家畜傳染病學(xué)、禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

家畜傳染病學(xué)、禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)王川慶劉紅英陳陸河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院二零零四年二月一日

目錄第一局部根本技術(shù)一、消毒二、免疫接種三、剖檢技術(shù)及病變檢查要點(diǎn)四、細(xì)菌別離、培養(yǎng)技術(shù)五、藥敏試驗(yàn)六、病毒別離培養(yǎng)技術(shù)七、雞胚接種技術(shù)八、動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)九、病原體的鑒定方法第二局部傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)一、雞新城疫的診斷及免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)二、減蛋綜合征的診斷及抗體檢測(cè)三、馬立克氏病瓊擴(kuò)試驗(yàn)四、雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)試驗(yàn)五、雞傳染性喉氣管炎的診斷六、傳染性支氣管炎的診斷及防制七、包涵體肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷八、禽腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)室診斷九、雞傳染性貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷十、禽霍亂的診斷十一、雞白痢的檢疫十二、雞枝原體的檢疫十三、大腸桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷十四、禽流感的實(shí)驗(yàn)室診斷十五、炭疽的診斷和防治十六、布病的實(shí)驗(yàn)室診斷十七、結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷十八、巴氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷十九、口蹄疫的實(shí)驗(yàn)室診斷二十、兔瘟的診斷二十一、乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)豬細(xì)小病毒二十二、犬細(xì)小病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷二十三、間接血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定豬瘟抗體二十四、乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體二十五、乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)豬偽狂犬病毒抗體二十六、乳膠凝集試驗(yàn)測(cè)豬萎縮性鼻炎病毒抗體二十七、豬圓環(huán)病毒的血清學(xué)診斷第三局部疫苗制造技術(shù)新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造二、雞新城疫Ⅱ系弱毒疫苗的制造三、雞新城疫LaSota系弱毒疫苗的制造四、雞痘鵪鶉化弱毒疫苗制造五、氫氧化鋁膠苗的制造六、動(dòng)物臟器組織滅活疫苗的制造七、油乳劑滅活疫苗的制造八、豬瘟兔化弱毒苗的制備第四局部抗體制備技術(shù)傳染性法氏囊病高免卵黃抗體的制備二、抗新城疫高免血清的制備三、豬瘟高免血清的制備及應(yīng)用四、抗體提純技術(shù)

第一局部根本技術(shù)一、消毒1．人員的消毒：所有進(jìn)入禽場(chǎng)生產(chǎn)區(qū)的人員，必須在更衣室內(nèi)更衣?lián)Q鞋，然前方可進(jìn)入場(chǎng)區(qū)。要控制或謝絕參觀人員進(jìn)入禽舍內(nèi)。在場(chǎng)區(qū)(生產(chǎn)區(qū))入口應(yīng)設(shè)有噴霧消毒裝置和消毒池。噴霧消毒藥物可用0.1%新潔爾滅或3～5%來蘇兒，使用新潔爾滅時(shí)應(yīng)防止與肥皂或堿類接觸，以防減弱其殺菌能力，消毒池要經(jīng)常更換消毒藥液。凡進(jìn)入場(chǎng)內(nèi)的人員及車輛都必須經(jīng)過消毒。也可采用紫外線照射消毒。2．禽舍消毒：禽舍在消毒前必須進(jìn)行徹底清掃與沖刷，以增強(qiáng)消毒效果，一般按以下步驟進(jìn)行消毒：向禽舍的空間噴灑霧狀消毒劑，使禽舍內(nèi)空中飄浮的塵埃沉落，常用藥為3～5%的來蘇兒溶液。將舍內(nèi)一切可移動(dòng)的設(shè)備移出。進(jìn)行洗刷和消毒。夏季應(yīng)盡量利用陽(yáng)光曝曬消毒；用1～2%熱氫氧化鈉，20%草木灰，10～20%石灰乳洗刷墻壁和地面；金屬籠或用具沖洗晾干后，用0.1%新潔爾滅溶液噴灑，或用火焰噴射消毒。最后將禽舍密閉堵嚴(yán)，用甲醛熏蒸消毒。根據(jù)禽舍污染微生物種類和密閉程度，一般每平方米空間用甲醛20～40毫升，高錳酸鉀是甲醛的半量(即2毫升甲醛、1克高錳酸鉀、1毫升清水)放在大容量瓷器內(nèi)進(jìn)行熏蒸消毒。操作時(shí)先把盛有高錳酸鉀的瓷器放在需要煙熏消毒的地方，然后參加甲醛，決不可將高錳酸鉀加到甲醛中去，這兩種藥物結(jié)合后生成大量的熱，所以在操作完后應(yīng)立即離開現(xiàn)場(chǎng)，切忌使煙霧進(jìn)入眼內(nèi)。熏蒸時(shí)間最少2～4小時(shí)，延長(zhǎng)至8小時(shí)更好，消毒后，要翻開窗戶，排除剩余的甲醛蒸氣，消毒后的禽舍應(yīng)閉置1～2周后再使用。3．用具的消毒：禽場(chǎng)的蛋箱、籠子、雛盒、工具等。應(yīng)先洗刷干凈，晾干或曬干，再放到密閉的房間內(nèi)用甲醛熏蒸5～10小時(shí)，進(jìn)行嚴(yán)格消毒。4．孵化消毒：種蛋的消毒方法很多，下面介紹幾種：(1)福爾馬林消毒法：將種蛋放入孵化機(jī)內(nèi)，關(guān)閉進(jìn)、出氣孔和鼓風(fēng)機(jī)。每立方米用30毫升福爾馬林，另加15克高錳酸鉀，經(jīng)20～30分鐘后，翻開門和進(jìn)出氣孔，開動(dòng)鼓風(fēng)機(jī)。這種方法對(duì)病毒和霉形體的消毒效果顯著。(2)新潔爾滅消毒法：新潔爾滅溶液呈堿性，忌與肥皂、碘、高錳酸鉀配用。消毒種蛋時(shí)配成千分之一濃度的溶液。噴于種蛋外表。有較強(qiáng)的除污和消毒作用。(3)氯消毒法：將種蛋浸入含1.5%活性氯的漂白粉溶液中3分鐘，取出晾干。(4)高錳酸鉀消毒法：用千分之5的高錳酸鉀溶液泡種蛋1分鐘，取出晾干。注意高錳酸鉀溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。(5)紅霉素消毒法：將孵化前的種蛋先加溫至℃，然后置于2～4℃紅霉素溶液中。浸泡15分鐘。紅霉素溶液的濃度是每1000毫升含400～1000毫克。(6)氫氧化鈉消毒法：將種蛋浸泡在0.5%的氫氧化鈉溶液中5分鐘。能有效地殺滅蛋殼外表的鼠傷寒沙門氏菌。(7)慶大霉素消毒：用100毫升水含慶大霉素的溶液浸泡種蛋，能殺死種蛋中嚴(yán)重污染的沙門氏菌。孵化室每天用3%來蘇兒噴灑消毒，蛋盤、出雛器用3%來蘇兒洗刷消毒后，再用清水沖洗干凈。5．環(huán)境消毒：禽場(chǎng)周圍每季度噴灑消毒一次，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)每年更換一次表土或清掃干凈用火焰徹底消毒。6．糞便消毒：最常用生物熱消毒法。即用堆糞法進(jìn)行消毒。在距離場(chǎng)100米以外設(shè)一糞場(chǎng)。堆糞的方法如下：在地面挖一淺溝，深紅約20厘米、寬約1.5～2米，長(zhǎng)度不限，隨糞便多少而定。先將非傳染性的糞便或秸、稈等堆至25厘米厚，其上堆入欲消毒的糞便、墊草等，高達(dá)1～，然后在糞堆外面再鋪上10厘米厚的非傳染性的糞便或麥草，并覆蓋10厘米厚的沙子或土，如此堆入三個(gè)星期到三個(gè)月，即可用以肥田，假設(shè)糞便太干可參加適量水，當(dāng)糞便較稀時(shí)應(yīng)加雜草，使其不稀不干，以促其迅速發(fā)酵。7．帶動(dòng)物消毒：常用藥物有過氧乙酸、新潔爾滅、抗毒威等，可按說明使用。消毒藥種類很多，理想的消毒藥物應(yīng)具有以下特性：(1)價(jià)廉易得；(2)對(duì)人、畜平安；(3)易溶于硬水；(4)對(duì)用具和紡織物不會(huì)損傷；(5)在空氣中較穩(wěn)定；(6)無(wú)惡臭味；(7)無(wú)剩余毒性；(8)在肉或蛋中不會(huì)有積存；(9)對(duì)殺滅大多數(shù)病原微生物有效。目前尚無(wú)一種消毒藥能全部符合上述要求，因此選用消毒藥時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定，常用化學(xué)消毒劑見表1。表1常用化學(xué)消毒劑消毒劑名稱使用濃度使用對(duì)象考前須知苛性鈉(火堿)1～3%熱溶液禽舍、車船、用具等對(duì)病毒性傳染病消毒效果很好。但對(duì)皮膚有腐蝕作用禽舍消毒后數(shù)小時(shí)用清水沖洗后才能放入家禽。生石灰10～20%乳劑同上必須新鮮配制。如用1～2%堿水和5～10%石灰乳混合液消毒效果更好。草木灰10～20%熱溶液同上用10公斤水和2公斤草木灰煮沸2小時(shí)，過濾后備用，用時(shí)再加2～4倍熱水稀釋。漂白粉0.5%～20%一般常用為2～5%飲水、污水、禽舍、用具、車船、土壤和排泄物含氯量應(yīng)在25%以上，新鮮配制，用其澄清液，對(duì)金屬用具和衣物有腐蝕作用。禽舍消毒后應(yīng)徹底通風(fēng)以防中毒。來蘇兒(石炭酸)2～5%器械、用具和洗手等用于含大量蛋白質(zhì)的分泌物或排泄物消毒時(shí)，效果不夠好。臭藥水5～10%禽舍、土壤和用具等即來蘇兒粗制品，注意點(diǎn)同上福爾馬林(甲醛溶液)5～10%孵化器、蛋殼、蛋盤等空氣消毒時(shí)可用福爾馬林熏蒸法，每立方米空間用福爾馬林20毫升，加10克高錳酸鉀和10毫升水在瓷器內(nèi)，室內(nèi)密閉消毒至少半小時(shí)后徹底通風(fēng)新潔爾滅0.1%蛋殼消毒，洗手且市售5%新潔爾滅20毫升，加25%亞硝酸鈉20毫升，清水加至1000毫升即成。使用時(shí)不能接觸肥皂或洗衣粉。過氧乙酸0.2～0.5%禽舍、除金屬制品外，可用于各種對(duì)象對(duì)各種病原微生物殺滅效果都很好，價(jià)格低廉，無(wú)公害，禽舍消毒時(shí)可噴霧，用具可浸泡二、免疫接種免疫接種是預(yù)防和控制傳染病的一項(xiàng)極為重要的措施。免疫接種就是用人工的方法，把有效疫苗或菌苗引入動(dòng)物體內(nèi)，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抵抗力，使易感動(dòng)物轉(zhuǎn)化為有抵抗力的動(dòng)物，以免傳染病的發(fā)生和流行。免疫接種的目的，就是提高動(dòng)物對(duì)傳染病的抵抗力，預(yù)防傳染，保證動(dòng)物健康。