DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與解讀課件

DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進(jìn)展主講人：鄧媛媛李洋DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進(jìn)展主講人：鄧媛媛在2002年4月，美國《科學(xué)》雜志，登載了一篇長達(dá)14頁的論文尤其引人注目———《水稻（秈稻）基因組的工作框架序列圖》。

2004年12月，水稻基因組“精細(xì)圖”全部完成在2002年4月，美國《科學(xué)》雜志，登載了一篇長達(dá)14頁的2004年12月10日，中國科學(xué)家在世界上率先完成的家蠶基因組“框架圖”及基因組生物學(xué)分析成果在世界科學(xué)類權(quán)威的學(xué)術(shù)期刊——《Science》雜志上發(fā)表。2004年12月10日，中國科學(xué)家在世界上率先完成的家蠶基因2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜完成的大熊貓基因測序。2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因?yàn)槭裁匆M(jìn)行DNA測序？DNA測序的目的就是為了認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)，了解生物的差異性，以及不同的生物進(jìn)化和發(fā)展的歷史。DNA測序?qū)χ亟MDNA的研究提供了方向。DNA測序在疾病診斷和基因分型中有重要的實(shí)用價(jià)值為什么要進(jìn)行DNA測序？DNA測序的目的就是為了認(rèn)識(shí)生命的本

DNA測序技術(shù)對象的發(fā)展

自20世紀(jì)70年代DNA序列分析技術(shù)發(fā)明以來，人類對基因和基因組結(jié)構(gòu)的研究和探索就沒有停止過。1977年測定了噬菌體X174基因組全部核苷酸序列。目前，已分析完成了大批生物的全部基因組序列，包括噬菌體、病毒、細(xì)菌、酵母、多細(xì)胞真核生物、小鼠和人類。2001年初完成的人類基因組計(jì)劃使基因組研究達(dá)到了高潮，是人類真正認(rèn)識(shí)和自我改造的開端。DNA測序技術(shù)對象的發(fā)展自20世紀(jì)70第一代DNA測序技術(shù)

三測序方法的原理第二代DNA測序技術(shù)

三個(gè)測序平臺(tái)的工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術(shù)單分子測序的特點(diǎn)及應(yīng)用前景DNA測序技術(shù)的歷史自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個(gè)測序技術(shù)的發(fā)展歷程。第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)

成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期?！?977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法?！裢粫r(shí)期,Maxam和Gilbert報(bào)道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法?！?0世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測序技術(shù)將DNA測序帶入自動(dòng)化測序的時(shí)代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。第一代DNA測序技術(shù)成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70一，雙脫氧鏈終止法

原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP

存在條件下復(fù)制時(shí),在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因?yàn)殡p脫氧核苷沒有3′-OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長,若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3′端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段,長度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3′端的雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。一，雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合二，化學(xué)降解法

在該方法中,一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的DNA片段在5組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解,其中每一組反應(yīng)特異地針對某種堿基。生成5組放射性標(biāo)記的分子,每組混合物中均含有長短不一的DNA分子,其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA片段上的位置。最后,各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。二，化學(xué)降解法在該方法中,一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的三，熒光自動(dòng)測序技術(shù)熒光自動(dòng)測序技術(shù)基于Sanger原理，用四種不同的熒光混合物分別標(biāo)記四種反應(yīng)的產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標(biāo)記物的ddNTP可以在同一反應(yīng)管種進(jìn)終止測序反應(yīng)，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進(jìn)行電泳檢測。當(dāng)帶有某種熒光素標(biāo)記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測范圍時(shí)，激光所激發(fā)的熒光信號(hào)被探測器接受，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，自動(dòng)排列出DNA序列。三，熒光自動(dòng)測序技術(shù)熒光自動(dòng)測序技術(shù)基于Sanger原第一代測序法的比較第一代測序法的比較第二代DNA測序技術(shù)·羅氏454公司的GSFLX測序平臺(tái)·Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺(tái)·ABI公司的SOLiD測序平臺(tái)二代測序的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。第二代DNA測序技術(shù)·羅氏454公司的G

一、GSFLX測序技術(shù)的原理1.樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。2.文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3.一個(gè)DNA片段＝一個(gè)磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器4.乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。一、GSFLX測序技術(shù)的原理1.樣品輸入并片段5.一個(gè)磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。5.一個(gè)磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板

一、GSFLX測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

GSFLX系統(tǒng)的測序也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將優(yōu)點(diǎn)引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；

特點(diǎn)：分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化。一、GSFLX測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)GSFLX

Solexa測序技術(shù)路線：GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?’羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達(dá)到2×50bp，更長的讀長也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4.數(shù)據(jù)分析

