第四章體內藥物分析方法的建立與驗證課件

第四章

體內藥物分析

方法的建立與驗證1第四章體內藥物分析1第一節(jié)

分析方法的設計依據

在建立分析方法之前，應充分利用現(xiàn)代科技成就和前人的研究成果，系統(tǒng)檢索國內外的科技文獻，對藥物在生物體內的存在狀況、藥代動力學參數(shù)、分析檢測方法等相關資料加以分析和研究，以供借鑒。對于尚無文獻報道的藥物，亦可參考同類藥物的相關文獻。

檢索文獻，可在最短時間、最小的花費（磨刀不誤砍柴工）建立一個好的分析方法！這是試驗前要做的第一件事！大四的同學們，你們查過文獻嗎？2第一節(jié)分析方法的設計依據在建立分析方法之前，血藥濃度94-20085122篇3血藥濃度94-20085122篇344551992年創(chuàng)刊的《中國臨床藥學雜志》

2001年第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院主辦的《藥學服務與研究》兩刊于2004年同時成為中國科技核心期刊

臨床藥學專業(yè)性的學術期刊有：61992年創(chuàng)刊的《中國臨床藥學雜志》臨床藥學專業(yè)性的學術期不想當將軍的士兵不是好士兵容量大的U盤：《中國臨床藥學雜志》、《藥學服務與研究》中大量的相關文獻拷貝下來另外以“臨床藥學”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學監(jiān)護”、“血藥濃度”等為關鍵詞，查找相關的文獻，copy!看文獻寫論文提職稱7不想當將軍的士兵不是好士兵容量大的U盤：這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告??！實驗一改進的柱前衍生-HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度由老師提供文獻?？赐晡墨I后，考慮一個問題：該如何設計、優(yōu)化實驗條件？實驗二姜黃素-PVP固體分散體在兔體內的藥代動力學參數(shù)的測定大家到圖書館電子閱覽室查閱文獻?。?！

關鍵詞：姜黃素，血藥濃度或：姜黃素，（藥代）動力學要看PDF文檔，電腦要安裝ADOBEREADER軟件8這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告??！實驗一一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況準確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過一定的生物樣品預處理使待測物從結合物或綴合物中釋放出來。故此，應首先考慮樣品預處理方法 待測藥物的理化性質 藥物在生物體內的存在狀況 藥物在生物體內的生物轉化(代謝)途徑建立分析檢測方法的主要依據有：9一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況準確測定生物(一)待測藥物的理化性質

藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等—決定預處理方法及萃取方法 具有親脂性—在適當?shù)膒H值下用溶劑萃取 具有強極性或親水性—沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等 具有揮發(fā)性—GC測定法 具有光譜或電化學特性—分析檢測方法 藥物的穩(wěn)定性—萃取濃縮技術 對酸堿不穩(wěn)定—避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩(wěn)定—避免高溫蒸發(fā)溶劑---一個例子10(一)待測藥物的理化性質 藥物的pKa值、親脂性、溶解另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥”---青蒿素

瘧疾是危害人類最大的疾病之一。全球每年瘧疾病人超過5億，死亡100萬人以上。屠呦呦：古醫(yī)書中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機溶劑提取物對瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫(yī)書：“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之?！焙椭兴幊Ｓ玫募灏痉ú煌?？原來里面用的是青蒿鮮汁！改用沸點較低的乙醚提取，抑制率達100%溫度?。。?！11另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥”---青蒿素(二)待測藥物的體內存在狀態(tài)與血漿蛋白結合的強弱及結合率的高低 —決定分離萃取方法指標：提取回收率

蛋白結合較強（非極性強）—不宜直接采用溶劑萃??？有機溶劑沒選對？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物

—決定分析檢測技術

濃度較低（尤其有代謝產物共存） —代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定 —采用HPLC或LC-MS等分析檢測技術12(二)待測藥物的體內存在狀態(tài)與血漿蛋白結合的強弱及結合率的二、分析測定的目的與要求

體內藥物分析的目的—影響分析方法的應用

藥代動力學—研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄過程—血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產物

要求—同時測定原形藥物和代謝產物

檢測—寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產物的分離)

方法—不必強調方法的簡便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術，如HPLC、LC-MS建立分析檢測方法的主要依據有：13二、分析測定的目的與要求 體內藥物分析的目的—影二、分析測定的目的與要求

臨床治療藥物監(jiān)測

藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近

方法—盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定，大多采用UV、RIA或EIA等。？

中毒患者的臨床搶救

藥物濃度極高

方法—不必強調方法的靈敏度，強調方法的特異性和分析速度 —大多采用色譜及其聯(lián)用技術GC、GC-MS、RIA或EIA？14二、分析測定的目的與要求 臨床治療藥物監(jiān)測14三、生物樣品的類型與預處理方法 生物樣品的類型與預處理方法—決定分析方法的應用