(一)免疫程序的制訂免疫程序就是預(yù)防方案，它包括預(yù)防疾病的種類、疫苗的選擇、免疫次數(shù)、免疫時(shí)間、免疫方法、聯(lián)合用苗等內(nèi)容。沒有任何一個(gè)免疫程序能適用所有地區(qū)或不同類型的養(yǎng)殖場(chǎng)。因此，每一個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)都應(yīng)按照自己的實(shí)際情況制訂適合本場(chǎng)特點(diǎn)的免疫程序。只有這樣才能有效地預(yù)防傳染病的發(fā)生。免疫程序的制訂，至少考慮以下8個(gè)方面的因素：(1)當(dāng)?shù)丶膊〉牧餍星闆r及嚴(yán)重程度；(2)母源抗體的水平；(3)上一次免疫接種引起的剩余抗體水平；(4)家禽的免疫應(yīng)答能力；(5)疫苗的種類；(6)免疫接種方法；(7)各種疫苗接種的配合；(8)對(duì)動(dòng)物全身健康及生產(chǎn)能力的影響。這8個(gè)因素是互相聯(lián)系，互相制約的，必須統(tǒng)籌考慮。一般來說，免疫程序的制訂首先要考慮當(dāng)?shù)丶膊〉牧餍星闆r及嚴(yán)重程度。據(jù)此才能決定需要接種什么種類的疫苗，到達(dá)什么樣的免疫水平。首次免疫接種時(shí)間確實(shí)定，除了考慮疾病的流行情況外，主要取決于母源抗體的水平。如新城疫母源抗體滴度低的要早接種；母源抗體滴度高的推遲接種效果更好。(二)疫苗的種類預(yù)防動(dòng)物傳染病的疫苗可分為兩大類：一類是滅活疫苗，是把病毒或細(xì)菌滅活后制成的；類是活毒疫苗或弱毒疫苗，一般是用毒力較弱，不會(huì)引起動(dòng)物發(fā)病的活病毒或細(xì)菌制成的。弱毒疫苗按生產(chǎn)過程不同，又分為濕苗及凍干苗兩種。一般來說濕苗使用方便，免疫效果好，但不能長(zhǎng)期保存，而凍干苗保存期長(zhǎng)。下面是幾種常用的家禽疫苗。1．目前我國(guó)已生產(chǎn)的新城疫疫苗有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等四個(gè)品系，它是把新城疫疫苗病毒接種于雞胚經(jīng)一定時(shí)間培養(yǎng)后制成的活毒疫苗。Ⅰ系疫苗(又稱為印度系)毒力較強(qiáng)，其次是Ⅳ系疫苗(Lasota)，Ⅱ系(B1系)苗毒力較弱，Ⅲ系(F系)苗最弱。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系苗適用于雛雞和成雞，一般接種后不會(huì)引起嚴(yán)重反響，只出現(xiàn)輕微呼吸道病癥或完全沒有病癥。但Ⅰ系苗毒力比擬強(qiáng)，只供2個(gè)月以上雞使用，接種后引起的反響比擬重，然而免疫效力最強(qiáng)。適合疾病嚴(yán)重流行的地區(qū)使用。一般來說，為了平安起見，在使用Ⅰ系苗之前，要先用Ⅱ系或Ⅲ系苗進(jìn)行根底免疫。另外，目前還用Ⅳ系弱毒苗滅活后制成的新城疫油乳劑滅活疫苗，效果優(yōu)于各種弱毒疫苗，大小雞均可用，不但平安，而且免疫期長(zhǎng)。2．雞痘疫苗目前預(yù)防雞痘的疫苗有兩類：一類是由鴿痘病毒制成的，另一類是由雞痘弱毒病毒制成的。鴿痘弱毒苗適用于各種年齡的雞，對(duì)一日齡雛雞也沒有不良反響，但免疫力差些，一般免疫期為3～4個(gè)月。雞痘弱毒苗適用于20日齡的雞，用于雛雞接種可能會(huì)引起嚴(yán)重的反響，個(gè)別甚至?xí)劳?，免疫期五個(gè)月左右。上述兩種疫苗在接種后均應(yīng)出現(xiàn)局部反響，如局部紅腫增厚、毛囊腫脹或局部皮膚出現(xiàn)豆大的小皰等，如果接種部位不見反響，應(yīng)重新接種一次。3．馬立克氏病疫苗目前世界上已有三類疫苗：(1)強(qiáng)毒化疫苗；(2)自然弱毒疫苗；(3)火雞皰疹病毒FC126株疫苗，對(duì)1日齡雛雞作肌肉或皮下接種0.2毫升，只能防止腫瘤的發(fā)生，但不能防止馬立克氏病強(qiáng)毒的感染。因此，接種越晚，雛雞感染馬立克氏病毒的危險(xiǎn)性越大。近來已有由上述兩種以上毒株組成的多價(jià)疫苗，免疫效果更好。4．禽霍亂菌苗目前生產(chǎn)的禽霍亂菌苗有滅活菌苗和弱毒菌苗兩類，弱毒菌苗在國(guó)內(nèi)外育成的菌株有很多個(gè)。但弱毒苗的各個(gè)菌株，其免疫效果均不理想，一般免疫期僅三個(gè)月，有時(shí)會(huì)更短。不同菌株所引起的接種反響不同，但有時(shí)同一菌株甚至是同一批菌苗，在不同情況下反響也不相同。國(guó)內(nèi)現(xiàn)已研制出油佐劑滅活菌苗，平安，免疫期較長(zhǎng)。禽霍亂弱毒菌苗和滅活苗還有許多缺乏之處。國(guó)內(nèi)外都開始了亞單位疫苗的研制工作，并得了初步效果。5．傳染性支氣管炎疫苗目前使用最廣的弱毒株是H52和H120，兩者均為馬薩諸型。此外，還有別的血清型，如康涅狄格，也有滅活苗。H120毒力比擬溫和，適用于幼齡雛雞。H52毒力稍強(qiáng)，一般用于1月齡以上的雞或加強(qiáng)免疫。弱毒苗免疫有效期不長(zhǎng)，每隔2～3個(gè)月重復(fù)接種一次，可獲得堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)力，如果接種某一血清型的疫苗后仍不能防止疾病的發(fā)生，應(yīng)該選用別的血清型的疫苗或多價(jià)苗。6．傳染性法氏囊病疫苗目前有兩種疫苗：一種是滅活苗，須加佐劑，否那么無(wú)效。另一種是弱毒苗，不瘟和型和中等毒力型等，其應(yīng)用對(duì)象及劑量等有所不同。國(guó)內(nèi)已試制出PBC98弱毒疫苗，是一種溫和型弱毒苗。對(duì)1日齡雛雞進(jìn)行肌肉注射，28日齡時(shí)進(jìn)行飲水免疫，實(shí)踐證明平安有效。7．傳染性喉氣管炎疫苗目前有兩種疫苗：一種是弱毒疫苗，可用于滴眼，滴鼻或毛囊接種；另一種是強(qiáng)毒疫苗，只能用于擦肛或滴肛，如經(jīng)呼吸道接種那么會(huì)引起嚴(yán)重發(fā)病。8．鴨瘟疫苗現(xiàn)在普遍使用的是鴨胚培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)的弱毒疫苗。我國(guó)有好幾個(gè)單位培育的鴨瘟疫苗弱毒株，平安有效，一般無(wú)不良反響。9．減蛋綜合征疫苗目前使用的主要是用鴨胚生產(chǎn)的、加有油佐劑的滅活疫苗，效果良好。(三)疫苗的選擇和使用疫苗的種類很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，不可亂用，否那么不但不能起到預(yù)防疾病的作用，反而會(huì)影響動(dòng)物的健康，甚至?xí)驯緛頉]有的疾病帶入養(yǎng)殖場(chǎng)。因此，必須根據(jù)不同情況，慎重使用。一般來說，需要接種哪些種類的疫苗，主要取決于當(dāng)?shù)亓餍械幕蚩赡芰餍械募膊》N類，經(jīng)過調(diào)查和了解，當(dāng)?shù)赜性摲N疾病的流行或可能受到威脅時(shí)，才進(jìn)行該種疫苗的接種，尤其是該疫苗是毒力強(qiáng)的活毒苗或活菌苗，更不應(yīng)當(dāng)輕率地引入從沒有該病發(fā)生的地區(qū)進(jìn)行接種。對(duì)于已有該病流行或威脅的地區(qū)，選用什么類型的疫苗，主要是根據(jù)疾病流行的嚴(yán)重程度。一般流行較輕的，可選用比擬溫和的疫苗。例如新城疫可用Ⅱ系、Ⅲ系等緩發(fā)性疫苗。而疾病嚴(yán)重流行的地區(qū)，那么要選用效力較強(qiáng)的疫苗，如新城疫Ⅰ系等中發(fā)性疫苗?？傊?，要使疫苗接種后產(chǎn)生的抵抗力與疾病流行的情況相適應(yīng)，使動(dòng)物有足夠堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。有些疫苗往往有幾個(gè)品系，一般來說，初次接種應(yīng)該選擇毒力弱的品系，而重復(fù)接種(又稱強(qiáng)化接種)那么應(yīng)選用毒力較強(qiáng)的品系，例如新城疫疫苗。目前我國(guó)已有4個(gè)品系，作為初次接種，可選用Ⅱ系、Ⅲ系，而重復(fù)接種，可選用Ⅳ系或Ⅰ系苗。在選用疫苗時(shí)，還應(yīng)考慮該疫苗對(duì)動(dòng)物接種后是否會(huì)引起不良反響。例如禽霍亂弱毒菌苗如果用于產(chǎn)卵雞，會(huì)引起產(chǎn)卵量短期下降。如果有其它病并發(fā)，也會(huì)引起死亡。此外，新城疫疫苗、傳染性支氣管炎疫苗等接種，可能造成使本來不明顯的敗血霉形體病嚴(yán)重爆發(fā)，因此當(dāng)雞群中有敗血霉形體病潛伏存在的情況下，又要進(jìn)行上述疫苗接種時(shí)，應(yīng)該考慮提前一、二天給要免疫接種的雞連續(xù)服用藥物，以便減輕或防止疾病的爆發(fā)。在選擇疫苗時(shí)，必須注意疫苗的質(zhì)量，質(zhì)量的好壞直接影響免疫效果。疫苗的質(zhì)量除與制造廠生產(chǎn)過程有關(guān)外，與貯存、運(yùn)輸及使用過程是否妥當(dāng)也關(guān)系極大。以下是貯存、運(yùn)輸及使用過程中影響疫苗的質(zhì)量的一些因素：1．保存條件：不同類型的疫苗，要求的保存條件是不一樣的。必須按說明書規(guī)定的條件保存，才能保證疫苗質(zhì)量不會(huì)顯著下降，一般來說，滅活苗要保存于2～15℃的陰暗環(huán)境中，活菌苗應(yīng)保存于4～82．保存期：使用前檢查瓶簽上的截止有效期，離截止有效期越近，疫苗病毒(或細(xì)菌)死亡越多。因?yàn)榧词乖谧钸m宜的保存條件下，疫苗病毒(或細(xì)菌)也會(huì)緩慢死亡。3．運(yùn)輸過程：疫苗運(yùn)輸時(shí)，通常達(dá)不到低溫的要求，因此運(yùn)輸時(shí)間越長(zhǎng)，疫苗中的病毒(或細(xì)菌)死亡越多，如果中途轉(zhuǎn)運(yùn)屢次，影響就更大。4．疫苗的稀釋：各種疫苗所用的稀釋劑、稀釋倍數(shù)及稀釋方法，都有一定的規(guī)定，必須嚴(yán)格按使用說明書進(jìn)行。否那么，疫苗的滴度會(huì)下降，影響免疫效果。例如，用于飲水的疫苗稀釋劑，最好是用蒸餾水或去離子水，但不能用自來水，因?yàn)樽詠硭械南緞?huì)把疫苗毒殺死。又如用于氣霧的疫苗稀釋劑，應(yīng)該是用蒸餾水或去離子水，如果稀釋水中含有鹽，霧滴噴出后，由于水分蒸發(fā)，鹽類濃度提高，會(huì)引起疫苗病毒死亡。如果能在飲水或氣霧的稀釋劑中參加0.1%的脫脂奶粉，會(huì)有助于對(duì)疫苗病毒的保護(hù)。在稀釋疫苗時(shí)，應(yīng)使用注射器先吸入少量稀釋液注入疫苗瓶中，充分振搖溶解后，再參加其余的稀釋液，如果疫苗瓶太小，不能裝入全量的稀釋液，需要把疫苗吸出入在另一容器內(nèi)，再用稀釋液把原疫苗瓶沖洗幾次，使全部疫苗病毒(或細(xì)菌)都被沖洗下來。5．疫苗的使用：疫苗在臨用前由冰箱取出稀釋后應(yīng)盡快使用，活毒疫苗一般應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)用完。馬立克氏病疫苗應(yīng)在兩小時(shí)內(nèi)用完。當(dāng)天未用完的疫苗，應(yīng)廢棄，不要隔天再用。疫苗無(wú)論在稀釋前后都不應(yīng)受熱或曬太陽(yáng)，更不許接觸消毒藥，稀釋疫苗的一切用具，必須洗滌干凈，煮沸消毒。