不變色或為紅色者,為陰性,記-3、結(jié)果觀察與記錄在30秒內(nèi)呈藍色反應(yīng),為陽性,記+74成藍色為+不變色或為紅色為-成藍色為+不變色或為紅色為-75（二）過氧化氫酶試驗原理：某些細菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，即為陽性反應(yīng)。（二）過氧化氫酶試驗原理：762、試驗方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（773、結(jié)果觀察與記錄產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+78（三）硝酸鹽還原試驗1、原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。（三）硝酸鹽還原試驗1、原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，79試劑A、對氨基苯磺酸試劑B、α-萘胺試劑試劑A、對氨基苯磺酸試劑802、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在3813、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+82（四）氰化鉀試驗1.原理：氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌.（四）氰化鉀試驗1.原理：832、試驗方法取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌843、結(jié)果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+。對照管有菌生長，試驗管無菌生長為陰性。記-。3、結(jié)果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+85六、毒性酶類試驗溶血試驗鏈激酶試驗卵磷脂酶試驗血漿凝固酶試驗六、毒性酶類試驗溶血試驗86（一）溶血試驗1、原理：某些細菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細菌。（一）溶血試驗1、原理：872、試驗方法平板法試管法2、試驗方法88平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，3689溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（-丙型）溶血:菌落周圍無溶血環(huán)。溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出90甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血91試管法將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在36±1℃培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。試管法將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，923、結(jié)果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；無溶血現(xiàn)象，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；93（二）鏈激酶試驗1、原理：A群鏈球菌群能產(chǎn)生鏈激酶，該酶能使血液中的纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，而后溶解纖維蛋白，使血凝塊溶解,為陽性反應(yīng)。此試驗用于測定鏈球菌的致病性。陽性反應(yīng)具有致病性。（二）鏈激酶試驗1、原理：942、試驗方法吸取草酸鉀血漿0.2mL(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液)，加入0.8mL生理鹽水，混勻后，再加入待檢菌36℃下培養(yǎng)18-24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25mL，混勻，放37℃水浴中，2min觀察一次。2、試驗方法吸取草酸鉀血漿0.295

待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h后觀察。同時用肉浸液肉湯做陰性對照，用已知的鏈激酶陽性的菌株做陽性對照。待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。如2h963、結(jié)果觀察與記錄如凝塊全部溶化,為陽性+，凝塊24h仍不溶化,為陰性-3、結(jié)果觀察與記錄如凝塊全部溶化,為陽性+，97（三）卵磷脂酶試驗1、原理：某些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，在鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸膽堿，在卵黃瓊脂平板上菌落周圍形成不透明的乳濁環(huán)或混濁白環(huán)，或使血清、卵黃液變混濁，以此鑒別細菌。（三）卵磷脂酶試驗1、原理：982、試驗方法（1）卵黃平板法：A法：將待檢菌培養(yǎng)物劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)3～6h，觀察結(jié)果。

