酶工程教學(xué)課件

酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請自行刪除，謝謝！酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用第一節(jié)抗體酶（Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)抗體蛋白的特性：抗體（antibody）：抗原（antigen）：半抗原（hapten）：第一節(jié)抗體酶（Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)酶工程教學(xué)課件IgG的三級結(jié)構(gòu)IgG的三級結(jié)構(gòu)IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗體與酶的異同：相同點：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。不同點：1）抗體無催化活力，酶有催化活力。2）本質(zhì)差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)，抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。3）酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié)，種類有限?？贵w只有在抗原存在時才產(chǎn)生，種類無限?？贵w與酶的異同：2.酶與底物形成過渡態(tài)理論

酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過渡態(tài)，降低能障（反應(yīng)的活化能）。以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.酶與底物形成過渡態(tài)理論二、抗體酶的定義抗體酶又稱催化抗體（catalyticantibody），是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。二、抗體酶的定義三、抗體酶的制備1.誘導(dǎo)法用設(shè)計好的半抗原，通過與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對動物進行免疫，取免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞雜交，雜交細胞則分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得抗體酶。三、抗體酶的制備酶工程教學(xué)課件2.拷貝法用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。2.拷貝法酶工程教學(xué)課件四、抗體酶的應(yīng)用1.戒毒:

用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。四、抗體酶的應(yīng)用2.腫瘤治療

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細胞的表面。靜脈給藥后，當藥物擴散至腫瘤細胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。2.腫瘤治療第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類三、核酶的應(yīng)用四、核酶面臨的問題五、影響核酶活性的因素第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化I型內(nèi)含子剪接型核酶II型內(nèi)含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP異體催化

二、核酶的分類I型內(nèi)含子二、核酶的分類1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪又接的方式除去內(nèi)含子〔Intron)。1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪又接的1〕I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是與四膜蟲26srRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列，具有環(huán)狀構(gòu)造。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反響，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過程需要鳥苷酸或鳥苷以及鎂離子參與。剪接機制L-19IVS在體外的多種酶活性1〕I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型Ip3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內(nèi)含子的剪接機制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內(nèi)含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘p3’

UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲rRNA前體自我剪接反應(yīng)UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU酶工程教學(xué)課件1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內(nèi)切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2〕Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反響，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反響不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機制2〕Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體的Ip2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內(nèi)含子的剪接機制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接p2‘pp-Ap3’pP-AHO3’Ⅱ類內(nèi)含子2.剪切型核酶

這類RNA進展自身催化的反響是只切不接。

1〕自體催化剪切型

剪切機制

2.剪切型核酶

這類RNA進展自身催化的反響是只切不接轉(zhuǎn)酯化過程：由靠近切割位點3‘端的2’OH或氧原子對切割位點的磷原子實施親核攻擊，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。剪切機制核酶自身剪切反應(yīng)轉(zhuǎn)酯化過程：剪切機制核酶自身剪切反應(yīng)錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個雙螺旋區(qū)。13個核苷酸殘基保守序列。剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生。錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu)和空間立體發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研究煙草環(huán)斑病毒〔sTRSV〕的負鏈RNA的自我剪切反響，提出發(fā)夾構(gòu)造〔hairpinstructure〕模型。發(fā)夾核酶構(gòu)造模型發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研四個螺旋區(qū)、三個連接區(qū)和兩個環(huán)。剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端。5‘3‘發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)模型剪切位點四個螺旋區(qū)、三個連接區(qū)和兩個環(huán)。5‘3‘發(fā)2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。2)異體催化剪切型三、核酶的應(yīng)用1.基礎(chǔ)理論：生命起源的探索2.醫(yī)藥：1）通過識別特定位點而抑制目標基因的表達，抑制效率高，專一性強。如抗肝炎病毒、抗人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)、抗腫瘤。2）免疫原性低，很少引起免疫反應(yīng)。3.植物抗病毒三、核酶的應(yīng)用1.基礎(chǔ)理論：生命起源的探索

四、核酶面臨的問題1、核酶催化效率低。2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶RNase破壞。四、核酶面臨的問題1、核酶催化效率低。五、影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響：pH7.0-7.5時核酶活性最高。2、二價金屬陽離子對活性的影響:Mg2+Mn2+