飲苗的容器也要洗干凈，無(wú)消毒藥殘留。(四)免疫接種的途徑和方法對(duì)家禽進(jìn)行免疫接種的常用方法有：滴眼、滴鼻、翼下刺種、羽毛囊涂擦、滴肛或擦肛、皮下或肌肉內(nèi)注射、飲水法及氣霧法等。采用哪一種方法，應(yīng)根據(jù)具體情況決定，既要考慮工作方便及經(jīng)濟(jì)核算，更要考慮疫苗的特性及免疫效果。1．滴眼、滴鼻：這種方法適用于新城疫Ⅱ系、Ⅲ系及Ⅳ系疫苗，法氏囊弱毒疫苗，傳染性支氣管炎疫苗及傳染性喉氣管炎弱毒型疫苗等的接種，對(duì)幼雛應(yīng)用這種方法，可以防止疫苗病毒被母源抗體中和，并能誘導(dǎo)粘膜免疫，從而有比擬良好的免疫效果。滴眼、滴鼻法是逐只進(jìn)行接種，能保證每只禽都得到免疫，并且劑量一致，免疫效果確實(shí)。因此，一般認(rèn)為，滴眼、滴鼻法是疫苗接種的最正確方法，尤其是對(duì)新城疫接種更是如此。進(jìn)行滴眼、滴鼻法接種時(shí)，可把１０００羽份的疫苗稀釋于５０毫升的生理鹽水中，充分搖勻，然后于每只禽的眼結(jié)膜或鼻孔上滴一滴〔０.05毫升〕。也可把１０００只份的疫苗稀釋于１００毫升的生理鹽水中，然后于每只禽的眼結(jié)膜及鼻孔上各滴兩滴。２．翼下刺種：此法適用于雞痘疫苗、新城疫Ⅰ系疫苗等的接種。進(jìn)行接種時(shí)，將１０００羽份的疫苗稀釋于25毫升的生理鹽水中，充分搖勻，然后用接種針或蘸水筆尖蘸取疫苗，刺種于雞翅膀內(nèi)側(cè)無(wú)血管處，小雞刺種１針即可，較大的雞可刺種２針。３．羽毛囊涂擦：此法可用于雞痘疫苗的接種，但已少用。４．滴肛或擦肛：此法僅用于傳染性喉氣管炎的強(qiáng)毒型疫苗。方法是把1000只份的疫苗稀釋于30毫升的生理鹽水中，然后把雞的肛門向上，將肛門粘膜翻出，滴上疫苗1滴。５．皮下注射：現(xiàn)在廣泛使用的馬立克氏病疫苗是火雞皰疹病毒，宜用頸背皮下注射接種。通常是把100０只份的疫苗稀釋于木200毫升稀釋溶液中，然后每只雛注射０.2毫升。另外，各種油乳劑滅活疫苗也適用于皮下注射法。６．肌肉注射：此法是把疫苗直接注射于肌肉內(nèi)，禽霍亂弱毒菌苗或滅活菌苗以肌肉內(nèi)注射較好。此法作用迅速，劑量準(zhǔn)確，效果確實(shí)。新城疫Ⅰ系苗肌肉注射免疫效果比滴眼、滴鼻好，滅活苗必須用注射法，不能口服，也不能用于滴眼、滴鼻。肌肉內(nèi)注射，一般按疫苗使用說明書稀釋后，較小的禽只注射毫升，成禽那么每只注射１毫升。肌肉注射以胸部肌肉為好，應(yīng)斜向前入針，以防刺入肝臟、心臟或胸腔內(nèi)造成死亡，對(duì)較小禽只尤其要注意。７．飲水法：對(duì)于大群禽只〔例如一群超過10000只〕逐只進(jìn)行免疫接種費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能于短時(shí)間內(nèi)到達(dá)全群免疫。對(duì)于產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵盛期的雞群，為防止騷擾禽群，常采用群體免疫法。群體免疫法中最常用，最易做的，就是飲水法。目前采用飲水法較廣泛，效果又較好的疫苗有新城疫Ⅱ系及Ⅳ系苗、傳染性支氣管炎Ｈ52及Ｈ120疫苗．傳染性法氏囊病弱毒疫苗等。飲水法免疫雖然省時(shí)省力，但由于種種原因會(huì)造成每只禽飲水的疫苗量不一，免疫效果參差不齊。而且，很多研究者證實(shí)，飲水法引起的免疫反響最小，往往不能產(chǎn)生足夠的免疫力，不能抵抗較強(qiáng)毒力的毒株引起的疾病流行，尤其是對(duì)速發(fā)嗜內(nèi)臟型〔亞洲型〕的新城疫是如此。為使飲水法免疫到達(dá)一定效果，必須注意以下幾個(gè)問題：〔1〕用于飲水法的疫苗必須是高效價(jià)的，且疫苗劑量加大2～3倍?！玻病诚♂屢呙绲娘嬎仨毑缓腥魏问挂呙鐪缁畹奈镔|(zhì)，例如：氯、鋅、鐵等離子，必要時(shí)要用蒸餾水?！玻场筹嬎骶咭渥?，以保證所有禽只能在短時(shí)間內(nèi)飲到足夠的免疫量，飲水器具要干凈，飲水前必須徹底去除鐵銹、臟物等，以免降低疫苗效價(jià)?！玻础筹嬕呙缜巴Ｖ癸嬎病葱r(shí)〔視天氣及飼料等情況而定〕，以便使禽只能盡快而又一致地飲用疫苗。第二天再以同樣劑量和方法重復(fù)飲水免疫一次?！玻怠筹嬎凶詈媚軈⒓?.1%的脫脂奶粉?！玻丁诚♂屢呙绲挠盟恳m當(dāng)。正常情況下，可參考下表稀釋：雞齡每５００只４天～２周１０公斤水２周～４周１４公斤水４周～８周２０公斤水８周以上４０公斤水〔７〕飲水法免疫接種間隔時(shí)間不要太長(zhǎng)，一般２～３個(gè)月進(jìn)行一次。８．氣霧法：此法是用壓縮空氣通過氣霧發(fā)生器，使稀釋疫苗形成直徑１～１０微米的霧化粒子，均勻地浮游于空氣之中，隨呼吸而進(jìn)入禽體內(nèi)，以到達(dá)免疫。氣霧免疫不但省時(shí)省力，而且對(duì)某些呼吸道有親嗜性的疫苗效果最好，例如新城疫各系疫苗，傳染性支氣管炎弱毒疫苗等。但是氣霧法免疫對(duì)禽群的干擾大，尤其會(huì)加重?cái)⊙剐误w及大腸桿菌引起的氣囊炎。必要時(shí)可在氣霧免疫前后在飼料中參加抗菌藥物。氣霧免疫就應(yīng)注意的問題是：〔1〕疫苗必須是高效價(jià)的，而且通常應(yīng)使用加倍的劑量。(2)稀釋疫苗應(yīng)該用去離子水或蒸餾水，最好參加0.1%的脫脂奶料或明膠。(3)霧粒大小要適中，一般以噴出的霧粒中直徑在1～10微米占70%以上為最好，霧粒過大，停留于空氣中的時(shí)間短，也易被粘膜阻止，不能吸入呼吸道；霧粒過小，那么吸入后易被呼氣時(shí)又排出。(4)氣霧免疫房舍應(yīng)密閉，減少空氣流動(dòng)，并應(yīng)無(wú)直射陽(yáng)光，保證舍內(nèi)有適宜的溫度與濕度。夜間氣霧免疫最好，此時(shí)雞群密集而安靜，噴霧20分鐘后翻開門窗即可。(五)緊急接種當(dāng)一個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)已經(jīng)發(fā)生疫病，威脅到禽舍或禽場(chǎng)時(shí)，為了迅速控制和撲來疫病的流行，一個(gè)重要的措施就是疫區(qū)及受威脅的禽群進(jìn)行緊急接種。緊急接種可以用免疫血清或疫苗。實(shí)踐證明，在疫區(qū)內(nèi)使用疫苗進(jìn)行緊急接種，不但可以防止疫病向周圍地區(qū)蔓延，而且對(duì)某些疫病，如新城疫及鴨瘟，還可以減少已發(fā)病禽群的死亡損失。這主要是利用疫苗產(chǎn)生免疫力快的特點(diǎn)，使未受感染的家禽獲得抵抗力，但是對(duì)正處在潛伏期或尚未明顯發(fā)病的家禽，有可能促使發(fā)病和死亡，經(jīng)過段時(shí)間后，發(fā)病及死亡數(shù)就會(huì)迅速下降，使疫病得到控制。緊急接種應(yīng)該包括養(yǎng)禽場(chǎng)內(nèi)所有禽只，以使禽群一致地獲得免疫力，而不留下易感禽。這樣強(qiáng)毒病原體就不會(huì)一代一代傳下去。例如發(fā)生新城疫時(shí)，對(duì)2個(gè)月齡以上的雞可用Ⅰ系苗，幼齡雞可用Ⅱ系進(jìn)行緊急接種。為了保證接種效果，疫苗劑量可加倍，但必須注意不是所有疫苗均可用于緊急接種，只有被證明緊急接種確實(shí)有效的疫苗(新城疫Ⅰ系、Ⅱ系、鴨溫弱毒疫苗)才能使用。另外，一般先接種健康的或無(wú)明顯病癥者，然后再接種可疑感染者或發(fā)病者，以防人為地將病原體由病禽傳給健康禽只，擴(kuò)大疫情。(六)免疫接種的一般考前須知1．接種前應(yīng)對(duì)禽群進(jìn)行詳細(xì)了解和檢查，注意營(yíng)養(yǎng)狀況和有無(wú)疫病。一般雞群健康，可保證接種平安，相反，可能出現(xiàn)明顯的接種反響，甚至發(fā)病，產(chǎn)生免疫力差。因此免疫接種應(yīng)于禽群健康狀況良好時(shí)進(jìn)行為宜。2．接種前應(yīng)考慮雛禽母源抗體水平，決定首次免疫接種時(shí)間。雛雞的母源抗體，一方面可以抵抗病原的傳染，另一方面又能阻礙疫苗接種后的免疫反響。一般來說傳染性支氣管炎的母源抗體可維持2周左右，新城疫的母源抗體3周后完全消失，但傳染性法氏囊病的母源抗體可持續(xù)4～5周齡。雛雞的母源抗體受母禽抗體的影響。由于母禽免疫接種時(shí)間的不同，或者孵化的種蛋來源不同，因此后代雛雞的母源抗體水平就會(huì)有較大的差異。所以就很難規(guī)定一個(gè)統(tǒng)一免疫程序而適用于各養(yǎng)禽場(chǎng)。如新城疫，根據(jù)母源抗體的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于母源抗體水平低而個(gè)體差異又較小的雛雞，首次接種應(yīng)在早齡進(jìn)行；相反，母源抗體水平高的雛雞，應(yīng)推遲疫苗接種時(shí)間。對(duì)于母源抗體水平參差不齊，差異很大，而該地區(qū)又存在有新城疫威脅時(shí)，應(yīng)早用苗，以提高母源抗體水平低的雛雞的免疫力，然后再接種一次，使本來母源抗體水平較高的雛雞，也能對(duì)疫苗接種有良好的反響，重復(fù)接種可根據(jù)監(jiān)測(cè)血凝抑制抗體的情況，如果多數(shù)雞只血凝抑制抗體下降到1:16以下時(shí)，就應(yīng)進(jìn)行強(qiáng)化免疫。3．接種弱毒活菌苗前后各5天，禽群應(yīng)停止使用對(duì)疫苗菌株敏感的藥物，以免影響免疫效果。此外，抗病毒性疾病的疫苗的常參加某些抗菌藥物，如青霉素、鏈霉素等。如果與弱毒活菌苗混合使用，那么會(huì)降低疫苗的活菌數(shù)，從而也會(huì)影響免疫效果。4．一個(gè)養(yǎng)禽場(chǎng)往往都不只進(jìn)行一各種疫苗的接種。因此必須考慮到各種疫苗的互相配合，以減少相互之間的干擾作用，保證免疫的效果。例如一日齡雛雞同時(shí)進(jìn)行馬立克氏病疫苗和新城疫疫苗接種時(shí)，新城疫疫苗的免疫效果受到抑制，新城疫疫苗與傳染性支氣管炎疫苗同時(shí)接種時(shí)，一般無(wú)不良影響，但如果分別接種，那么認(rèn)為支氣管炎疫苗接種14天內(nèi)不應(yīng)接種新城疫疫苗，否那么新城疫疫苗的免疫效果顯著下降。為了保證免疫效果，對(duì)當(dāng)?shù)亓餍凶顕?yán)重的傳染病，最好能單獨(dú)進(jìn)行接種，以便產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。從免疫學(xué)的角度考慮，任何疫苗都以單使用時(shí)效果最好，并已被實(shí)踐證明。5．使用各種疫苗，一定要按說明書的要求做，才能確保免疫效果。要做好免疫接種的詳細(xì)記錄。記錄內(nèi)容至少應(yīng)包括：接種日期、禽群的品種、日齡、數(shù)量、使用疫苗的名稱、廠名、批號(hào)、生產(chǎn)日期及有效期、稀釋劑及稀釋倍數(shù)、疫苗接種方法、操作人員等。6．免疫接種后，要注意觀察禽群接種疫苗后正常的異常的反響，如有不良反響或發(fā)病等情況，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧?，并向有關(guān)部門報(bào)告。疫苗接種經(jīng)過一定時(shí)間(10～20天)后，應(yīng)檢查免疫效果。尤其是改用新的免疫程序及疫苗種類時(shí)更應(yīng)檢查。