改良支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)制片及染色法

改良支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)制片及染色法徐佳;黃媛;吳衛(wèi);董玉香;崔京濤;崔巍【摘要】目的改良支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類制片及染色方法，并對(duì)其臨床實(shí)用性進(jìn)行驗(yàn)證.方法隨機(jī)抽取50例門診及住院患者肺泡灌洗液標(biāo)本，分別用改良的自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法及傳統(tǒng)手工HE染色法染色，由兩名具有專業(yè)技術(shù)能力的檢驗(yàn)人員分別進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞分類計(jì)數(shù)滸估兩種制片方法檢測(cè)結(jié)果的可比性結(jié)果兩種方法對(duì)肺泡灌洗液中吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)一致性較好，相關(guān)系數(shù)(r)均＞0.95.改良法染色的細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核和細(xì)胞漿分辨清楚,可見(jiàn)顆粒、空泡等細(xì)微結(jié)構(gòu);而傳統(tǒng)法染色后的細(xì)胞固縮明顯細(xì)胞體積變小,細(xì)胞核和細(xì)胞漿分辨清晰度下降，顆粒和空泡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清.改良法比傳統(tǒng)法省去了濾液離心富集細(xì)胞的過(guò)程(6min),并且使用自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法(20min)代替了手工HE染色法(30min),每份標(biāo)本至少節(jié)省了15~20min的制片和染色時(shí)間.結(jié)論改良的自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法優(yōu)于手工HE染色法,更適用于支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，尤其是批量檢測(cè).【期刊名稱】《臨床檢驗(yàn)雜志》【年(卷)，期】2014(032)002【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P98-101)【關(guān)鍵詞】支氣管肺泡灌洗液;細(xì)胞分類計(jì)數(shù);瑞氏吉姆薩染色;HE染色【作者】徐佳;黃媛;吳衛(wèi);董玉香;崔京濤;崔巍【作者單位】北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730；北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730;北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730;北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730;北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730；北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730【正文語(yǔ)種】中文［中圖分類】R446支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavage,BAL）技術(shù)是一種通過(guò)纖維支氣管鏡對(duì)支氣管以下肺段或亞肺段以無(wú)菌生理鹽水反復(fù)灌洗、回收、獲取樣本，并進(jìn)行檢查與分析的技術(shù)［1］。BAL檢查可直接獲取下呼吸道及肺泡上皮表面襯液，即支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF），通過(guò)對(duì)其所含的炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定，可為結(jié)節(jié)病、過(guò)敏性肺泡炎、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化及肺部惡性腫瘤等疾病的診斷、鑒別診斷和療效觀察提供重要手段［2］。臨床實(shí)驗(yàn)室既往多根據(jù)2002年發(fā)布的《支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（草案）》規(guī)定進(jìn)行BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，采用手工制片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法或瑞氏染色法，其操作步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于標(biāo)本量日漸增多的常規(guī)檢測(cè)；且通常使用的細(xì)胞采集液中含有乙醇等成分，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)因固縮變小而不易被清晰辨認(rèn)［3］。為此，本研究簡(jiǎn)化了制片步驟并通過(guò)自動(dòng)化瑞氏吉姆薩（Wright-Giemsa）染色法進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，省去細(xì)胞收集液，使得淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的識(shí)別更加清晰，提高了BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的可靠性。1.1儀器與試劑細(xì)胞收集液（ThermoShandon公司）；HE染液（哈爾濱格林公司），瑞氏吉姆薩染液（珠海貝索公司），濾紙、漏斗、Cytospin細(xì)胞離心涂片機(jī)（ThermoScientific公司），改良Neubauer細(xì)胞計(jì)數(shù)版。Multifuge4KR離心機(jī)（Heraeus公司），SP-1000i自動(dòng)推片染色機(jī)（Sysmex公司），CX41普通光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）。1.2標(biāo)本采集及制備50例BALF標(biāo)本來(lái)自2013年4~9月北京協(xié)和醫(yī)院門診和住院患者。