2、試驗方法（1）卵黃平板法：99菌落白色混濁環(huán)，菌落白色混濁環(huán)，100B法：先用卵黃磷脂酶抗血清將平板涂一半，置于36℃待干后，將待檢菌接種于未涂抗血清的一半卵黃瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)劃已涂過抗血清的一半，36±1℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周圍形成較大的不透明乳白色混濁區(qū)，在涂抗血清的一半平板上，菌落周圍無不透明混濁區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。B法：101菌落周圍無混濁白環(huán)菌落周圍有混濁白環(huán)乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應(yīng)抗血清所抑制，菌落周圍菌落周圍乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂102（2）卵黃鹽水法將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌過濾，收集濾液。在兩支滅菌試管內(nèi)，每管加入1%卵黃鹽水0.4mL,在一管中加入濾液0.2mL，另一管加入生理鹽水0.2mL作對照。在36℃水浴中，經(jīng)2h、4h、8h、24h觀察結(jié)果。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性。（2）卵黃鹽水法將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌1033、結(jié)果觀察與記錄菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性兩管無沉淀者，為陰性。3、結(jié)果觀察與記錄菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。104（四）血漿凝固酶試驗1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。（四）血漿凝固酶試驗1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固1052、試驗方法（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。2、試驗方法（1）玻片法：106有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗107陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固108金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗1093、試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者為陽性；均無凝固則為陰性。3、試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照110三糖鐵（TSI）試驗三糖鐵（TSI）試驗1111、三糖鐵試驗的原理如果細菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。1、三糖鐵試驗的原理如果細菌可利用乳糖和112制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S斜面紅色，底部黃色，產(chǎn)生H2S底面黃色，并產(chǎn)生CO2制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃1132、試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。2、試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物114下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌115第二節(jié)血清學(xué)試驗血清學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，所出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。第二節(jié)血清學(xué)試驗血清學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體116一、抗原與抗體一、抗原與抗體117（一）抗原1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激機體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。（一）抗原1、抗原的概念1182、抗原的特性免疫原性反應(yīng)原性2、抗原的特性免疫原性119（二）抗體1、抗體：是指機體內(nèi)的淋巴系統(tǒng)細胞在抗原物質(zhì)的激發(fā)下，所合成的一種具有特異性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。

（二）抗體1、抗體：是指機體內(nèi)的淋巴系統(tǒng)細胞在抗原120第四、五講細菌典型生理生化鑒定技術(shù)講解課件1212、抗體的理化性質(zhì)（1）抗體是球蛋白（2）免疫球蛋白2、抗體的理化性質(zhì)（1）抗體是球蛋白122兔血清電泳分離圖兔血清電泳分離圖123經(jīng)對不同免疫血清的電泳分析，超速離心分析和分子量測定等方法，發(fā)現(xiàn)大部分抗體活性存在于γ球蛋白內(nèi)，但有小部分抗體活性可存在于β球蛋白內(nèi)。它們的離心常數(shù)分別為7S和平共處19S，分子量分別為16萬和90萬。因此它們分別被命名為7Sγ球蛋白分子（16萬）19Sβ2巨球蛋白分子(β2M,90萬)和β2A球蛋白分子，所以從早期對抗體性質(zhì)的研究證明抗體不是由均質(zhì)性球蛋白組成，而是由異性球蛋白組成。經(jīng)對不同免疫血清的電泳分析，超速離心分析和分子量測定等方法，124（三）抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)

（三）抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗125第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ):抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體126靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力靜電引力抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力127抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖128抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖二、抗原抗體的親和力和親合力抗體分子上一個抗原結(jié)合點與對應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著129

可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物(疏水膠體)電解質(zhì)抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)

+三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物電解質(zhì)抗原抗體+130第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點特異性可逆性比例性階段性第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點131特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補性一、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分132

133兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此134二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對復(fù)合物的影響－pH、離子強度

二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下135前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系三、比例性前帶(prezone)：抗體過量抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例136第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象四、階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見四、階段性137第三節(jié)影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素環(huán)境因素第三節(jié)影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素138一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目139電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適二、環(huán)境因素電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液二、環(huán)境因素140反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗同上抗球蛋白試驗同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補體參與的反應(yīng)補體溶血試驗觀察測定溶血現(xiàn)象補體結(jié)合試驗同上第四節(jié)免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗觀察凝集現(xiàn)象間接141反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗檢測病毒感染性毒素中和試驗檢測外毒素毒性標記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)檢測熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)檢測放射性強度酶免疫技術(shù)檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)檢測發(fā)光強度金免疫技術(shù)檢測金顆粒沉淀反應(yīng)類型實驗技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗檢測病毒感染性毒142按實際用途分為:①免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistrytechnique,IHCT)②免疫測定(immunoassay)按檢測現(xiàn)象分為:

①放射免疫技術(shù)②熒光免疫技術(shù)③酶免疫技術(shù)④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)⑤金免疫技術(shù)按測定反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分為:

①均相免疫測定(homogenousimmunoassay）②非均相免疫測定(heterogenousimmunoassay)