(七)免疫接種失敗的原因分析禽群經(jīng)免疫接種后，抵擋不住特定疫病的流行(例如：接種雞新城疫疫苗后仍發(fā)生雞新城疫)，或者效力檢查不合格(例如雞新城疫疫苗接種后，血凝抑抗體滴度不能到達(dá)應(yīng)有的水平或抽檢攻毒保護(hù)率低于標(biāo)準(zhǔn)要求)。均認(rèn)為免疫接種失敗。分析免疫接種失敗原因，必須從客觀實(shí)際出發(fā)，周密地考慮各方面的因素，切忌主觀武斷。事實(shí)上，每次免疫接種失敗，都有其特殊的原因，但為了便于分析，開闊思路，把一些可能的原因歸納如下，以供參考。1．雛禽在免疫接種時(shí)，存在有母源抗體。2．疫苗選擇不當(dāng)，在疫病嚴(yán)重流行的地區(qū)，僅選用平安性好，但免疫效果較低的疫苗品系，例如，在有速發(fā)嗜內(nèi)臟型新城疫流行的地區(qū)選用Ⅲ系苗。3．免疫接種途徑錯(cuò)誤，例如，1周齡內(nèi)的雛雞，采用飲水法接種新城疫疫苗；強(qiáng)化免疫時(shí)，把新城疫Ⅰ系疫苗用于點(diǎn)眼、滴鼻。把滅活苗用于飲水等。4．疫苗質(zhì)量差。5．疫苗運(yùn)輸、保管不當(dāng)，造成疫苗失效或減效。6．使用超過有效期的疫苗。7．免疫接種工作不認(rèn)真，例如采用飲水法免疫時(shí)飲水器缺乏，進(jìn)行疫苗稀釋時(shí)計(jì)算錯(cuò)誤或稀釋不均勻，沒有把應(yīng)該接種的禽只全部接種等。8．雞群中有免疫抑制性疾病存在，如法氏囊病、馬立克氏病等。9．不同種類疫苗之間的干擾作用。10．服用抗菌藥物或免疫抑制性藥物。11．接種時(shí)禽群內(nèi)已潛伏有強(qiáng)毒病原微生物，或由接種人員及接種工具帶入強(qiáng)毒病原微生物。三、剖檢技術(shù)及病變檢查要點(diǎn)病理剖檢和病變檢查是診斷傳染病的重要方法之一。它既可驗(yàn)證臨床診斷結(jié)果的正確與否，又可為實(shí)驗(yàn)室診斷方法和內(nèi)容的選擇提供進(jìn)一步的參考依據(jù)。對(duì)家禽的根本剖技術(shù)可參考下述方法：1．將病、死禽只羽毛、皮膚用水浸濕，以減少空氣染污。用力壓迫，使髖關(guān)節(jié)斷襲，兩腿叉開。2．在靠近胸骨柄處剪開腹肌，沿兩側(cè)脅骨緣向前剪開胸肌，用力將胸骨向上折斷、掀起，充分暴露胸腔和腹腔。3．先檢查胸腔臟器，如心、肺、氣囊等；再檢查腹腔臟器，如肝、脾、腎、法氏囊、卵巢、睪丸、氣囊、輸卵管、輸尿管及胃、腸漿膜，觀察有無(wú)變性、壞死、腫瘤等明顯異常變化。需要做細(xì)菌或病毒別離培養(yǎng)時(shí)，那么應(yīng)按照無(wú)菌手續(xù)采取所需病料。最后剖開口腔、氣管、食道、胃及腸管檢查有無(wú)典型病理變化。四、細(xì)菌別離、培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌別離培養(yǎng)不僅是確診傳染病的重要和可靠手段，而且也是進(jìn)上步研究病原特性，如耐藥性、致病性和生化特性等必不可少的步驟。病原細(xì)菌別離培養(yǎng)的一般方法如下：1．采取接種材料：別離細(xì)菌一般多采取心血、淋巴結(jié)、肝臟或脾臟，雛雞白痢可取膽汁或未吸收完的卵黃。所選病料應(yīng)在病雞自然殘廢后立即采取，并嚴(yán)格按照無(wú)菌要求操作。病料取好后應(yīng)盡快接種到培養(yǎng)基上，不應(yīng)久放，以免被雜菌污染或病料中細(xì)菌死亡而得出錯(cuò)誤培養(yǎng)結(jié)果。2．制備培養(yǎng)基：一般大多數(shù)細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板或肉湯中均能良好生長(zhǎng)，因此最常用的培養(yǎng)基主要是普通瓊脂或肉湯。為了特殊目的，有時(shí)需用特殊培養(yǎng)基，例如禽霍亂巴氏桿菌，為檢查其熒光性菌落，要用血清瓊脂平板〔普通瓊脂中參加10%的雞或綿羊血清〕；為讓其生長(zhǎng)更旺盛并檢查有無(wú)溶血性，要用血液瓊脂平板〔普通瓊脂中參加10%的新鮮綿羊血〕。另外，對(duì)霉形體、孤菌、霉菌及傳染性鼻炎等病原體的別離培養(yǎng)，也需要較特殊的培養(yǎng)基。普通瓊脂的制備方法：取牛肉湯100毫升，加蛋白胨1克，氯化鈉，瓊脂粉2克，加熱使其充分溶化，用NaHO溶液調(diào)PH7.8，15磅高壓滅菌30分鐘，冷至45℃左右時(shí)傾注于干烤消毒過的平皿中，每個(gè)平皿約20毫升，冷卻凝固后用消毒紙包好放4℃假設(shè)上述培養(yǎng)基中不加瓊脂粉便叫普通肉湯。將普通肉湯裝入10毫升的試管中，每管2～3毫升，高壓滅菌30分鐘后放4℃3．細(xì)菌的接種：將選好的病料放于滅菌容器內(nèi)，在無(wú)菌室或無(wú)菌罩或酒精燈下，以燒熱的鐵片或剪刀在病料外表燒烙消毒，然后在燒烙處剪一小口，用接種棒插入小口，勾取少量組織接入肉湯內(nèi)，或在普通瓊脂平板上劃線接種，然后將接種過的肉湯或平皿放入37℃所有過程都應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。五、病原菌藥敏試驗(yàn)抗菌藥物〔中草藥、抗菌素、磺胺類等〕是獸醫(yī)臨床常用的藥物，但是各種病原體對(duì)抗菌藥物的敏感性各不相同，同時(shí)，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，以及廣譜抗菌素的不斷增加，它們雖然對(duì)病原體有一定的作用，但在使用不當(dāng)時(shí)常導(dǎo)致抗藥性的形成，甚至干擾機(jī)體內(nèi)的正常微生物群的作用，反而對(duì)機(jī)體帶來不良影響。因此，測(cè)定病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，正確使用抗菌藥物，對(duì)于臨床治療工作具有重要的意義，藥敏試驗(yàn)有以下幾種方法。〔一〕紙片法紙片法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用也最普遍?？咕丶埰闹苽?．將質(zhì)量較好的濾紙用打孔機(jī)打成直徑6毫米的圓片，每100片放入一小瓶中，160℃干熱滅菌1～2小時(shí)，或用高壓滅菌〔15磅30分鐘〕后在602．抗菌藥物的濃度〔用蒸餾水或生理鹽水稀釋〕青霉素200單位/毫升其他抗菌素1000微克/毫升磺胺類藥物10毫克/毫升中草藥制劑1克/毫升3．用無(wú)菌操作法將欲測(cè)的抗菌藥物溶液1毫升，參加100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡1～2小時(shí)，如立即試驗(yàn)可不烘干，假設(shè)保存?zhèn)溆每捎孟路ê娓伞部菰锏目咕丶埰杀４媪鶄€(gè)月〕?！?〕培養(yǎng)皿烘干法：將浸有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37℃〔2〕真空抽干法：將放有抗菌藥物紙片的試管，放在枯燥器內(nèi)，用真空抽氣機(jī)抽干，一般需要18～24小時(shí)。4．將制好的各種藥物紙片裝入無(wú)菌小瓶中，置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，并用?biāo)準(zhǔn)敏感菌株作敏感性試驗(yàn)，記錄抑制圈的直徑，假設(shè)抑菌圈比原來的縮小，那么說明該抗菌藥物已失效，不能再用。培養(yǎng)基：一般細(xì)菌如腸道桿菌及葡萄球菌等可用普通瓊脂平板；鏈球菌、巴氏桿菌或肺炎球菌等可用血液瓊脂平板；測(cè)定對(duì)磺胺類藥物的敏感試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)使用無(wú)蛋白胨瓊脂平板。菌液：為培養(yǎng)10～13小時(shí)的幼齡菌液〔抑菌圈的大小受菌液濃度的影響較大，因而菌液培養(yǎng)的時(shí)間一般不宜超過17小時(shí)〕。試驗(yàn)方法：用白金耳取培養(yǎng)10～18小時(shí)的幼齡菌，均勻涂抹于瓊脂平板上，待枯燥后，用鑷子夾取各種抗菌素紙片，平均分布于瓊脂外表〔每個(gè)平板放置4～5片〕，在37℃結(jié)果測(cè)定：根據(jù)抗菌紙片周圍無(wú)菌區(qū)〔抑菌區(qū)〕的大小，測(cè)定其抗藥程度。因此，必須測(cè)量抑菌圈的直徑〔包括紙片〕，按其大小，報(bào)告該菌株對(duì)某種藥物敏感與否。1．青霉素抑菌圈的標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑敏感性＜10毫米10～20毫米＞20毫米抗藥中度敏感極度敏感2．其他抗菌素及磺胺類藥物的敏感標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑敏感性＜10毫米11～15毫米＞15毫米抗藥中度敏感極度敏感3．中藥抑菌素的標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑敏感性＜15毫米15毫米15～20毫米抗藥中度敏感極度敏感〔二〕快速敏感試驗(yàn)――葡萄糖指示法許多細(xì)菌能分解葡萄糖而產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基PH值發(fā)生改變，假設(shè)在培養(yǎng)基中參加抗菌藥物，接種的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感時(shí)，培養(yǎng)基中的葡萄糖就不被細(xì)菌分解利用，不會(huì)形成酸性物質(zhì)，PH值不發(fā)生變化，因而指示劑也不變色，相反，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物不敏感時(shí)，抗菌藥物抑制不了該菌的生長(zhǎng)繁殖，因而分解葡萄糖并產(chǎn)酸，使參加其中的溴甲酚紫由紫變黃，以此來測(cè)定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。具體操作方法如下：1．抗菌素紙片及菌液的準(zhǔn)備，同紙片法。2．配制指示培養(yǎng)基：取普通瓊脂15毫升，參加1%葡萄糖及0.6%溴甲酚紫指示劑0.7毫升。3．滅菌后，待培養(yǎng)基涼至50℃4．待凝固后，用鑷子將抗菌素紙片分別貼于外表，于37℃5．結(jié)果判定：紙片周圍有細(xì)菌生長(zhǎng)者呈現(xiàn)黃色，不生長(zhǎng)時(shí)仍為紫色，并側(cè)量抑菌圈的直徑，判定其敏感方法，方法同紙片法?！踩吃嚬芊ㄔ嚬芊ㄊ菍⑺幬镒鞅侗认♂?，觀察不同含量對(duì)細(xì)菌的抑制能力，以判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度，常用于測(cè)定抗菌素及中草藥對(duì)細(xì)菌的抑制能力。試驗(yàn)方法：取無(wú)菌試管10支，排列于試管架上，于第一管中參加肉湯1.9毫升，其余9管各參加1毫升，吸取配制好的抗菌素原液、磺胺類原液或中藥原液0.1毫升，參加第一管中，充分混合后吸出1毫升吸入第二管中，混合后，再?gòu)牡诙芤?毫升到第三管，依此移到第九管中，吸出1毫升棄去。第十管不加藥液作對(duì)照。然后向各管中參加幼齡菌液稀釋液0.05毫升〔培養(yǎng)17小時(shí)的菌液作1:1000稀釋，培養(yǎng)6小時(shí)作1:10稀釋〕，于37℃結(jié)果測(cè)定：培養(yǎng)18小時(shí)后，凡無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋管中即為該菌對(duì)藥物的敏感度。