每位患者行支氣管鏡檢查時(shí)，留取25mL的BALF，裝入硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細(xì)胞粘附)，1h內(nèi)送檢。在改良Neubauer細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。1.3傳統(tǒng)制片和手工HE染色法(傳統(tǒng)法)操作流程見(jiàn)圖1。1.4改良制片和自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法(改良法)操作流程見(jiàn)圖1。1.5顯微鏡檢查由兩名具有專業(yè)技術(shù)能力的檢驗(yàn)人員完成。針對(duì)每份標(biāo)本，檢驗(yàn)人員在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS19.0軟件對(duì)兩人員間的細(xì)胞分類結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，評(píng)估兩人員間結(jié)果的一致性。然后對(duì)兩人員的計(jì)數(shù)結(jié)果取均值，通過(guò)SPSS19.0軟件線性回歸分析評(píng)估兩種方法間細(xì)胞分類結(jié)果的一致性。2.1BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果2.1.1人員間的BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果比較在傳統(tǒng)法細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中，兩人員間計(jì)數(shù)結(jié)果的回歸分析顯示：吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.989(P<0.01)、0.989(P<0.01)、0.985(P<0.01)和0.976(P<0.01)。在改良法細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中，兩人員間計(jì)數(shù)結(jié)果的回歸分析顯示:吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性良好，r分別為0.982(P<0.01)、0.986(P<0.01)、0.981(P<0.01)和0.969(P<0.01)。結(jié)果表明，兩人員間兩法的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果一致性均良好。2.1.2兩種方法的BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果比較取兩人員計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值，對(duì)傳統(tǒng)法和改良法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性良好，r分別為0.992(P<0.01)、0.992(P<0.01)、0.991(P<0.01)和0.975(P<0.01)。結(jié)果表明，兩方法間細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性均良好。2.2兩種方法檢測(cè)不同類型細(xì)胞形態(tài)的比較圖2~5顯示了在油鏡下觀察的兩種方法對(duì)吞噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的染色形態(tài)。瑞氏吉姆薩染色片中，細(xì)胞核被染成紫紅色，細(xì)胞漿被染成藍(lán)色。HE染色法中，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與細(xì)胞漿內(nèi)的核糖體著藍(lán)紫色，細(xì)胞漿和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著粉紅色。改良的自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法染色的細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核和細(xì)胞漿分辨清楚，可見(jiàn)顆粒、空泡等細(xì)微結(jié)構(gòu)；而手工HE染色后的細(xì)胞固縮明顯，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核和細(xì)胞漿分辨清晰度下降，顆粒和空泡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清。2.3兩種方法所需時(shí)間的比較由圖1所示的操作流程圖可明顯看出，改良法比傳統(tǒng)法省去了濾液離心富集細(xì)胞的過(guò)程(6min)，并且使用自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色法(20min)代替了手工HE染色法(30min)，至少節(jié)省了15~20min的制片和染色時(shí)間。健康人的BALF中，單核/吞噬細(xì)胞計(jì)數(shù)＞85%、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜12%、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜2%、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜1%［3-4］。病理情況下，BALF的細(xì)胞組成會(huì)發(fā)生明顯改變。當(dāng)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＞25%時(shí)，提示肉芽腫性肺病(如結(jié)節(jié)病、過(guò)敏性肺炎、非特異性間質(zhì)性肺炎、淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎、隱源性機(jī)化性肺炎等)，當(dāng)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＞50%，則高度提示過(guò)敏性肺炎和非特異性間質(zhì)性肺炎。當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞25%時(shí)，可協(xié)助診斷急性嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞50%，可有力支持急性肺損傷、吸入性肺炎或化膿性感染的診斷［5］。