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文檔簡介
關(guān)于實驗一蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍染色法第一頁,共三十一頁,2022年,8月28日Pleasebequiet,上課了?。〉诙?,共三十一頁,2022年,8月28日
1、學習利用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量的原理及方法;
2、掌握分光光度計的使用方法;
3、掌握標準曲線的繪制。
一、實驗?zāi)康模旱谌?,共三十一頁?022年,8月28日
考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中游離狀態(tài)下為棕紅色。當它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合后變?yōu)樗{色.
蛋白質(zhì)染料復合物對595nm可見光有最大光吸收.
在一定范圍內(nèi)(10-1000ug/ml)其OD595nm值與蛋白質(zhì)含量成正比,故可用分光光度法進行蛋白質(zhì)的定量測定。二、實驗原理:第四頁,共三十一頁,2022年,8月28日考馬斯亮藍G-250染色法原理465nm595nm酸性環(huán)境下呈棕紅色與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍色加入蛋白質(zhì)第五頁,共三十一頁,2022年,8月28日雙縮脲反應(yīng):Folin-酚試劑法(Lowry法):紫外吸收法:微量凱式定氮法:其他蛋白質(zhì)含量的測定方法第六頁,共三十一頁,2022年,8月28日(1)雙縮脲法:
原理是蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(-CO-NH-)因此,有雙縮脲反應(yīng),在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物,其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比,故可以用來測定蛋白質(zhì)含量.第七頁,共三十一頁,2022年,8月28日(2)Folin-酚試劑法(Lowry法):
是雙縮脲法的發(fā)展,第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質(zhì)復合物的形成,然后這個復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑,產(chǎn)生深藍色(鉬藍和鎢藍混合物)比雙縮脲法靈敏,但費時;
第八頁,共三十一頁,2022年,8月28日(3)紫外吸收法:
蛋白質(zhì)中Trp,Phe,Tyr的殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵,吸收高峰在280nm處,所以蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),并且蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量成正比,可用作定量測定。簡單、靈敏、快速、不耗樣品,低濃度的鹽類不干擾。
第九頁,共三十一頁,2022年,8月28日(4)微量凱式定氮法:
根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%,因此,測得1g蛋白氮,相當于6.25g蛋白質(zhì)。
第十頁,共三十一頁,2022年,8月28日
1、實驗材料:豆芽
2、儀器:(1)S-22pc可見光分光光度計(2)研缽
(3)離心機(4)試管(5)容量瓶等
3、試劑:(1)染色液:考馬斯亮藍G-250
(100mg考馬斯亮藍溶于50ml95%乙醇,加100ml85%磷酸,加水稀釋至1L)(2)濃度:0.25mg/ml的牛血清白蛋白標準溶液。三、實驗材料、儀器和試劑:第十一頁,共三十一頁,2022年,8月28日1、制作標準曲線:
取7支試管,依次分別加入0.0,0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液,用水補足到0.5ml,每管均再加5ml染色液,立即搖勻,置室溫下放置5分鐘。然后測各管的OD595nm值,繪制標準曲線。四、實驗步驟:
第十二頁,共三十一頁,2022年,8月28日制作標準曲線:
編號1(空白)234567樣品標準蛋白
(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml
水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值第十三頁,共三十一頁,2022年,8月28日標準蛋白質(zhì)濃度OD值0樣品OD值C00.050.0750.1
0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6
標準曲線的制作(圖)y=ax+bR2=第十四頁,共三十一頁,2022年,8月28日標準曲線的繪制目的:得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。首先,用一組已知濃度的蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍G-250反應(yīng),然后在595nm處測定吸光度(OD)。其次,繪制濃度與吸光度對應(yīng)的曲線圖。最后,測定樣品蛋白質(zhì)的吸光度然后在曲線上找到對應(yīng)的濃度。第十五頁,共三十一頁,2022年,8月28日
稱取豆芽葉片2g→研缽中加2ml水→研成勻漿→轉(zhuǎn)入離心管→用水分三次沖洗研缽,每次2ml→均轉(zhuǎn)入同一離心管→等重后4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘→取上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶→定容。2、樣品蛋白質(zhì)提?。旱谑?,共三十一頁,2022年,8月28日
吸取0.5ml提取液于試管中,加入考馬斯亮藍G-250染色劑5ml,充分混勻,放置5分鐘,測OD595nm,記錄結(jié)果,查曲線,得蛋白質(zhì)濃度C0(mg/ml)。3、測定:第十七頁,共三十一頁,2022年,8月28日分光光度技術(shù)
利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜,利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法,稱為分光光度法或分光光度技術(shù),使用的儀器稱為分光光度計.