3、抗生素對活性的影響：大多數(shù)為抑制效應(yīng)4、變性劑對活性的影響:5、溫度對活性的影響:

五、影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響：第三節(jié)極端酶（extremozyme）一、極端微生物和極端酶

1.極端微生物：又稱嗜極菌（extremophiles），是在超常生態(tài)環(huán)境條件下生存的微生物。

第三節(jié)極端酶（extremozyme）根據(jù)所耐受的環(huán)境條件不同，分為：嗜熱菌（thermophiles）超嗜熱菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（psychrophiles）嗜鹽菌（halophiles）嗜酸菌（acidophiles）嗜堿菌（alkaliphiles）嗜壓菌（barophiles）抗輻射的微生物根據(jù)所耐受的環(huán)境條件不同，分為：2.極端酶的制備1）天然極端酶的篩選和生產(chǎn)2）蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)極端酶2.極端酶的制備思考題：思考題：GoodLuckforthefinalExam!

Greatsuccessinyourfuturecareer!GoodLuckforthefinalExam!

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的交聯(lián)晶格IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗體與酶的異同：相同點：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。不同點：1）抗體無催化活力，酶有催化活力。2）本質(zhì)差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)，抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。3）酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié)，種類有限。抗體只有在抗原存在時才產(chǎn)生，種類無限?？贵w與酶的異同：2.酶與底物形成過渡態(tài)理論

酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過渡態(tài)，降低能障（反應(yīng)的活化能）。以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.酶與底物形成過渡態(tài)理論二、抗體酶的定義抗體酶又稱催化抗體（catalyticantibody），是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。二、抗體酶的定義三、抗體酶的制備1.誘導(dǎo)法用設(shè)計好的半抗原，通過與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對動物進行免疫，取免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞雜交，雜交細胞則分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得抗體酶。三、抗體酶的制備酶工程教學(xué)課件2.拷貝法用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。2.拷貝法酶工程教學(xué)課件四、抗體酶的應(yīng)用1.戒毒:

用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。四、抗體酶的應(yīng)用2.腫瘤治療

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細胞的表面。靜脈給藥后，當藥物擴散至腫瘤細胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。2.腫瘤治療第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類三、核酶的應(yīng)用四、核酶面臨的問題五、影響核酶活性的因素第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化I型內(nèi)含子剪接型核酶II型內(nèi)含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP異體催化

二、核酶的分類I型內(nèi)含子二、核酶的分類1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪又接的方式除去內(nèi)含子〔Intron)。1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機制是通過既剪又接的1〕I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是與四膜蟲26srRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列，具有環(huán)狀構(gòu)造。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反響，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過程需要鳥苷酸或鳥苷以及鎂離子參與。剪接機制L-19IVS在體外的多種酶活性1〕I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型Ip3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內(nèi)含子的剪接機制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內(nèi)含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘p3’

UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲rRNA前體自我剪接反應(yīng)UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU酶工程教學(xué)課件1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內(nèi)切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2〕Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反響，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反響不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機制2〕Ⅱ類內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體的Ip2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內(nèi)含子的剪接機制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接p2‘pp-Ap3’pP-AHO3’Ⅱ類內(nèi)含子2.剪切型核酶

這類RNA進展自身催化的反響是只切不接。

1〕自體催化剪切型

剪切機制

2.剪切型核酶

這類RNA進展自身催化的反響是只切不接轉(zhuǎn)酯化過程：由靠近切割位點3‘端的2’OH或氧原子對切割位點的磷原子實施親核攻擊，產(chǎn)生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。剪切機制核酶自身剪切反應(yīng)轉(zhuǎn)酯化過程：剪切機制核酶自身剪切反應(yīng)錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個雙螺旋區(qū)。13個核苷酸殘基保守序列。剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生。錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu)和空間立體發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研究煙草環(huán)斑病毒〔sTRSV〕的負鏈RNA的自我剪切反響，提出發(fā)夾構(gòu)造〔hairpinstructure〕模型。發(fā)夾核酶構(gòu)造模型發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研四個螺旋區(qū)、三個連接區(qū)和兩個環(huán)。剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端。5‘3‘發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)模型剪切位點四個螺旋區(qū)、三個連接區(qū)和兩個環(huán)。5‘3‘發(fā)2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基