標記免疫技術(shù)：用熒光物質(zhì)、放射性核素、酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標記抗原或抗體，進行抗原抗體反應(yīng)后，通過檢測標記物對抗原或抗體進行定性、定位或定量分析按實際用途分為:按檢測現(xiàn)象分為:按測定反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分143診斷血清及類型診斷血清：將已知的抗原注射于動物體，使其產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，采出動物的血液，分離出含有大量抗體的血清，稱為診斷血清（或抗血清、免疫血清）抗O血清：用菌體抗原（O抗原）免疫動物后所獲得的血清?？笻血清：用鞭毛抗原（H抗原）免疫動物后所獲得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌體免疫動物后所獲得的血清。診斷血清及類型診斷血清：將已知的抗原注射于動物體，使其產(chǎn)生相144多價診斷血清：用含有兩種（型）的菌體免疫動物后所獲得的血清。單價診斷血清：只含有一種（型）特異性抗體的血清。因子診斷血清：把含有多種抗體的混合免疫血清，用具有共同抗原成分的有關(guān)細菌將其共同抗體吸收，只留下一種或幾種所需的特異性抗體的血清。診斷血清及類型多價診斷血清：用含有兩種（型）的菌體免疫動物后所獲得的血清。145小結(jié)抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。抗原抗體之間的結(jié)合力涉及靜電引力、范德華引力、氫鍵和疏水作用力。抗原抗體反應(yīng)的特點是特異性、可逆性、比例性和階段性。影響抗原抗體反應(yīng)的因素包括反應(yīng)物的自身因素和環(huán)境因素。免疫學(xué)檢測技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，免疫學(xué)技術(shù)有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)、中和反應(yīng)和標記免疫反應(yīng)五種類型。小結(jié)抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性146思考題1.VP試驗測定為什么要加入NaOH和肌酸，它們各起什么作用？2.為什么做各項生理生化反應(yīng)時要有空白對照組？思考題1.VP試驗測定為什么要加入NaOH和肌酸，它們各起什147細菌典型生理生化鑒定技術(shù)鄭培君細菌典型生理生化鑒定技術(shù)鄭培君148第一節(jié)細菌的生化試驗第一節(jié)細菌的生化試驗149一、概述（一）、什么是生化試驗?指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。一、概述（一）、什么是生化試驗?150（二）檢驗細菌的生化試驗范圍1、糖（醇）類代謝試驗2、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗3、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗4、呼吸酶類試驗5、毒性酶類試驗（二）檢驗細菌的生化試驗范圍1、糖（醇）類代謝試驗151（三）生化試驗的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的pH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。（三）生化試驗的方法在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、152（四）生化試驗的注意事項1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~24h。2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應(yīng)的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。4、應(yīng)做必要的對照試驗。5、提高陽性檢出率，至少挑取2~3待檢的疑似菌落分別進行試驗。（四）生化試驗的注意事項1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18~153二、糖醇類代謝試驗（一）糖醇類發(fā)酵試驗（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗（三）V-P試驗（四）甲基紅（MethylRed）試驗MR（五）七葉苷水解試驗（六）甘油品紅試驗二、糖醇類代謝試驗（一）糖醇類發(fā)酵試驗154（一）糖醇類發(fā)酵試驗

原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1~2種糖醇，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。（一）糖醇類發(fā)酵試驗原理：不同的細菌對各種糖醇的分解1551、常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇1、常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖1562、試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置36±1.0℃

培養(yǎng)1~3天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接1573、結(jié)果觀察和記錄記錄：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“⊕”表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示3、結(jié)果觀察和記錄記錄：158氣泡導(dǎo)管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣泡產(chǎn)生氣泡導(dǎo)管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣159（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗

1、原理：細菌對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。

氧化型細菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細菌。（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗1、原理：1602、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37℃培養(yǎng)2~4h天，每天觀察結(jié)果。2、方法取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在1613、結(jié)果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色）氧化型不產(chǎn)酸（綠色）產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)堿型不產(chǎn)酸（綠色）不產(chǎn)酸（綠色）3、結(jié)果觀察與記錄封油管未封油管發(fā)酵型產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)酸（黃色162（三）V-P試驗1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。（三）V-P試驗1、原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸1632、試驗方法（1）奧梅拉（O’Meara）法（2）貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法