Solexa測序技術(shù)路線：GenoSolexa測序技術(shù)的特點(diǎn)①通量高。目前一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G的數(shù)據(jù);②準(zhǔn)確率高?！?8.5%，同時(shí)也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題;③成本低。低于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)成本的1%;④DNA序列的讀取長度不斷增加，當(dāng)前單條序列讀長可達(dá)到150bp;⑤可以進(jìn)行Pair-end(PE)雙向測序，PE文庫插入片段大小范圍可由150bp到10kb。正確選擇插入片段長度有利于高重復(fù)序列含量基因組的組裝，這進(jìn)一步擴(kuò)展了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。Solexa測序技術(shù)的特點(diǎn)①通量高。目前一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高ABI測序技術(shù)ABI3730XL的測序原理ABI3730xl常規(guī)測序平臺(tái)采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機(jī)檢測器就可對熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。ABI測序技術(shù)ABI3730XL的測序原理#三種第二代測序技術(shù)對比##三種第二代測序技術(shù)對比#第三代DNA測序技術(shù)

第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時(shí)候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。

第三代DNA測序技術(shù)第二代測序技術(shù)在制備

1.Helicos公司

Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。

將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫。檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。1.Helicos公司

2.PacificBiosciences公司

PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號(hào)檢測區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（微秒級）相比會(huì)很長，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進(jìn)入熒光型號(hào)檢測區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測區(qū)。2.PacificBiosciences公司3.OxfordNanoporeTechnologies公司

OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號(hào)測序的技術(shù)。他們設(shè)計(jì)了一種以α-溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時(shí)，被切下來的單個(gè)堿基會(huì)落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。3.OxfordNanoporeTechnologie

中國機(jī)構(gòu)主要承擔(dān)和參與已完成的動(dòng)植物基因組測序項(xiàng)目

物種國內(nèi)主要承擔(dān)機(jī)構(gòu)人中國科學(xué)院華大基因研究中心等水稻中國科學(xué)院華大基因研究中心等

家蠶西南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院北京基因組研究所和華大基因研究中心等家雞中國科學(xué)院北京基因組研究所和華大基因研究中心等人深圳華大研究院等血吸蟲南方基因中心等黃瓜深圳華大研究院等

大熊貓深圳華大研究院等螞蟻深圳華大研究院等中國機(jī)構(gòu)主要承擔(dān)和參與已完成的動(dòng)植物基因組測序項(xiàng)目總結(jié)與展望

三代測序技術(shù)的原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。第一代測序技術(shù)

憑借其長的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對新物種進(jìn)行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補(bǔ)，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術(shù)中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價(jià)位低的特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-endsequencing)可以為基因組進(jìn)一步拼接提供定位信息，但是隨著反應(yīng)輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀AT區(qū)時(shí)有明顯錯(cuò)誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯(cuò)能力以及較高的測序通量，適合轉(zhuǎn)錄本研究以及比較基因組學(xué)特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術(shù)在基因組拼接中的廣泛應(yīng)用。第三代測序技術(shù)目前正在研發(fā)階段，尚未正式投入使用。總結(jié)與展望

三代測序技術(shù)的原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。

隨著新的測序技術(shù)的出現(xiàn),大規(guī)模測序的成本迅速下降,花費(fèi)1000美元測一個(gè)人的基因組的目標(biāo)相信很快就可以實(shí)現(xiàn)。屆時(shí),對于遺傳病的診治將變得簡單、快速,并能從基因組水平上指導(dǎo)個(gè)人的醫(yī)療和保健,從而進(jìn)入個(gè)人化醫(yī)療的時(shí)代。HOPENESS隨著新的測序技術(shù)的出現(xiàn),大規(guī)模測序的成本迅速DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進(jìn)展主講人：鄧媛媛李洋DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進(jìn)展主講人：鄧媛媛在2002年4月，美國《科學(xué)》雜志，登載了一篇長達(dá)14頁的論文尤其引人注目———《水稻（秈稻）基因組的工作框架序列圖》。

2004年12月，水稻基因組“精細(xì)圖”全部完成在2002年4月，美國《科學(xué)》雜志，登載了一篇長達(dá)14頁的2004年12月10日，中國科學(xué)家在世界上率先完成的家蠶基因組“框架圖”及基因組生物學(xué)分析成果在世界科學(xué)類權(quán)威的學(xué)術(shù)期刊——《Science》雜志上發(fā)表。2004年12月10日，中國科學(xué)家在世界上率先完成的家蠶基因2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜完成的大熊貓基因測序。2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因?yàn)槭裁匆M(jìn)行DNA測序？DNA測序的目的就是為了認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)，了解生物的差異性，以及不同的生物進(jìn)化和發(fā)展的歷史。DNA測序?qū)χ亟MDNA的研究提供了方向。DNA測序在疾病診斷和基因分型中有重要的實(shí)用價(jià)值為什么要進(jìn)行DNA測序？DNA測序的目的就是為了認(rèn)識(shí)生命的本