假設(shè)由于參加藥物〔如中藥〕而使培養(yǎng)基變?yōu)榛鞚幔塾^不易判斷時(shí)，可進(jìn)行接種或涂片染色鏡檢判定結(jié)果。藥物名稱敏感〔微克/毫克〕中度敏感〔微克/毫克〕抗藥〔微克/毫克〕磺胺類藥＜5050～1000＞1000鏈霉素＜55～20＞20青霉素＞2多粘菌素、慶大霉素＜11～10＞10金霉素、土霉素、四環(huán)素、紅霉素新霉素、氯霉素合霉素＜22～6＞6影響抗菌藥物敏感試驗(yàn)的因素1．器材：抗菌藥物敏感性試驗(yàn)是利用微生物學(xué)方法進(jìn)行的，其用量極微，實(shí)驗(yàn)儀器的規(guī)格和精確度會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此必須嚴(yán)格要求。試管、吸管、培養(yǎng)皿和其它器皿，尤其是定量用的吸管，均須選用中性，硬質(zhì)一級(jí)品，并且必須經(jīng)過徹底滅菌。2．培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基成分不但影響敏感菌株的生長(zhǎng)繁殖，并可影響到抑菌圈的直徑。不同批號(hào)的蛋白胨，所含的氨基氮的總量不同，因而抑菌圈大小有一定差異。氯化鈉、瓊脂中的鈣、鎂離子影響鏈霉素、新霉素的擴(kuò)散，尤其是氯化鈉對(duì)鏈霉素影響大，含量越高，抑菌圈越小，甚至不出現(xiàn)反響，但氯化鈉對(duì)多粘菌素反而有助于擴(kuò)散。瓊脂含量和平板厚度也影響抑菌圈的大小，含量大，影響抗菌素的擴(kuò)散，一般以1.3～1.6%的濃度較適宜，瓊脂層過厚抑菌圈也較小，以2～4厘米為最適宜?；前奉愃幱铆傊桨宸ㄔ囼?yàn)時(shí)，不能含蛋白胨，因胨會(huì)使磺胺失去作用。血清成分的吸附或結(jié)合作用，會(huì)使金霉素、中藥提取物抗菌作用減弱。表4抗菌素的溶解度、穩(wěn)定性及保存有效期抗菌素溶解度及穩(wěn)定性保存期青霉素：4℃2～3周，-鏈霉素易溶于水，水溶液中較穩(wěn)定4℃鹽酸四環(huán)素4℃鹽酸金霉素4℃氯化四環(huán)素和氧化四環(huán)素溶于水，酸性溶液較穩(wěn)定4℃新霉素易溶于水4℃紫霉素硫酸鹽易溶于水，溶解度500毫克/毫升4℃卡那霉素硫酸鹽溶于水，250毫克/毫升，PH2～9范圍穩(wěn)定4℃多粘菌素PH3～5的溶液中最穩(wěn)定4℃桿菌肽易溶于甲醇、乙醇，也能溶于水，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定4℃氯霉素微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮及醋酸中4～20℃紅霉素易溶于有機(jī)溶媒中，水中溶解度僅為2毫克/毫升，PH7最穩(wěn)定4℃黃霉素易溶于N/10氫氧化鈉溶液，乙醇、乙醚，溶解度1%，耐熱，蛋白胨、血清成分可阻止其抑菌作用3．敏感菌株：菌種的敏感度差異較大，如金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素最敏感。四聯(lián)球菌對(duì)四環(huán)素族最敏感。大腸桿菌對(duì)鏈霉素、多粘菌素敏感。因此，接種量要適宜，接種量多，即使最敏感的菌株也不能抑制其發(fā)育，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4．標(biāo)準(zhǔn)液和被檢液：要用同一方法和在同一條件下配制，防止因操作方法不一致而造成誤差。5．培養(yǎng)時(shí)間：細(xì)菌在發(fā)育過程中，對(duì)數(shù)期繁殖最快，以后處于穩(wěn)定和衰落期，必須掌握這一規(guī)律和特性，以便到達(dá)預(yù)期試驗(yàn)?zāi)康?。時(shí)間過短那么細(xì)菌不繁殖，過長(zhǎng)那么敏感性降低，抑菌圈不清楚。一般以37℃6．PH值：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響，新霉素、鏈霉素在堿性環(huán)境中活性最大，而在酸性時(shí)抑菌圈縮小。四環(huán)素族以酸性為佳。青霉素、氯霉素以中性為宜。六、病毒別離培養(yǎng)技術(shù)病毒別離培養(yǎng)是確診病毒性傳染病的最可靠方法之一，其別離培養(yǎng)技術(shù)包括雞胚接種、動(dòng)物接種和細(xì)胞接種別離培養(yǎng)。其中最簡(jiǎn)便、適用因而也最常用的是用雞胚別離培養(yǎng)病毒。1．接種材料的制備別離、培養(yǎng)病毒用的材料除了應(yīng)新鮮、無(wú)菌外，還要做一些特殊處理。首先應(yīng)將所選取的病料在無(wú)菌容器中剪碎、研磨，并根據(jù)所培養(yǎng)病毒特性用肉湯、生物鹽水或特定稀釋液將病料作1:5～10稀釋。然后按稀釋后的病料懸液量計(jì)算并參加雙抗〔青、鏈霉素〕，使兩者最終濃度達(dá)每毫升1000單位或微克，并在4℃2．病料接種假設(shè)用雞胚別離、培養(yǎng)病毒，那么多項(xiàng)選擇9～12日齡之間的發(fā)育雞胚。許多病毒、特別是大多數(shù)禽病毒都能在雞胚或鴨胚中生長(zhǎng)繁殖。接種時(shí)應(yīng)先在照蛋器下檢查雞胚是否健康、活潑，并劃出氣室和接種部位。然后嚴(yán)格消毒接種部位和氣室，用打孔器打孔后，每胚接種處理好的病料0.1～0.2毫升。接種后要用石蠟將孔口封死，放37℃假設(shè)用動(dòng)物別離、培養(yǎng)病毒，那么最好選用本種動(dòng)物或自然易感動(dòng)物。除此之外，常用于別離病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠等。兔子的接種常采用肌肉注射、耳靜脈注射，劑量一般是1毫升。小白鼠、大白鼠、豚鼠常采用腹腔注射，劑量一般為0.2～0.5毫升。接種動(dòng)物所用病料的處理與雞胚接種法相同。動(dòng)物接種后要單獨(dú)飼養(yǎng)，不斷觀察，按照規(guī)定時(shí)間收獲病毒并進(jìn)行鑒定。根據(jù)病毒種類的不同，雞胚接種后病毒可在不同部位生長(zhǎng)、繁殖，例如新城疫病毒在尿囊液和羊水中、喉氣管炎病毒和痘病毒在絨毛膜上含量最高。其它試驗(yàn)動(dòng)物接種后亦是如此，即不同種類的病毒存在于不同的部位，如豬瘟病毒接種家兔后主要存在于血液、脾臟和淋巴結(jié)，而狂犬病毒主要存在于接種動(dòng)物的腦和神經(jīng)組織中。因此收獲病毒時(shí)應(yīng)根據(jù)其生長(zhǎng)、存在部位來選取不同的組織器官。除了雞胚和動(dòng)物外，細(xì)胞體外培養(yǎng)也是別離病毒的常用方法，但由于所需物品，試劑和條件要求較嚴(yán)格，有些病初次別離不易在人工培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，而且技術(shù)難度較大，因此在一般基層單位難以開展推廣應(yīng)用，故不作介紹。七、雞胚接種技術(shù)雞胚接種技術(shù)用途廣泛，除了可以別離培養(yǎng)病毒、枝原體及衣原體等病原以確診傳染病外，還可用于病毒的鑒定，效價(jià)測(cè)定，致病力測(cè)定及制造疫苗、抗原等。因此掌握雞胚接種技術(shù)對(duì)進(jìn)行傳染病的研究和防制工作非常有用。下面介紹雞胚接種的根本技術(shù)。1．選胚根據(jù)需要選用適宜日齡的雞胚，大多數(shù)病毒適于9～12日齡的雞胚。雞胚應(yīng)以白色蛋殼者為好，便于照蛋觀察。雞胚應(yīng)發(fā)育正常，健康活潑，不要過大、過小或畸形蛋孵化的胚。雞胚應(yīng)來自健康無(wú)病的雞群，而且不能含有可抑制所接種病毒的母源抗體，最好選用SPF雞胚或非免疫雞胚。2．照蛋定位接種前應(yīng)在照蛋器下檢查雞胚，挑出死胚和弱胚。對(duì)所有健康胚應(yīng)先用紅鉛筆畫出氣室位置，再于胚胎側(cè)畫出接種位點(diǎn)〔進(jìn)針點(diǎn)〕，接種點(diǎn)應(yīng)避開大血管，靠近氣室邊緣處，離胚頭約1cm左右。3．接種照蛋定位完畢后，即可開始接種。先用碘酊將接種位點(diǎn)和氣室消毒，再用70﹪酒精脫碘，然后根據(jù)需要用三棱針或20號(hào)針頭在蛋殼上打孔。根據(jù)部位，雞胚接種有以下幾種方法〔可參照?qǐng)D1〕〔1〕尿囊腔接種這是最常用的接種方法，雞新城疫、減蛋綜合癥病毒、傳染性支氣管炎病毒、法氏囊病毒等均可采用這種方法。蛋殼消毒后，先在氣室上打一小孔，再于胚胎一側(cè)近氣室處所畫位點(diǎn)打一小孔，用帶5～7號(hào)針頭的注射器插入孔內(nèi)約，接種接種材料0.1～0.2毫升。進(jìn)針時(shí)針頭與蛋殼應(yīng)保持30℃角，不應(yīng)垂直進(jìn)針，注射完畢，立即用溶化的熱石蠟將注射口和氣室上小孔密封，然后放回37℃〔2〕絨毛尿囊膜接種該方法主要用于痘病毒、喉氣管炎病毒和馬立克氏病毒等的別離培養(yǎng)。將卵殼消毒后，先在氣室上打一小孔，再于胚胎側(cè)靠近氣室處避開大血管用電烙鐵或鋼鋸條將蛋殼翻開一個(gè)4毫米見方的小口，用刀尖小心撬開蛋殼，不能損傷卵殼膜，形成卵窗。用針尖輕輕挑破卵窗中心的卵殼膜，但不能損傷卵殼膜下的絨毛尿囊膜。在針尖挑破處滴一滴滅菌生理鹽水或甘油，然后用吸頭在氣室小孔上吸氣，使胚內(nèi)造成負(fù)壓，這時(shí)卵窗處絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時(shí)可見生理鹽水或甘油迅速滲入。用注射器滴加2～3滴接種物于卵窗的絨毛尿囊膜上，以透明膠紙封住卵窗。氣室小孔用石臘密封，接種后的雞胚平放在孵化箱中，卵窗向上，不要轉(zhuǎn)運(yùn)?！?〕卵黃囊接種此法適用于馬立克氏病毒、披膜病毒、衣原體及立克次氏體的別離、培養(yǎng)。接種方法：氣室端蛋殼消毒后，在氣室中央打一小孔，用帶7號(hào)針頭的注射器垂直刺入約3厘米，注射接種物0.1～0.2毫升。石蠟封口，繼續(xù)在37℃4．接種后的孵化和觀察接種后繼續(xù)在37℃孵化，每天照蛋2次，死胚隨時(shí)取出。一般24小時(shí)內(nèi)死亡的胚多因創(chuàng)傷或細(xì)菌污染所致，故棄去不用。24小時(shí)以后死亡的胚，取出后放45．收毒接種雞胚孵化到規(guī)定時(shí)間后，應(yīng)從孵化器中取出放4℃環(huán)境冷凍36小時(shí)左右，或在-10〔1〕雞胚放于蛋盤或蛋架上，氣室向上，用碘酊、酒精消毒后，以無(wú)菌鑷子敲開氣室蛋殼或去掉人工卵窗的透明膠紙，暴露卵膜。注意不要讓卵殼碎屑掉入雞胚內(nèi)?！?〕根據(jù)接種部位，病毒種類或需要，收獲相應(yīng)的雞胚材料如尿囊液、羊水、絨毛尿囊膜、胎兒、卵黃囊等，有時(shí)需要收獲全胚〔除去卵黃和蛋白〕，如新城疫病毒、馬腦炎病毒等。尿囊液：氣室翻開后，用無(wú)菌眼科鑷子慢慢撕去卵殼膜，然后夾住絨毛尿囊膜輕輕提起，用巴氏吸管刺破絨毛尿膜直接吸取尿囊液。為防止羊膜堵住吸管口，可用鑷子輕輕壓下羊膜及胎魚和，然后再吸。每個(gè)雞胚一般可收8毫升左右尿囊液。羊水：吸完尿囊液后，可用鑷子夾住羊膜，將巴氏吸管直接插入羊膜腔吸取羊水，然后再用鑷子提起羊膜或壓住胎兒，直至羊水收獲干凈。相當(dāng)一局部病毒其羊水和尿囊液可以混合，如新城疫，支氣管炎、法氏囊病毒等。