紅外吸收光譜:波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。紫外吸收光譜:波長范圍200400nm(近紫外區(qū))可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析??梢娢展庾V:波長范圍400750nm,主要用于溶液等的定量分析。第十八頁,共三十一頁,2022年,8月28日
朗伯—比爾(Lambert-bee)光吸收定律:A=lg(I0/It)=-lgT=εbc(1)A—吸光度“OD”:描述溶液對光的吸收程度;同一種溶液對不同波長光的吸光度是不相同的,在吸光度最大處所對應(yīng)的波長稱為最大光吸收處。同一種物質(zhì)不同濃度的吸光度,在某一定波長下有差異,在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進行物質(zhì)定量分析的重要依據(jù)。I0:表示入射光強度,It:表示光線通過溶液后的強度。光吸收定律:第十九頁,共三十一頁,2022年,8月28日(2)T—透光度:描述入射光透過溶液的程度;
(3)ε—摩爾吸光系數(shù)(是溶液的特征常數(shù)),在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度;單位mol·L-1;(4)b—樣品光程(cm),通常使用1.0cm的吸收地,b=1cm(5)C—樣品濃度(mol/L)由上式可以看出:吸光度OD與物質(zhì)的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A=lg(I0/It)=-lgT=εbc
第二十頁,共三十一頁,2022年,8月28日
分光光度計的組成和構(gòu)造:(1)光源;(2)單色器(3)吸收池;(4)接收檢測放大系統(tǒng)(檢測器);(5)信號指示系統(tǒng)(顯示或記錄器)。第二十一頁,共三十一頁,2022年,8月28日
⑴光源:
用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢
,現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈(Halogenlamp),適用波長范圍是320~1100nm。用于紫外光區(qū)的是氫燈和氘燈適用波長范圍是195~400nm。第二十二頁,共三十一頁,2022年,8月28日⑵單色器:單色器是分光光度計的心臟部分。把來自光源的混合光波分解為單一波長的光能隨意改變光的波長。單色器一般由入射狹縫、準光器(透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光)、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵第二十三頁,共三十一頁,2022年,8月28日⑶吸收池吸收池(即比色杯):用來盛裝被測試的溶液。光學比色杯和石英比色杯兩種。光學比色杯適用波長范圍是400nm~2000nm,只能用于可見光。石英比色杯可透過紫外光、可見光和紅外光,是最常使用的吸收池,使用波長范圍是180nm~3000nm。光程可由0.1cm至10cm,最常用的是1cm池(容積3ml)第二十四頁,共三十一頁,2022年,8月28日比色杯使用注意事項:①比色杯在使用前后都要徹底的清洗。②嚴禁用手指觸摸透光面,因指紋不易洗凈。③嚴禁用硬紙和布擦拭透光面,只能使用鏡頭紙和綢布。④嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時,可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。
第二十五頁,共三十一頁,2022年,8月28日⑷檢測器:檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備,即把光強度以電訊號顯示出來,常用的檢測器有光電管,光電倍增管和光電二極管等。
⑸顯示裝置:分光光度計現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示,有的還連有打印機。高性能分光光度計均可以連接微機,而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機,有的還帶有標準軟驅(qū),存取數(shù)據(jù)更加方便。第二十六頁,共三十一頁,2022年,8月28日偏離朗伯—比耳定律的原因
標準曲線法測定未知溶液的濃度時,發(fā)現(xiàn):標準曲線常發(fā)生彎曲(尤其當溶液濃度較高時),這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素(兩大類):(1)物理性因素,即儀器的非理想引起的;(2)化學性因素。第二十七頁,共三十一頁,2022年,8月28日(1)物理性因素
難以獲得真正的純單色光。
朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。
非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會引起對Beer-Lambert定律的偏離,最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。
第二十八頁,共三十一頁,2022年,8月28日(2)化學性因素
朗—比耳定律的假定:所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用;假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當溶液濃度c>10-2mol/L時,溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、互變異構(gòu)、配合物的形成和與溶劑間的作用,使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化,影響吸光度。
例:鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡:CrO42-+2H
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