2、試驗方法（1）奧梅拉（O’Meara）法164（１）奧梅拉法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)48h，每1mL培養(yǎng)液加奧梅拉O’Meara試劑0.1mL，搖動試管1~2min，靜置于37℃恒溫箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定結(jié)果。（１）奧梅拉法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋165（2）貝立脫法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)2天，每2mL培養(yǎng)液先加入6%a-萘酚純酒精溶液1mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.4mL，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1℃培養(yǎng)4h，如顯現(xiàn)紅色為陽性，呈黃色或有類似銅色者，可判定為陰性。（2）貝立脫法：將試驗菌接種于磷酸鹽葡166（3）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。（3）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于1673、結(jié)果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P+（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-3、結(jié)果觀察與記錄（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P168（四）甲基紅試驗（MR）1、原理細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細菌可使丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。（四）甲基紅試驗（MR）1、原理細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后1692、試驗方法挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3~5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，170MR-VP試驗原理及照片V-PMR-VP試驗原理及照片V-P1713、結(jié)果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。3、結(jié)果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱172MR+MR-MR+MR-173（五）七葉苷水解試驗１、原理：七葉苷被細菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細菌。（五）七葉苷水解試驗１、原理：七葉苷被細菌分解后，生成葡萄1742、試驗方法將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。2、試驗方法將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷1753、結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏撸瑸殛栃?，記錄?（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏?，為陽性，?76（六）甘油品紅試驗1、原理：某些細菌可分解甘油成為丙酮酸，并進一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細菌。（六）甘油品紅試驗1、原理：1772、試驗方法取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種1783、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+179（六）甘油品紅試驗1、原理：某些細菌可分解甘油成為丙酮酸，并進一步脫羧生成乙醛，乙醛與無色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細菌。（六）甘油品紅試驗1、原理：1802、試驗方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對照，觀察結(jié)果。2、試驗方法：取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接1813、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+；（2）與對照管顏色相同者,為陰性，記錄為-3、結(jié)果觀察與記錄（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽性，記錄為+182（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗（二）H2S試驗（三）尿素酶試驗（四）氨基酸脫羧酶試驗（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗（六）明膠（Gelatin）液化試驗三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗183（一）靛基質(zhì)試驗1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚）。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細菌。（一）靛基質(zhì)試驗1、原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白1842、試驗方法：所用試劑:（1）柯凡克(Kovacs)試劑;（2）歐—波試劑2、試驗方法：所用試劑:185

將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)24~48h時后，加入柯凡克試劑數(shù)滴，輕搖試管，呈紅色者為陽性?；蜓卦嚬鼙诰徛尤霘W-波試劑約0.5mL覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽性反應(yīng)，無紅色者為陰性反應(yīng)。將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于36186靛基質(zhì)試驗原理及照片靛基質(zhì)+靛基質(zhì)試驗原理及照片靛基質(zhì)+1873、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)，記+無紅色者，為陰性反應(yīng)，記-3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應(yīng)，記+188（二）硫化氫（H2S）試驗1、原理：某些細菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細菌。（二）硫化氫（H2S）試驗1、原理：1892、試驗方法：挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)上，于36±1℃培養(yǎng)24~48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法：挑取待檢菌，用穿刺接1903、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+191（三）尿素酶試驗1、原理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。