有些有能混合，那么應(yīng)將兩者單收、單放。絨毛尿囊膜：如要收獲整個(gè)尿囊膜，那么可在消毒、翻開蛋殼、撕去殼膜后，將整個(gè)卵內(nèi)容物倒出，這時(shí)絨毛尿囊膜貼在卵殼內(nèi)壁上，用鑷子夾住將其撕脫下來即可。胚胎：消毒、翻開氣室卵殼后，用鑷子撕破卵殼膜和絨毛尿囊膜，夾起胚胎，用剪刀剪斷卵黃帶，將胎兒放滅菌容器內(nèi)即可。6．雞胚接種考前須知〔1〕接種材料一般都應(yīng)按每毫升1000單位或微克參加青、鏈霉素?！?〕接種位點(diǎn)應(yīng)避開雞胚在血管和胚頭，以免針頭刺傷雞胚而造成接種后的損傷性死亡?！?〕接種點(diǎn)最好選在胚頭左側(cè)，因一般人均右手持注射器，注射時(shí)易往左側(cè)傾斜，這樣不易刺傷雞胚?！?〕接種后注射口和氣室孔均應(yīng)用石蠟切實(shí)密封，防止細(xì)菌污染造成死亡。死亡雞胚應(yīng)隨時(shí)取出，以免時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)菌繁殖并對(duì)周圍雞胚造成污染?！?〕雞胚取出冷凍時(shí)應(yīng)保持氣室向上，否那么收獲尿囊液時(shí)很困難。八、動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物試驗(yàn)常用于病原微生物的別離、鑒定、免疫原性測(cè)定、致病力測(cè)定，保護(hù)力測(cè)定、感染譜測(cè)定、病原的繼代保存或致弱、中和試驗(yàn)、半數(shù)感染量或致死量測(cè)定以及制造疫苗和免疫血清等。下面介紹幾種常用的動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)。1．常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：獸醫(yī)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有家兔、小白鼠、豚鼠、大白鼠、雞和鴿子等。必要時(shí)亦可使用本種動(dòng)物，如豬病用豬，羊病用牛。無(wú)論何種動(dòng)物均應(yīng)健康無(wú)病，不帶有任何病原微生物，如能使用SPF動(dòng)物那么更好。同時(shí)應(yīng)對(duì)所試驗(yàn)病原體敏感。2．動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?dòng)物試驗(yàn)的接種技術(shù)有皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔、口鼻、靜脈及顱內(nèi)等多種方法。動(dòng)物接種前必須保定、消毒、剪毛。針頭的大小根據(jù)動(dòng)物種類和接種部位而定。接種劑量小白鼠一般0.2毫升，大白鼠一般0.5毫升，家兔、雞一般1～2毫升，鴿子0.5毫升?！?〕動(dòng)物的保定家兔可用保定臺(tái)或保定筒進(jìn)行保定，也可徒手保定。徒手保定時(shí)讓其側(cè)臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，一手壓住臀部和后腿，另一手抓住肩部和前腿。大鼠和小鼠的保定是用左手拇指捏緊雙耳和頸部皮膚，手掌和其余手指握住背部。較小的豚鼠其保定方法同大鼠或小鼠：較大或懷孕的豚鼠，可用左手捏住頭頸部皮膚及背部，右手固定其臀部和后肢。保定雞或鴿子時(shí)讓其側(cè)臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，右手壓住翅根部和背部，左手握住兩后肢大腿部?！?〕動(dòng)物接種不同部位的接種方法如下：皮下接種：選皮下組織疏松，便于注射和易于吸收處。一般兔和豚鼠在腹部和大腿內(nèi)側(cè)，雞和鴿在胸部?jī)蓚?cè)，大鼠在背部或腹股溝部，羊和豬、犬在四肢內(nèi)側(cè)。注射時(shí)可于消毒后用鑷子將皮輕輕夾起，在鑷子下部進(jìn)針注射，注射后用酒精棉球壓住注射部位再將針頭撥出，以防注射物流出。肌肉接種：除禽類常用胸肌接種方法外，其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般均為臀部肌肉接種。接種時(shí)先消毒，然后將針頭垂直或稍傾斜刺入肌肉內(nèi)注射。腹腔接種：該方法常用于小鼠、豚鼠或家兔。小鼠在臍后部中線附近，消毒后將針頭以幾乎平行于腹中線的角度刺過皮膚和腹肌，注射時(shí)應(yīng)感覺不到有阻力，否那么可能在皮內(nèi)或皮下。家兔和豚鼠腹腔接種時(shí)，先從腹股溝處刺入皮下，再進(jìn)針約1厘米左右。進(jìn)入腹腔注射。檢驗(yàn)注射是否正確，除無(wú)阻力感外，還不應(yīng)看到或摸到注射部位有鼓泡，否那么可能在皮下或皮內(nèi)。靜脈注射：多用于家兔接種，可選擇耳外側(cè)背部邊緣靜脈，用酒精棉球涂擦或以手指用力彈打耳邊，可使耳靜脈充血，怒漲，利于進(jìn)針。消毒后左手拇指和食指緊捏靜脈基部，無(wú)名指和小指夾住耳尖部，以5號(hào)針頭對(duì)準(zhǔn)靜脈先垂直進(jìn)入皮膚和血管，然后將針頭置于與血管平行位置進(jìn)針1～2厘米。輕輕抽動(dòng)注射器，假設(shè)有血液進(jìn)入針管那么說明已進(jìn)入靜脈，此時(shí)松開靜脈基部，慢慢注入接種材料，感到毫無(wú)阻力。假設(shè)針頭不回血或注射時(shí)阻力較大，那么說明針頭未進(jìn)入血管，應(yīng)重新調(diào)整進(jìn)針位置。注射時(shí)針管內(nèi)千萬(wàn)不可進(jìn)入氣泡，否那么會(huì)使兔血管產(chǎn)生氣性拴塞而引起急性死亡。注射完畢用棉球壓迫針口片該，以免出血。小鼠多采用尾靜脈注射。腦內(nèi)接種：小白鼠、雛雞常為腦內(nèi)接種的動(dòng)物。以兩眼或兩耳連線中央偏左顱骨處將4～6號(hào)針刺入腦內(nèi)約1厘米深，注入接種材料0.05毫升即可。注意嚴(yán)格消毒。九、病原體的鑒定方法各種病原微生物通過別離培養(yǎng)后，最終都必須通過病原鑒定才能最后得出確診或結(jié)論。病原體的鑒定一般包括如下內(nèi)容：1．形態(tài)鑒定：病原細(xì)菌主要通過涂片，染色后用光學(xué)顯微鏡〔即普通顯微鏡〕的高倍鏡頭〔即油鏡頭〕觀察其形態(tài)大小、染色特性、有無(wú)莢膜、芽孢、鞭毛以及存在方式等，從而做出初步鑒定。病料中的病原體形態(tài)觀察，可用各種病料組織〔肝、脾、淋巴組織、血液、膽汁、氣管分泌物、胃腸內(nèi)容物等〕涂片、枯燥后，以瑞氏染色法、姬母薩染色法或美蘭染色法染色鏡檢。培養(yǎng)后病原細(xì)菌可用蒸餾水稀釋，涂片后，以革蘭氏染色法染色鏡檢。具體染色方法和各種病原細(xì)菌的形態(tài)特征可參考后面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。病毒的形態(tài)特征鑒定目前主要依靠電子顯微鏡觀察，一般基層單位難以做到。2．培養(yǎng)特性鑒定：對(duì)于細(xì)菌主要是檢查其人工培養(yǎng)所適宜的培養(yǎng)基種類〔普通培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基及特殊培養(yǎng)基等〕、培養(yǎng)條件〔溫度、氧氣及時(shí)間等〕、生長(zhǎng)特性〔菌落形態(tài)、大小、色澤、粘度、光滑度、是否溶血、菌液是否混濁或有沉淀等、有無(wú)毒素產(chǎn)生以及噬菌體類型等〕。對(duì)于病毒那么主要是檢查其生長(zhǎng)繁殖所適宜的易感動(dòng)物、細(xì)胞或禽胚、最正確生長(zhǎng)條件〔細(xì)胞的種類、各種營(yíng)養(yǎng)成份及特殊成份、禽胚的種類及日齡、溫度等〕和生長(zhǎng)特性〔細(xì)胞是否產(chǎn)生病變、復(fù)制周期長(zhǎng)短及病毒滴度出現(xiàn)峰值的時(shí)間、禽胚是否發(fā)生各種病變或死亡、干擾作用、血細(xì)胞吸附作用，病毒復(fù)制的部位及方式等〕。具體鑒定方法可參照后面各有關(guān)章節(jié)。3．生化鑒定：此項(xiàng)內(nèi)容主要是針對(duì)病原性細(xì)菌，包括各種糖類的發(fā)酵試驗(yàn)，某些特殊物質(zhì)的產(chǎn)生或利用試驗(yàn)等，具體方法可參考各章節(jié)有關(guān)內(nèi)容。4．理化特性鑒定：理化特性是病原微生物的根本特征，也是進(jìn)行病原分類和鑒定的主要依據(jù)之一。理化特性主要包括核酸類型及存在方式、G＋C含量、蛋白質(zhì)多肽的含量及類型、酶的種類及含量、脂質(zhì)含量、碳水化合物〔糖和多糖〕含量以及其他成分的含量等。除此之外，細(xì)菌還應(yīng)包括抗原分析〔外表抗原、鞭毛抗原、菌毛抗原、莢膜抗原、芽孢抗原、胞壁抗原及胞漿抗原等〕，病毒那么包括沉降系數(shù)、浮密度等。理化特性鑒定均需特殊條件。5．生物學(xué)特性鑒定：主要包括感染譜、致病力、毒力、免疫性、血凝性、生物型、抵抗力〔對(duì)外界環(huán)境因素、物理化學(xué)因素、消毒藥物及抗微生物藥物的敏感性〕等。6．血清學(xué)鑒定：主要根據(jù)免疫學(xué)原理，利用特異免疫抗體對(duì)病原微生物進(jìn)行鑒定。血清學(xué)鑒定方法包括凝集反響〔試管凝集和平板凝集〕沉淀反響〔試管沉淀和瓊脂擴(kuò)散沉淀反響〕、血凝抑制反響、中和反響、間接血凝、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)、酶標(biāo)抗體技術(shù)、放射免疫技術(shù)、補(bǔ)體結(jié)合反響、紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)，免疫粘附血凝試驗(yàn)，協(xié)同凝集試驗(yàn)及其他抗體標(biāo)記技術(shù)等。這些鑒定方法有的比擬簡(jiǎn)便，如凝集反響，沉淀反響，瓊擴(kuò)反響，血凝抑制反響等，在本教材各有關(guān)章節(jié)中均有介紹。其他一些方法均較復(fù)雜或需一定試驗(yàn)條件，可參考其他教材。7．其他鑒定方法：隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速開展，鑒定病原微生物的方法也不斷增加，而且更加特異和敏感，例如目前已進(jìn)入實(shí)用階段的核酸雜交〔核酸探針〕技術(shù)、體外核酸擴(kuò)增技術(shù)〔聚合酶鏈反響，PCR〕酶切圖譜、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析〔RFLP〕和核酸序列測(cè)定技術(shù)等。當(dāng)然，這些鑒定方法適合各種病原微生物，但一般只有在設(shè)備齊全的實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行。