因此，BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)能夠?yàn)榉尾坎∽冃再|(zhì)、炎癥過(guò)程及疾病活動(dòng)性等提供重要的參考信息，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外已普遍應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的診斷、預(yù)后和療交攵觀察［6-7］。本研究建立的改良法與傳統(tǒng)法BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)有良好的一致性，但二者的操作流程卻有明顯的不同：改良法將過(guò)濾后的濾液直接用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度，而傳統(tǒng)法將濾液離心富集細(xì)胞后，再用細(xì)胞收集液調(diào)整細(xì)胞濃度；改良法用自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色，而傳統(tǒng)法用手工HE染色。傳統(tǒng)法中用到的細(xì)胞收集液主要成分為乙醇、甲醇、異丙醇和聚乙二醇，具有破壞紅細(xì)胞、固定有核細(xì)胞的作用，可防止細(xì)胞在染色操作中被破壞或丟失。但該液體也會(huì)使有核細(xì)胞固縮變小，使之在顯微鏡下結(jié)構(gòu)不清，不易辨別，如圖2-2、3-2、4-2、5-2所見(jiàn)。同時(shí)，紅細(xì)胞殘?jiān)赡芨蓴_細(xì)胞的正確辨認(rèn)。改良法不用細(xì)胞收集液，主要因?yàn)槿鹗霞匪_染液的溶劑即為甲醇，本身即有固定細(xì)胞的作用。改良法和傳統(tǒng)法所獲結(jié)果的一致性很好，并沒(méi)有因?yàn)槿鄙偌?xì)胞收集液而出現(xiàn)細(xì)胞被破壞或脫落的現(xiàn)象，所以改良法直接用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度。對(duì)于細(xì)胞總數(shù)很少的BALF標(biāo)本，將濾液離心富集細(xì)胞的過(guò)程是必要的，但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，95%的BALF標(biāo)本不需要富集濾液細(xì)胞，可用生理鹽水直接將細(xì)胞懸液調(diào)整至最佳濃度，以減少富集過(guò)程所需的時(shí)間。HE染色有兩種主要染液：蘇木精和伊紅。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基——正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合使胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對(duì)比。由于組織或細(xì)胞的不同成分對(duì)蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣，各種組織或細(xì)胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均可顯示出來(lái)，故HE染色更適用于細(xì)胞和組織病理學(xué)檢查［8］。而瑞氏吉姆薩染色法結(jié)合了瑞氏染色法和吉姆薩染色法的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞胞核、胞漿和胞漿內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對(duì)比鮮明，常用于白細(xì)胞分類。因此，BALF的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，瑞氏吉姆薩染色更為合適。自動(dòng)化瑞氏吉姆薩染色機(jī)已逐漸普及，可突現(xiàn)瑞氏吉姆薩染色法的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)手工染色勞動(dòng)強(qiáng)度大，而且有時(shí)會(huì)受溫度、時(shí)間、試劑、環(huán)境及個(gè)體差異等因素的影響，胞漿、胞核染色深淺不一，顏色對(duì)比不強(qiáng)，而自動(dòng)染片機(jī)預(yù)先設(shè)定好染色程序和時(shí)間，使得每一次染色的步驟和時(shí)間都能一致，胞漿和胞核結(jié)構(gòu)經(jīng)染色后清晰均勻，對(duì)比鮮明［9］。此外，自動(dòng)染片機(jī)的操作簡(jiǎn)單，可縮短制片周期，批量染色更加節(jié)約時(shí)間，減少人力［10］?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】劉成玉，羅春麗，吳曉蔓，等.臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012:18,262.中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范(草案)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002，25(7):390-391.DanilaE,JurqauskieneL,NorkunieneJ,etal.BALfluidcellsinnewlydiagnosedpulmonarysarcoidosiswithdifferentclinicalactivity[J].UpsJMedSci,2009,114(1):26-31.Domagala-KulawikJ,GuzmanJ,CostabelU.Immunecellsinbronchoalveolarlavageinperipherallungcancer-analysisof140cases[J].Respiration,2003,70(1):43-48.MeyerKC,RaghuG,BaughmanRP,etal.AnofficialAmericanThoracicSocietyclinicalpracticeguideline:theclinicalutilityofbronchoalveolarlavagecellularanalysisininterstitiallungdisease[J].AmJRespirCritCaremed,2012,185(9):1004-1014.MeyerKC,RaghuG.Bronchoalveolarlavagefortheevaluationofinterstitiallungdisease:isitclinicallyuseful[J].EuropeanRespiratoryJournal,2011,38(4):761-769.TanHL,RegameyN,BrownS,etal.T