以血漿或血清為分析樣品

采用蛋白沉淀、溶劑萃取預處理技術 —分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測

用RIA分析？FPIA法 —樣品的預處理方法可較為粗放 —經過簡單的蛋白沉淀或不經任何預處理直接測定15三、生物樣品的類型與預處理方法 生物樣品的類型與預處理方法—四、實驗室條件 在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。此外，還應從方法的可行性、每個樣品測定耗時多少（10min）、操作的難易及技術要求及儀器、設備要求、費用多少等等方面加以考慮。16四、實驗室條件 在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到

在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5ng/ml～1μg/ml，其檢測方法可采用HPLC法、LC-MS法和微生物法等數(shù)種方法。若用HPLC法來檢測該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對樣品進行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-MS法來檢測該樣品，則由于LC-MS儀器的靈敏度足以檢測濃度為1ng/ml以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來檢測該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。

例子117在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊

當然，用LC-MS法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血樣處理最好采用蛋白沉淀法。18當然，用LC-MS法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作

蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩(wěn)定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優(yōu)于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。19蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀

如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-內酰胺類抗生素，對酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。----具體問題具體分析----信息，查文獻例子220如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇二、分析方法的建立 (一)

檢測條件的篩選 (二)分離條件的篩選21第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇一、分析方法的選擇

體內藥物分析方法的設計受多種因素影響 生物樣品中的藥物濃度—決定分析方法的首要要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產物的濃度低、樣品量少 —難以通過增加取樣量提高方法靈敏度 —通過選擇適當?shù)姆治龇椒ㄟm應樣品分析需求。常用分析方法的檢測限度及分離能力見表4-122一、分析方法的選擇 體內藥物分析方法的設計受多種因素影響22摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則二○○五年三月SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質譜聯(lián)用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數(shù)藥物的檢測；（2）免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質多肽類物質檢測；（3）微生物學方法，可用于抗生素藥物的測定。從目前發(fā)展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LC－MS、GC－MS法，這類方法靈敏度、特異性、準確性一般都能適應臨床藥代動力學研究的需要，多數(shù)實驗室也具備條件，因此應用最廣，大約90%的藥物濃度測定可以用色譜法來完成。具體選用何種分析方法應根據藥物的化學結構、理化性質、儀器條件以及借鑒文獻方法多方面因素來考慮確定。23摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則（一）常用分析方二、分析方法的建立初步擬定分析方法后 進行一系列試驗工作，以選擇最佳分析條件

同時驗證分析方法的可行性，以確認是否適用于實際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選24二、分析方法的建立初步擬定分析方法后24(一)檢測條件的篩選

標準物質—照擬定的分析方法(不包括生物基質的預處理)測定—確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度

HPLC—調整檢測器(類型、條件)、色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經、柱長度)、流動相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進樣量、內標物質的濃度及其加入量等—使各物質具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當?shù)谋Ａ魰r間(tR)25(一)檢測條件的篩選 標準(二)分離條件的篩選

在進行分離條件篩選時，應考察生物基質中的內源性物質及代謝產物對分離與檢測的干擾，步驟如下：

1．空白溶劑試驗—溶劑(方法特異性) 2．空白生物基質試驗—(方法特異性) 3．模擬生物樣品試驗—方法效能指標 4．實際生物樣品測試—代謝產物(方法特異性)26(二)分離條件的篩選 在進行分離條件篩選時，應考察生物基質1．空白溶劑試驗

待測藥物的非生物基質溶液（通常為水溶液） —采用擬定的分析方法進行衍生化反應、萃取分離等 樣品預處理（反應試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等） —測定響應信號（如HPLC峰面積或峰高） 考察目標 —方法的特異性 —空白值應盡可能小，并能有效校正271．空白溶劑試驗 待測藥物的非生物基質溶液（通常為水溶液）2對色譜分析法而言

—可通過改變反應條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型 —空白試劑信號應不干擾藥物的測定（如R＞1.5）

本步驟主要考察 —需經化學反應的預處理過程，若預處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進行該步驟，直接進行空白生物基質試驗28對色譜分析法而言 —可通過改變反應條件、萃取方法或萃取條件（2.空白生物基質試驗

空白生物基質(blankbiologicalmatrix) —如空白血漿 —按“空白溶劑試驗”項下方法操作 考察目標

—生物基質中內源性物質對測定的干擾（方法特異性） —在待測藥物(或特定的活性代謝物、內標物質等)的“信號窗”內不應出現(xiàn)內源性物質信號292.空白生物基質試驗 空白生物基質(blankbiolcelecoxib塞來考昔<抗關節(jié)炎藥，COX-2抑制劑>30celecoxib塞來考昔<抗關節(jié)炎藥，COX-2抑制劑>33.模擬生物樣品試驗

模擬生物樣品—空白生物基質中加入待測藥物，照“空白溶劑試驗”項下方法操作

考察目標： —方法的線性范圍、精密度與準確度、靈敏度、 藥物的萃取回收率等各項技術指標—同時進一步檢驗生物基質中內源性物質以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性313.模擬生物樣品試驗 模擬生物樣品—空白生物基質中對色譜分析法而言

