大腸菌檢測-科立得酶底物法介紹課件

水中大腸菌群及大腸埃希氏菌檢測

－科立得酶底物法介紹IDEXXLaboratories美國愛德士生物科技背景信息－大腸桿菌大腸菌群（totalColiforms)

大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指標菌的一般特征故以此作為糞便污染指標評價飲水的衛(wèi)生質量。耐熱大腸菌群（糞大腸菌群，F(xiàn)ecalColiforms)

用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。是水體受人畜糞便污染的比較直接指標。大腸埃希氏菌（大腸桿菌，E.Coli.)大腸埃希氏菌是指能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，能產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產生熒光的細菌。大腸埃希氏菌是糞大腸菌群的組成部分，是水體受人畜糞便污染的最直接指標，水中含有大腸埃希氏菌提示有糞便污染。

相關背景信息大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌

耐熱大腸菌群大腸埃希氏菌大腸菌群背景材料－檢測方法多管發(fā)酵法（MTF)以100mL水樣中大腸菌最可能數(shù)(mostprobablenumber,MPN)表示

培養(yǎng)基制備>試管培養(yǎng)（22－26小時）陰性結果（無產酸，產氣）產酸，產氣平板培養(yǎng)18－24小時

觀察菌落形態(tài)，挑取特征菌落

革蘭氏染色，鏡檢>證實試驗（36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h，有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在

背景材料－檢測方法濾膜法（membranefiltration,MF)用孔徑為0.45μｍ的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù),計數(shù)單位為菌落形成單位CFU(colonyformingunit)儲備培養(yǎng)基的制備>過濾（需器械滅菌等）>培養(yǎng)（22-24H）

陰性結果(無典型菌落）觀察菌落形態(tài),挑取特征菌落

革蘭氏染色，鏡檢證實試驗（36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h，有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在

背景材料－檢測方法酶底物法原理：1，大腸菌群細菌能特異性產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），該生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，β-半乳糖醛苷），使培養(yǎng)液呈黃色。2，大腸埃希氏菌能特異性產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），分解MUG（4-甲基-傘形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）,使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產生熒光。利用該原理，來判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。

試劑中同時含有ONPG和MUG，所以本方法可同時檢測總大腸菌群和大腸埃希氏菌，51孔法并可以定量。檢測方法－酶底物法(EnzymeSubstrateTechnique)國標GB/T5750.12—2006采用:DST技術酶底物法1,方法

采用固定底物技術（DefinedSubstrateTechnology，DST）之酶底物法，DST技術的原理就是采用和目標細菌特異性反應的培養(yǎng)基,并使之量最小化,比一般酶底物法假陽性/陰性的發(fā)生率更底。2，培養(yǎng)基：

采用MinimalMediumONPG-MUG

(MMO-MUG)，即最少化ONPG-MUG培養(yǎng)基每1000mLMMO-MUG培養(yǎng)基所含基本成份為：A硫酸銨(NH4)2SO45.0gB硫酸錳Mn(SO4)20.5mgC硫酸鋅ZnSO40.5mgD硫酸鎂MgSO4100mgE氯化鈉NaCl10gF氯化鈣CaCl250mgG亞硫酸鈉Na2SO340mgH兩性霉素BAmphotericinB1mgIOrtho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)500mgJ4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG)75mgKSolanium萃取物500mgLN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid鈉鹽5.3gMN-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethanesulphonicacid6.9gMUG的陽性反應(大腸桿菌E.Coli陽性反應)

(Colilert,Colilert-18,Colisure)Colilert?之應用飲用水

源水

瓶裝水

再生水

廢水

食品水畜牧用水

醫(yī)療用水

收錄于“標準測試法”內

–APHA(美國公共衛(wèi)生協(xié)會),

USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO……

Colilert?(酶底物法;MMO-MUG;DST)介紹一個樣品同時檢測大腸菌群及大腸埃希氏菌24小時判斷結果定性法或定量法

（51孔定量盤）根據(jù)DefinedSubstrateTechnology?(DST)測量技術Colilert(MMO-MUG,DST?)針對目標細菌(Coliforms&E.Coli)的特異性營養(yǎng)指示劑(培養(yǎng)基)營養(yǎng)指示劑作用時,顏色會改變或呈現(xiàn)螢光反應其它非目標細菌不會干擾

減少雜菌干擾無培養(yǎng)基干擾(傳統(tǒng)方式常會因消毒劑、鹽、

抗生素、毒素、溫度造成抑制反應)

減少假陽性反應減少假陰性反應

不須確認

特異性

-大腸菌群和大腸埃希氏菌測試結果快速

判讀容易優(yōu)點m-endoMF*MTF*MLSBMF**Colilert**0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997假陽性比較表假陰性比較表

成本比較表測試時間比較表定性檢測操作示范

加入Colilert試劑，搖晃至溶解

36℃培養(yǎng)24小時，判斷結果:1,無顏色變化－陰性2,黃色－大腸桿菌群陽性3,黃色且熒光－大腸埃希氏菌陽性44.5℃培養(yǎng)24小時，判斷結果：1,無顏色變化－陰性2,黃色－糞大腸陽性Quanti-Tray?定量盤操作示范

將定量盤Quanti-Tray?放入程控定量封口機Sealer封口36℃培養(yǎng)24小時后，計算呈陽性反應的格子，然后對照MPN表

計數(shù)（44.5℃培養(yǎng)24小時用于檢測糞大腸）Colilert?使用方式為了減少培養(yǎng)箱的負荷，所有樣品必須回溫至室溫后使用

測試包打開后直接倒入，請勿敲打

對照樣品請儲存于陰暗處

請使用運送時刻表以避免對照樣品過期

測試物呈陰性反應時，Colilert會變成微黃色

Quanti-Tray?定量盤方法從定量盤的標識處打開

請把未用完之定量盤留置包裝袋內

若要開啟定量盤，請在定量盤的最上方壓制“U”型在將樣品倒入。請注意：封口盤的塑料是不易碎的，但背面的鋁箔封是易碎的。用筆在定量盤背面作標識

勿觸碰定量盤里面

在細菌培養(yǎng)器堆起定量盤，但勿裝入箱中

計算所有陽性格子

免費提供Quanti-Tray/2000

軟件

Quanti-Tray?廢棄物處理方式

請遵守地方法規(guī)

陰性反應盤可依一般廢棄物丟棄

陽性反應盤丟棄前應以高溫高壓滅菌方式(Autoclave)或混合清水的家用漂白劑處理程控定量封口機維護清理多余溢出的液體

插入的橡膠圈可用漂白劑、酒精清潔或以高溫高壓處理

封口機是鋁合金及不銹鋼制成，因此可用清水、酒精及漂白劑清洗傳統(tǒng)用法的步驟

vs.

ColilertIDEXX

于1984年成立于美國緬因州，年營業(yè)額為7億美元,在美國納斯達克上市全球有超過3，000名員工,400多種的產品行銷于70以上個國家IDEXX

有龐大的研發(fā)團隊并有40-50位具有專業(yè)執(zhí)照的博士致力于簡易、快速、精準具經濟效益之測試產品研發(fā)檢測及診斷試劑和相關設備的全球市場領導者

水質

食品

寵物及經濟動物愛德士公司(IDEXX)簡介

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