第二局部傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)一、雞新城疫的診斷及免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)(一)雞新城疫(ND)主要侵害雞，其次是火雞、珠雞和野雞，鴨鵝等水禽均不易感。本病在流行上具有高度接觸傳染性，發(fā)病率和致死率很高。一年四季均可發(fā)病。但以春秋兩季發(fā)病較多，本病臨床病癥表現(xiàn)為體溫升高到木43～44℃，精神沉郁或閉眼嗜睡，病雞腹瀉呈黃白色或綠色，有時(shí)帶血，常搖頭、噯氣，發(fā)出“〔二〕病毒別離材料應(yīng)采自早期病例，慢性病例不適宜于別離禽病毒，病雞撲殺后應(yīng)用無(wú)菌手術(shù)采取脾、腎、肝、肺〔通常有較高的病毒滴度〕，腦〔病毒的存在時(shí)間較其它組織長(zhǎng)〕或骨髓〔最不易被細(xì)菌污染〕等組織。生前可用滅菌棉拭子獲取呼吸道或泄殖腔分泌物。將棉拭子浸出液或經(jīng)研磨的組織懸液制成1:5～10乳劑，每毫升加青、鏈霉素各1000～2000單位，以抑制可能污染的細(xì)菌，置冰箱中作用2～4小時(shí)，然后離心沉淀，取其上清液作為接種材料。雞胚接種常用9～10日齡的雞胚，每份病料至少注入5個(gè)雞胚，接種于絨毛尿囊膜或尿囊內(nèi)，操作方法如下。1．照蛋，劃出氣室位置，在雞胚胎面觀看胚胎活動(dòng)，選擇無(wú)大血管處標(biāo)一記號(hào)。2．在氣室頂部和標(biāo)記處用碘酊和酒精消毒，并各鉆一小孔。3．用較干的碘酊棉球涂布小孔。4．用1毫升注射器吸取上述處理過的材料，插入小孔內(nèi)約3mm5．用融化石臘封口，在蛋殼上標(biāo)明日期。6．置37℃7．將死胚收藏于4℃雞胚接種諸途徑8．收獲尿囊液時(shí)，以碘酊涂擦氣室和氣室附近的蛋殼，用滅菌攝子將氣室處蛋殼敲破，剝?nèi)サ皻?，用另一滅菌小鑷子剝?nèi)サ皻つ?，并撕破絨尿膜，暴露出清晰的尿囊液〔混濁者已污染，應(yīng)棄去不收〕，以鑷子將胚胎和胚膜壓向一邊，吸取尿囊液于滅菌瓶中，并加標(biāo)簽。用透明而無(wú)菌者作血凝反響，可在96孔微孔板上進(jìn)行，也可將尿囊液一滴與1～2%雞紅細(xì)胞懸液一滴在一塊白瓷板上相混和，如發(fā)生紅細(xì)胞凝集，即用抗雞新城疫血清作血球凝集抑制試驗(yàn)〔HI〕，出現(xiàn)抑制反響，便可得到確診。組織培養(yǎng)〔細(xì)胞培養(yǎng)〕雞新城疫病毒能在禽源原代細(xì)胞，一些哺乳動(dòng)物的原代細(xì)胞和細(xì)胞系中生長(zhǎng)繁殖，因此也可用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來別離病毒。最常用的是在玻璃和塑料容器內(nèi)長(zhǎng)成單層的雞胚成纖維細(xì)胞。操作時(shí)可將待檢液作一系列十倍比的稀釋〔如10-1到10-3〕，分別注入到雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)管中，24小時(shí)～48小時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變〔細(xì)胞圓縮顆?；L(zhǎng)呈蜘蛛網(wǎng)或干枝梅樣〕，取培養(yǎng)液作HA和HI試驗(yàn)，鑒定病毒。也可在細(xì)胞培養(yǎng)中用血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，作出鑒定結(jié)果，如將待檢材料注入雞胚成纖維細(xì)胞的平皿培養(yǎng)中〔空斑試驗(yàn)〕。新城疫強(qiáng)毒通常出現(xiàn)大而透明或大而紅色蝕斑〔2～4毫米〕。根據(jù)蝕斑形成單位可測(cè)定病毒濃度?！踩逞鍖W(xué)檢查由于循環(huán)抗體產(chǎn)生后，病毒可從寄主的組織中迅帶消失，所以慢性病例難于別離病毒，應(yīng)通過特異抗體的檢查來間接診斷此病。通常中和抗體較血凝抑制〔HI〕抗體維持時(shí)間要長(zhǎng)些，但中和試驗(yàn)較費(fèi)時(shí)花錢，而HI試驗(yàn)?zāi)茉诙虝r(shí)間內(nèi)作大量測(cè)定，檢出的抗體滴度一般相當(dāng)于中和滴度。因此常用HI試驗(yàn)來檢查抗體?？贵w滴度于感染后5～7天開始上升，15～20天可達(dá)頂峰且能維持較長(zhǎng)時(shí)間，受強(qiáng)毒感染而耐過的雞在體內(nèi)產(chǎn)生極高的抗體水平，滴度高達(dá)11〔Log2〕以上。在感染群內(nèi)出現(xiàn)高抗體的數(shù)量隨雞群原有的抗體水平而異，與雞的年齡也有關(guān)系，平均可達(dá)30%，在只有少數(shù)出現(xiàn)病癥，不斷發(fā)生死亡的雞群中，我們可對(duì)活雞進(jìn)行抗體檢測(cè)。如有較多高抗體雞的出現(xiàn)，說明雞群已受過新城疫野毒感染。免疫過較長(zhǎng)時(shí)間的雞群持續(xù)保持高水平的抗體，可能是隱性感染或慢性感染的結(jié)果?！菜摹畴u群血凝抑制抗體水平快速測(cè)定法近年來養(yǎng)雞業(yè)有較快開展。但由于免疫失時(shí)，免疫不當(dāng)和疫苗失效等多種原因致使雞新城疫仍有流行，一些免疫力低落的雞群，遇野外強(qiáng)毒侵襲時(shí)，有的引起急性爆發(fā)招致大批死亡，有的造成隱性感染而使野毒繼續(xù)潛留。這不僅給廣闊農(nóng)戶帶來?yè)p失也威脅著養(yǎng)雞業(yè)的進(jìn)一步開展。因此，在加強(qiáng)預(yù)防接種同時(shí)用一種快速、簡(jiǎn)單、可靠的監(jiān)測(cè)手段來了解雞群免疫狀態(tài)和有否野毒感染，以便掌握確切免疫時(shí)機(jī)，更有效地控制新城疫，是生產(chǎn)上急需解決的問題。由于血凝抑制〔HI〕試驗(yàn)比中和試驗(yàn)簡(jiǎn)單、方便。且HI抗體水平與攻毒保護(hù)有密切關(guān)系。故HI試驗(yàn)仍是目前國(guó)內(nèi)評(píng)價(jià)雞群免疫狀態(tài)最常用的血清學(xué)方法。但常規(guī)的試管全量法比擬麻煩，不適用于較多樣品的測(cè)定。本文介紹的三種簡(jiǎn)易、快速的測(cè)定方法供生產(chǎn)上實(shí)際應(yīng)用。β－微量法器材1．塑料微孔板：96孔V型凝集板，使用前后充分清洗，晾干。2．針管定量稀釋器：以四支全量0.25毫升的注射器并聯(lián)制成，可以定量，前端接塑料滴頭，每擠一下為0.05毫升。一次可同時(shí)稀釋四個(gè)樣品。然后更換干凈的滴頭再用?！惨妶D〕3．微型振蕩器：專用于微量凝集后的混合。也可用手振蕩混合。4．塑料采血管：內(nèi)徑2毫米的聚乙稀塑料管，剪成10～12厘米長(zhǎng)，備用。5．標(biāo)準(zhǔn)滴管：以靜脈注射管連接磨去尖端的18G號(hào)針頭，要求每滴0.025毫升。試劑1．磷酸緩沖鹽水〔PBS〕，用作稀釋液。PH7.0～7.2，配方如下：氯化鈉磷酸二氫鉀氫氧化鈉高壓蒸氣滅菌，4℃2．濃縮抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液經(jīng)福爾馬林滅滅，聚乙二醇濃縮制成，其血凝價(jià)為5000～16000，用聚乙烯塑料管小劑量分裝，置4℃冰箱保存?zhèn)溆??！部稍?此抗原具有效價(jià)高、洗脫慢、耐長(zhǎng)期保存和不散毒等優(yōu)點(diǎn)，每次作血凝抑制試驗(yàn)按固定比例稀釋配制4個(gè)血凝單位濃度的抗原，抗原稀釋倍數(shù)按下式計(jì)算：〔稀釋倍數(shù)=血凝效價(jià)/血凝單位數(shù)〕3．紅血球懸液，采成年雞血放入加有8％檸檬酸鈉抗凝劑的試管中或等量Alsever液中〔后者可在4℃下保存2周〕，用20倍量的PBS洗滌血球，重復(fù)3～4次。每次2000轉(zhuǎn)、別離心5分鐘，最后一次離心10分鐘，吸取壓積血球，用PBS配成0.5％懸液，或先配成10％濃懸液〔可在44．標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：采自高度免疫的公雞，經(jīng)效價(jià)測(cè)定后分裝小瓶，且在瓶簽上標(biāo)明HI價(jià)，0℃5．待檢血清：檢測(cè)雞群免疫水平時(shí)，每群隨機(jī)采血20～30份血樣，先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至6～8厘米長(zhǎng)度。在酒精燈上將管一端燒融封口，或用石蠟封口，用膠布標(biāo)明雞號(hào)或群號(hào)，置37℃溫箱中．2小時(shí)，待凝固拆出血清后以1000轉(zhuǎn)／別離心5分鐘，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料板小孔中，如需較長(zhǎng)時(shí)間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去。滴融化石臘封口，凍存于0試驗(yàn)操作1．微量血凝(HA)試驗(yàn)(1)用定量稀釋器于每孔中加PBS0.05毫升，共滴4排孔。(2)以稀釋器吸1:5稀釋抗原于第一列孔，擠壓4～6次混勻后吸至經(jīng)二列孔，依次倍比稀釋，最后一列不加抗原作為對(duì)照。(3)換去稀釋器前端塑料管頭，再吸0.5％紅血球懸液依次參加各孔，每孔0.05毫升。(4)置微型振蕩器上振蕩1分鐘，或以手平持血凝板繞圓圈混勻?！?5)置室溫下(18～20℃以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝滴度，如用2為底的對(duì)數(shù)表示，那么1代表第1個(gè)稀釋度(5×21)，2代表第2個(gè)稀度(5×22)，依次類推，其血凝滴度恰與板上出現(xiàn)完全凝集的最高孔數(shù)一致，(為精確比擬不同抗原的血凝滴度，可將最高凝集孔后一孔的不全凝集狀態(tài)：25％、50％、75％的凝集分別以對(duì)數(shù)0.25、0.5、0.75表示，作為前面整數(shù)的尾數(shù))。每次做四個(gè)重復(fù)以幾何均值表示結(jié)果。2．β—微量HI試驗(yàn)(1)在96孔V型微孔板上進(jìn)行，用針管定量稀釋器加樣和稀釋，一次可同時(shí)稀釋四個(gè)樣品。(2)先取PBS0.05毫升，放入第l孔和第12孔，再取濃度為4個(gè)血凝單位的抗原依次參加3～11孔，每孔0.05毫升，第2孔加濃度為8個(gè)血凝單位的抗原0.05毫升。(3)用稀釋器吸待檢血清0.05毫升于第l孔中(血清對(duì)照)擠壓混勻后吸0．05毫升于第2孔依次倍比稀釋至第11孔，最后棄去0.05毫升。(4)置室溫(18～20℃(5)用稀釋器滴加0.5％紅血球懸液于各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置30～40分鐘，判定結(jié)果。以完全抑制血球凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，如用以2為底的對(duì)數(shù)(Log2)表示，其HI滴度恰與板上出現(xiàn)完全抑制的最高孔數(shù)一致。(為精確比擬不同樣品的HI滴度，可將最高抑制孔后一孔的不全抑制狀態(tài)，25％、50％、75％的抑制分別以對(duì)數(shù)0.25、0.5、0.75表示，作為前面整數(shù)的尾數(shù))?？记绊氈?．本法具有簡(jiǎn)易、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，測(cè)得的HI值比標(biāo)準(zhǔn)全量法平均高0.65(Log2)。2．