（三）尿素酶試驗1、原理：1922、試驗方法：

挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。2、試驗方法：挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌193尿素酶試驗圖陽性尿素酶試驗圖陽性1943、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽性，記+195（四）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：某些細菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,可使賴氨酸、鳥氨酸生產(chǎn)脫羧作用,生成胺類物質(zhì)和CO2。胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。（四）氨基酸脫羧酶試驗1、原理：1962、試驗方法取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內(nèi)，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培1973、結(jié)果觀察與記錄試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+試驗管、對照管都呈黃色，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄試驗管呈紫色，對照管呈黃色，為陽性，記+198試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃199陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色原理：對照管呈黃色，說明有細菌生長。在培養(yǎng)的早期（10~12h），細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，pH又回升至堿性，指示劑顯紫色。陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色200陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程：紫色→黃色→紫色陽性反應(yīng)試驗管顏色變化過程：201（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗1、原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細菌。（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗1、原理：2022、試驗方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在36±1℃培養(yǎng)18~24h后，加入氯化鐵溶液4~5滴，轉(zhuǎn)動試管，使試劑與菌苔表面充分接觸，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸2033、結(jié)果觀察與記錄試驗管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+無色為陰性，記-。3、結(jié)果觀察與記錄試驗管立即出現(xiàn)綠色，為陽性，記+204加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色+加氯化鐵試劑出現(xiàn)綠色+205（六）明膠液化試驗

1、原理有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質(zhì)，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。（六）明膠液化試驗1、原理2062、試驗方法挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置20~30min后，再觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取培養(yǎng)18~24h的待試菌，2073、結(jié)果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。明膠凝固，為陰性，-。3、結(jié)果觀察與記錄明膠液化，為陽性，+。208四、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗檸檬酸鹽利用試驗丙二酸鹽利用試驗四、有機酸鹽和銨鹽的利用試驗檸檬酸鹽利用試驗209（一）枸櫞酸鹽利用試驗

1、原理：某些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍由淡綠轉(zhuǎn)為深藍色，為陽性。（一）枸櫞酸鹽利用試驗

1、原理：2102、試驗方法挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集2113、結(jié)果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色212檸檬酸鹽試驗原理及斜面照片陽性+檸檬酸鹽試驗原理及斜面照片陽性+213（二）丙二酸鹽利用試驗1.原理:某些細菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源,丙二酸鹽被分解成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍色，為陽性，以此鑒別細菌。（二）丙二酸鹽利用試驗1.原理:2142、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二2153、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性,記+;培養(yǎng)基無顏色變化,為陰性,記-3、結(jié)果觀察與記錄培養(yǎng)基由草綠色變成藍色,為陽性,記+;216五、呼吸酶類試驗氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗氰化鉀試驗五、呼吸酶類試驗氧化酶試驗217（一）氧化酶試驗1.原理:氧化酶使細胞色素C氧化后，氧化型細胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物,再和α-萘酚結(jié)合,生成吲哚酚藍,呈藍色反應(yīng)，為陽性。（一）氧化酶試驗1.原理:218試劑1%α-萘酚-乙醇液1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1%α-萘酚-乙醇液2192、試驗方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1~2滴在培養(yǎng)物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒內(nèi)判定試驗結(jié)果。2、試驗方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1~2滴2203、結(jié)果觀察與記錄在30秒內(nèi)呈藍色反應(yīng),為陽性,記+不變色或為紅色者,為陰性,記-3、結(jié)果觀察與記錄在30秒內(nèi)呈藍色反應(yīng),為陽性,記+221成藍色為+不變色或為紅色為-成藍色為+不變色或為紅色為-222（二）過氧化氫酶試驗原理：某些細菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，即為陽性反應(yīng)。（二）過氧化氫酶試驗原理：2232、試驗方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（2243、結(jié)果觀察與記錄產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+225（三）硝酸鹽還原試驗1、原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。（三）硝酸鹽還原試驗1、原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，226試劑A、對氨基苯磺酸試劑B、α-萘胺試劑試劑A、對氨基苯磺酸試劑2272、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。2、試驗方法取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在32283、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+229（四）氰化鉀試驗1.原理：氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌.（四）氰化鉀試驗1.原理：2302、試驗方法取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。2、試驗方法取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌2313、結(jié)果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+。對照管有菌生長，試驗管無菌生長為陰性。記-。3、結(jié)果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+232六、毒性酶類試驗溶血試驗鏈激酶試驗卵磷脂酶試驗血漿凝固酶試驗六、毒性酶類試驗溶血試驗233（一）溶血試驗1、原理：某些細菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細菌。（一）溶血試驗1、原理：2342、試驗方法平板法試管法2、試驗方法235平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36236溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（-丙型）溶血:菌落周圍無溶血環(huán)。溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出237甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血238試管法將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在36±1℃培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。試管法將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，2393、結(jié)果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；無溶血現(xiàn)象，為陰性，記-3、結(jié)果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；240（二）鏈激酶試驗1、原理：A群鏈球菌群能產(chǎn)生鏈激酶，該酶能使血液中的纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，而后溶解纖維蛋白，使血凝塊溶解,為陽性反應(yīng)。此試驗用于測定鏈球菌的致病性。陽性反應(yīng)具有致病性。（二）鏈激酶試驗1、原理：2412、試驗方法吸取草酸鉀血漿0.2mL(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液)，加入0.8mL生理鹽水，混勻后，再加入待檢菌36℃下培養(yǎng)18-24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25mL，混勻，放37℃水浴中，2min觀察一次。2、試驗方法吸取草酸鉀血漿0.2242