DNA測序技術(shù)對象的發(fā)展

自20世紀(jì)70年代DNA序列分析技術(shù)發(fā)明以來，人類對基因和基因組結(jié)構(gòu)的研究和探索就沒有停止過。1977年測定了噬菌體X174基因組全部核苷酸序列。目前，已分析完成了大批生物的全部基因組序列，包括噬菌體、病毒、細(xì)菌、酵母、多細(xì)胞真核生物、小鼠和人類。2001年初完成的人類基因組計(jì)劃使基因組研究達(dá)到了高潮，是人類真正認(rèn)識(shí)和自我改造的開端。DNA測序技術(shù)對象的發(fā)展自20世紀(jì)70第一代DNA測序技術(shù)

三測序方法的原理第二代DNA測序技術(shù)

三個(gè)測序平臺(tái)的工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術(shù)單分子測序的特點(diǎn)及應(yīng)用前景DNA測序技術(shù)的歷史自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個(gè)測序技術(shù)的發(fā)展歷程。第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)第一代DNA測序技術(shù)

成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期?！?977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法?！裢粫r(shí)期,Maxam和Gilbert報(bào)道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法?！?0世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測序技術(shù)將DNA測序帶入自動(dòng)化測序的時(shí)代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。第一代DNA測序技術(shù)成熟的DNA測序技術(shù)始于20世紀(jì)70一，雙脫氧鏈終止法

原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP

存在條件下復(fù)制時(shí),在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因?yàn)殡p脫氧核苷沒有3′-OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長,若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3′端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段,長度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3′端的雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。一，雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合二，化學(xué)降解法

在該方法中,一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的DNA片段在5組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解,其中每一組反應(yīng)特異地針對某種堿基。生成5組放射性標(biāo)記的分子,每組混合物中均含有長短不一的DNA分子,其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA片段上的位置。最后,各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。二，化學(xué)降解法在該方法中,一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的三，熒光自動(dòng)測序技術(shù)熒光自動(dòng)測序技術(shù)基于Sanger原理，用四種不同的熒光混合物分別標(biāo)記四種反應(yīng)的產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標(biāo)記物的ddNTP可以在同一反應(yīng)管種進(jìn)終止測序反應(yīng)，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進(jìn)行電泳檢測。當(dāng)帶有某種熒光素標(biāo)記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測范圍時(shí)，激光所激發(fā)的熒光信號(hào)被探測器接受，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，自動(dòng)排列出DNA序列。三，熒光自動(dòng)測序技術(shù)熒光自動(dòng)測序技術(shù)基于Sanger原第一代測序法的比較第一代測序法的比較第二代DNA測序技術(shù)·羅氏454公司的GSFLX測序平臺(tái)·Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺(tái)·ABI公司的SOLiD測序平臺(tái)二代測序的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列。第二代DNA測序技術(shù)·羅氏454公司的G

一、GSFLX測序技術(shù)的原理1.樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。2.文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3.一個(gè)DNA片段＝一個(gè)磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器4.乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。一、GSFLX測序技術(shù)的原理1.樣品輸入并片段5.一個(gè)磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測序開始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測序模板進(jìn)行配對，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。5.一個(gè)磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板

一、GSFLX測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

GSFLX系統(tǒng)的測序也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將優(yōu)點(diǎn)引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；

特點(diǎn)：分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化。一、GSFLX測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)GSFLX

Solexa測序技術(shù)路線：GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?’羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達(dá)到2×50bp，更長的讀長也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4.數(shù)據(jù)分析

Solexa測序技術(shù)路線：GenoSolexa測序技術(shù)的特點(diǎn)①通量高。目前一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G的數(shù)據(jù);②準(zhǔn)確率高。≥98.5%，同時(shí)也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題;③成本低。低于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)成本的1%;④DNA序列的讀取長度不斷增加，當(dāng)前單條序列讀長可達(dá)到150bp;⑤可以進(jìn)行Pair-end(PE)雙向測序，PE文庫插入片段大小范圍可由150bp到10kb。正確選擇插入片段長度有利于高重復(fù)序列含量基因組的組裝，這進(jìn)一步擴(kuò)展了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。Solexa測序技術(shù)的特點(diǎn)①通量高。目前一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高ABI測序技術(shù)ABI3730XL的測序原理ABI3730xl常規(guī)測序平臺(tái)采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機(jī)檢測器就可對熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。ABI測序技術(shù)ABI3730XL的測序原理#三種第二代測序技術(shù)對比##三種第二代測序技術(shù)對比#第三代DNA測序技術(shù)

第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時(shí)候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。

第三代DNA測序技術(shù)第二代測序技術(shù)在制備

1.Helicos公司

Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。

將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫。檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序。1.Helicos公司

2.PacificBiosciences公司

PacificBiosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號(hào)檢測區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（微秒級）相比會(huì)很長，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進(jìn)入熒光型號(hào)檢測區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測區(qū)。