血凝和血凝抑制試驗(yàn)雖簡(jiǎn)便、快速，但影響因素甚多，有時(shí)測(cè)得的結(jié)果不一致。因此必須嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，如準(zhǔn)確配制紅血球懸液和4單位濃度的抗原，每次測(cè)定應(yīng)有嚴(yán)格的溫度范圍和作用時(shí)間等，鑒于影響因素廣泛，可變，每次測(cè)定應(yīng)設(shè)滴度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作對(duì)照。3．攻毒試驗(yàn)說明，HI滴度在4(Log2)的雞保護(hù)率為50％左右，在4(Log2)以上的保護(hù)率達(dá)90％～100％，在4(Log2)以下的非免疫雞保護(hù)率僅9％，免疫過的雞為43％，雞群的HI抗體水平以抽檢樣品的HI抗體幾何均值表示。如平均水平在4〔Log2〕以上，表示該雞群為免疫雞群。4．當(dāng)雞群受到野外強(qiáng)毒侵襲時(shí)，總有一些個(gè)體能耐過感盛而存活，同時(shí)產(chǎn)生極高的抗體水平，用微量法在雞群中檢測(cè)時(shí)，如有較多11〔Log2〕以上的高抗體雞出現(xiàn)，說明雞群已受新城疫強(qiáng)毒感染，在必要時(shí)，可利用檢出的高抗體雞的高免血清對(duì)那些剛發(fā)病或受到威脅的雞群進(jìn)行緊急被動(dòng)免疫，可以減少死亡，以利迅速控制流行。穴號(hào)表5微量血疑〔HA〕試驗(yàn)穴號(hào)滴度滴度材料1234567891011125×215×225×235×245×255×265×275×285×295×2105×211對(duì)照PBS〔滴〕〔約0.05ml〕111111111111抗原11111111111〔滴〕棄去一滴0.5％紅血球懸液〔滴〕111111111111全血平板法主要材料1．器材：白瓷板，標(biāo)準(zhǔn)滴管(以靜脈注射滴管連接磨去尖端的18號(hào)針頭，要求每滴0.025毫升)，三用血色素管、三棱針、酒精燈等。2．抗原：以含有Lasota系病毒的尿囊液經(jīng)福爾馬林滅活、聚乙二醇濃縮制成。使用時(shí)用PBS稀釋至含32～64血凝單位的濃度。每10毫升稀釋抗原中滴入10％檸檬酸鈉0.1～0.2毫升。(稀釋抗原能在4℃3．陰性雞：未經(jīng)任何免疫，用β一微量法測(cè)定其HI滴度在1:16以下。操作方法先在白色瓷板上劃好4×4厘米方格。以標(biāo)準(zhǔn)滴管加已稀釋好的抗原于方格內(nèi)，每格4滴(約0.1毫升)。然后刺破翅下靜脈或雞冠，用三用吸管吸取全血10微升于抗原液中充分?jǐn)嚢杌旌鲜怪归_成直徑3厘米大的液面。作用1～2分鐘后判定。結(jié)果判定根據(jù)血球凝集程度記錄結(jié)果：“2〞表示2分鐘內(nèi)100％凝集，血球凝集呈花斑狀或顆粒狀，背景澄清，判為陰性(無(wú)抗體)?！?〞表示局部凝集。2分鐘內(nèi)出現(xiàn)微量細(xì)小的凝集顆粒，背景不全清亮。具有程度不一的流動(dòng)血液，判為可疑。“0〞表示2分鐘內(nèi)不凝集。即100％抑制，血液與抗原均勻一致，判為陽(yáng)性(有抗體)?？记绊氈?．濃縮抗原一經(jīng)稀釋在野外條件下會(huì)受到陽(yáng)光、溫度、污染等多種因素影響，穩(wěn)定性降低，故抗原應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完或一次稀釋后存放4℃2．平板HI試驗(yàn)受溫度影響，氣溫低于9℃凝集緩慢，反響不充分；高于30℃洗脫加快，且易枯燥，影響判定。本實(shí)驗(yàn)宜在12～3．全血平板HI試驗(yàn)陰性雞，其HI滴度相當(dāng)于1～3(Log2)，攻毒后多數(shù)不保護(hù)；陽(yáng)性雞其HI滴度相當(dāng)于5(Log2)以上，攻毒后90％以上保護(hù)；可疑雞其HI滴度相當(dāng)于4(Log2)左右，攻毒后半數(shù)左右保護(hù)。用平板法在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)雞群免疫水平時(shí)，雞免疫后一定時(shí)間的雞群隨機(jī)檢測(cè)10～30只雞，如出現(xiàn)半數(shù)以上的陰性雞時(shí)，說明其免疫水平已處于臨界水平之下，急需再次免疫以迅速提高雞群抗體水平。平板法用于HI水平的定性測(cè)定，便于在技術(shù)條件較差的中小雞場(chǎng)和專業(yè)戶小群養(yǎng)雞現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，雖不如微量法精確，但操作簡(jiǎn)易快速。卵黃HI試驗(yàn)用卵黃測(cè)定HI抗體，方法簡(jiǎn)便，操作時(shí)先在蛋殼上打一蠶豆大孔，放盡蛋清，用1毫升注射器(不帶針頭)插入卵黃中吸取0.5毫升于等量中性磷酸緩沖鹽水或8％構(gòu)緣酸鈉或16％NaCl液中，混合后即可按血清β一微量法測(cè)定HI滴度，判定時(shí)為防止卵黃的影響，可從微孔板反面觀察凝集圖形。由于凝集圖型在卵黃液中洗脫較快；故應(yīng)及時(shí)判定。本法可利用破殼蛋、畸形蛋或無(wú)精蛋。尤適于蛋雞、種雞場(chǎng)應(yīng)用。卵黃抗體與產(chǎn)蛋時(shí)種雞血清抗體一致，與同一時(shí)期入孵的雛雞抗體相比平均高1個(gè)滴高，因此用卵黃測(cè)定HI抗體可防止捉雞采血對(duì)雞群的不良影響，還可通過測(cè)定同時(shí)了解種雞和出殼雛雞的抗體水平；以預(yù)測(cè)雛雞初次免疫最適時(shí)間。二、產(chǎn)蛋下降綜合征的診斷及抗體檢測(cè)、產(chǎn)蛋下降綜合征(EDS～76)是近年來傳入我國(guó)的一種新病，主要危害產(chǎn)蛋雞。其病原是一種腺病毒，來自于鴨，但只危害雞。該病毒可凝集雞，火雞和鴨的紅細(xì)胞，并在鴨胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液中有很高的血凝價(jià)，因此可用血凝(HA)試驗(yàn)和HI試驗(yàn)檢測(cè)病毒及其抗體。雞感染本病毒后常無(wú)明顯臨床病癥，僅表現(xiàn)突然產(chǎn)蛋下降，持續(xù)3周以上；產(chǎn)蛋下降幅度在30～50％之間。同時(shí)產(chǎn)軟殼蛋，蛋殼顏色變淺，畸形蛋可達(dá)10％以上。一旦發(fā)病，產(chǎn)蛋率很難到達(dá)頂峰或恢復(fù)到發(fā)病前水平。本病亦無(wú)特征性病理變化，因很少發(fā)生死亡。因此本病的診斷主要依靠血清學(xué)和病原學(xué)方法，同時(shí)結(jié)合流行病學(xué)和臨床病癥。(一)血清學(xué)診斷：主要包括HI抗體和瓊擴(kuò)抗體的測(cè)定1．血凝抑制試驗(yàn)(HI)：除了抗原用EDS～76病毒鴨胚尿囊液、陽(yáng)性對(duì)照血清用EDS76疫苗高度免疫過的雞血外，其它所用試劑和操作方法均與雞新城疫的血清HI試驗(yàn)相同。當(dāng)被檢雞的HI價(jià)達(dá)1:16以上時(shí)即可判為陽(yáng)性。2．瓊擴(kuò)試驗(yàn)：本法即可用于檢查病原，又可用于測(cè)定抗體。檢查病原時(shí)先將病料接種于10日齡鴨胚，培養(yǎng)96小時(shí)后收取鴨胚尿囊液，然后與EDS～76陽(yáng)性血清作瓊擴(kuò)反響，檢查抗體時(shí)用已培養(yǎng)好的病毒尿囊液作抗原，然后采待撿雞的血清與抗原作瓊擴(kuò)反響，瓊擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)有巳知病毒抗原和陽(yáng)性血清作對(duì)照，當(dāng)對(duì)照孔出現(xiàn)沉淀線時(shí)，待檢孔也出現(xiàn)了沉淀線．那么判為陽(yáng)性。待檢孔不出現(xiàn)沉淀線那么為陰性。瓊擴(kuò)試驗(yàn)所用的其他物品及操作方法與馬立克氏病血清瓊擴(kuò)完全一樣，可參考馬立克氏病瓊擴(kuò)試驗(yàn)一節(jié)。(二)病原學(xué)診斷方法：主要是病毒的別離和鑒定。取病癥明顯雞的輸卵管組織，研碎后用生理鹽水1:10稀釋；參加青鏈霉素，然后接種10日齡鴨胚或雞胚成纖維細(xì)胞，假設(shè)雞胚接種需培養(yǎng)96小時(shí)左右，細(xì)胞培養(yǎng)那么需72小時(shí)左右。連續(xù)盲傳2～3代；然后作HA試驗(yàn)和HI試驗(yàn)或瓊擴(kuò)試驗(yàn)對(duì)病毒作出鑒定。三、雞馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雞馬立克氏病(MD)是由馬立克病泡疹病毒引起的一種傳染病，以淋巴細(xì)胞增生和腫瘤形成為特征，在雞的疾病中，馬立克氏病是危害最大的疾病之一，雞群受到感染后，陸續(xù)患病，引起大批死亡．常常給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢疫馬立克氏病，實(shí)際應(yīng)用說明該法簡(jiǎn)便易行、毋須特殊設(shè)備、基層獸醫(yī)單位，雞場(chǎng)及養(yǎng)雞專業(yè)戶均可采用，是一種較為理想的診斷檢疫馬立克氏病的血清學(xué)方法。其具體操作方法如下：(一)試驗(yàn)材料試驗(yàn)用品塑料采血管、三棱針、打孔器、滴管、平皿、玻璃棒、燒杯、鑷子、蚊子、酒精燈和帶蓋瓷盤、瓊脂及含8％氯化鈉、PH7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液等?？乖u馬立克氏病羽囊抗原的制備：將病雞皮膚呈現(xiàn)紅腫感染處的羽毛從貼近皮膚處剪掉，剪下帶有羽囊的皮膚，稱重，參加二倍量的PH7.2的磷酸緩沖鹽水研磨。-20℃冰結(jié)后，再經(jīng)血清雞馬立克氏病陽(yáng)性血清的制備：用標(biāo)準(zhǔn)馬立克氏病羽囊抗原或通過剖檢和組織檢查確診為馬立克氏病病雞群，自病雞拔下新羽毛假設(shè)干、剪下羽囊，約5毫米長(zhǎng)為抗原。由病雞群挑選慢性病雞或康復(fù)雞采取血清。與羽囊抗原作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，如出現(xiàn)清晰沉淀線，那么為馬立克氏病陽(yáng)性血清，采血?jiǎng)e離血清，加0.01％硫柳汞防腐、冰結(jié)或4℃(二)操作瓊脂板的制備：用含有8％氯化鈉的磷酸緩沖液配制的1％的瓊脂溶液加熱溶化后倒入平皿中，制成2～3毫米厚的瓊脂板，平置室溫凝固。打孔：用打孔器(直徑2～3毫米金屬小管)按座標(biāo)紙上面好的七孔圖案，照?qǐng)D案固定位置打7個(gè)孔，中央打一個(gè)孔，孔徑為3毫米，外圍打6個(gè)孔，孔徑為2毫米，孔與孔的距離為3～4毫米，如直接以羽囊作試驗(yàn)，那么無(wú)須打抗原孔?？乖把宓奶砑觢．用標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè)未知抗體(被檢雞血清)(1)用帶膠乳頭滴管將受檢血清順序逐個(gè)地滴加于外周2、3、5、6孔內(nèi)，參加陽(yáng)性血清于1、4孔內(nèi)，每加一份受檢血清前，必須把吸管充分洗凈拭干。(2)在外圍孔滴加受檢血清完畢后，用另一滴管向中央孔滴加標(biāo)準(zhǔn)