待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h后觀察。同時用肉浸液肉湯做陰性對照，用已知的鏈激酶陽性的菌株做陽性對照。待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。如2h2433、結(jié)果觀察與記錄如凝塊全部溶化,為陽性+，凝塊24h仍不溶化,為陰性-3、結(jié)果觀察與記錄如凝塊全部溶化,為陽性+，244（三）卵磷脂酶試驗1、原理：某些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，在鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸膽堿，在卵黃瓊脂平板上菌落周圍形成不透明的乳濁環(huán)或混濁白環(huán)，或使血清、卵黃液變混濁，以此鑒別細菌。（三）卵磷脂酶試驗1、原理：2452、試驗方法（1）卵黃平板法：A法：將待檢菌培養(yǎng)物劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)3～6h，觀察結(jié)果。

2、試驗方法（1）卵黃平板法：246菌落白色混濁環(huán)，菌落白色混濁環(huán)，247B法：先用卵黃磷脂酶抗血清將平板涂一半，置于36℃待干后，將待檢菌接種于未涂抗血清的一半卵黃瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)劃已涂過抗血清的一半，36±1℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周圍形成較大的不透明乳白色混濁區(qū)，在涂抗血清的一半平板上，菌落周圍無不透明混濁區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。B法：248菌落周圍無混濁白環(huán)菌落周圍有混濁白環(huán)乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應(yīng)抗血清所抑制，菌落周圍菌落周圍乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂249（2）卵黃鹽水法將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌過濾，收集濾液。在兩支滅菌試管內(nèi)，每管加入1%卵黃鹽水0.4mL,在一管中加入濾液0.2mL，另一管加入生理鹽水0.2mL作對照。在36℃水浴中，經(jīng)2h、4h、8h、24h觀察結(jié)果。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性。（2）卵黃鹽水法將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌2503、結(jié)果觀察與記錄菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。兩邊均無不透明區(qū)，為陰性。管底發(fā)生混濁沉淀，對照管無沉淀者，為陽性兩管無沉淀者，為陰性。3、結(jié)果觀察與記錄菌落周圍形成較大的不透明區(qū)，為陽性。251（四）血漿凝固酶試驗1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。（四）血漿凝固酶試驗1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固2522、試驗方法（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。2、試驗方法（1）玻片法：253有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗254陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固255金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗2563、試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者為陽性；均無凝固則為陰性。3、試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照257三糖鐵（TSI）試驗三糖鐵（TSI）試驗2581、三糖鐵試驗的原理如果細菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。1、三糖鐵試驗的原理如果細菌可利用乳糖和259制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S斜面紅色，底部黃色，產(chǎn)生H2S底面黃色，并產(chǎn)生CO2制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃2602、試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。2、試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物261下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌262第二節(jié)血清學(xué)試驗血清學(xué)反應(yīng)：指