—進一步考察待測藥物、內標物與內源性物質(或其它藥物)的分離情況 —如色譜峰的tR、n和T是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標準曲線的截距是否顯著偏離零點等 均可說明內源性物質是否對待測藥物或內標物質構成干擾32對色譜分析法而言 —進一步考察待測藥物、內標物與內源性物質4.實際生物樣品的測試

空白生物基質和模擬生物樣品試驗—確定的分析方法及其條件 —不能完全確認是否適合于實際生物樣品的測定 —藥物在體內可能與內源性物質結合(如血漿蛋白結合物)或代謝生成數(shù)個代謝產物及其進一步的結合物(或綴合物) 實際生物樣品—確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試 考察目標：—代謝產物對藥物、內標物質的干擾情況—進一步驗證方法的可行性？334.實際生物樣品的測試 空白生物基質和模擬生空白血漿空白血漿+標準標準溶液志愿者實際樣品空白溶劑試驗多余？34空白血漿空白血漿+標準標準溶液志愿者實際樣品空白溶劑試驗第三節(jié)分析方法

驗證的內容與要求

基于以下原因需要對建立的分析方法學進行驗證：1、生物樣品量少2、藥物或活性代謝產物濃度低3、內源性物質的干擾4、生物的個體差異較大35第三節(jié)分析方法

驗證的內容與要求基于以下原因需（二）方法學確證建立可靠的和可重復的定量分析方法是進行臨床藥代動力學研究的關鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須對方法進行充分確證，一般應進行以下幾方面的考察：1、特異性(Specificity)2、標準曲線和定量范圍（CalibrationCurve）3、定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）4、精密度與準確度（PrecisionandAccuracy）5、樣品穩(wěn)定性(Stability)6、提取回收率7、微生物學和免疫學方法確證8、方法學質控摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則

36（二）方法學確證摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則

用于實際生物樣品分析之前： 需要驗證(validation)分析方法的可行性與可靠性 方法驗證時應考慮影響分析方法的所有可變因素：

取樣、樣品制備、色譜分離、檢測與數(shù)據評價使用的樣品

—通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣

驗證的技術指標 —效能指標

37 用于實際生物樣品分析之前：37驗證步驟

首先為分析方法的驗證 —特異性、精密度與準確度、回收率、定量限與檢測限、穩(wěn)定性等

其次為生物基質中待測藥物穩(wěn)定性的驗證 —室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán)Freeze-and-thawcycle38驗證步驟 首先為分析方法的驗證38驗證的效能指標與基本要求

1．特異性（專屬性）—避免干擾 2．標準曲線與線性范圍—覆蓋所有濃度范圍 3．準確度—與實際狀況相符 4．精密度—結果可重現(xiàn) 5．定量限—達到峰濃度的1/10～1/20 6．穩(wěn)定性—確保所有樣品準確測定 7．提取回收率—確保檢測的靈敏度39驗證的效能指標與基本要求 1．特異性（專屬性）—避免干擾3一、方法特異性(專屬性或選擇性)

方法的特異性(specificity) —又稱專屬性或專一性，通常與選擇性(selectivity)互用 —系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力，通常表示所檢測的信號(響應)系屬于待測藥物所特有 選擇性—包括將待測物質與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力

特異性—函蓋二者，以驗證所測定的物質與待測藥物的同一性特異性用于考察方法的抗干擾程度。如果特異性不佳，方法的準確度、精密度、線性都將受到影響。因此確保特異性是建立和驗證一個分析方法的第一步。

40一、方法特異性(專屬性或選擇性) 方法的特異性(1.內源性物質的干擾

比較—待測藥物或其活性代謝產物的對照品（或標準品） —空白生物基質 —模擬生物樣品（空白生物基質中添加對照品）的檢測信號 —如HPLC色譜峰的tR、n和拖尾因子（T）是否一致，以及與內源性物質色譜峰的分離度（R） 確證—內源性物質對分析方法有無干擾考察一個分析方法是否具有特異性，應著重考慮以下幾點：411.內源性物質的干擾 比較—待測藥物或其活性代謝產物的對照2.代謝產物的干擾

比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號 如HPLC中藥物色譜峰的tR、n和T是否一致，〔或改變色譜條件(色譜柱)再比較〕，以及與代謝產物的R，來確證代謝產物對分析方法有無干擾。

結構已知的特定活性代謝物的測定 －通過HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性

對于結構未知的代謝產物的測定 －采用LC-LC-NMR進行結構的初步推測后，考察其干擾情況。422.代謝產物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥對于色譜法至少要考察6個不同個體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖，以反映分析方法的特異性。對于以軟電離質譜為基礎的檢測法（LC-MS、LC-MS-MS）應注意考察分析過程中的介質效應，如離子抑制等。摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則

43對于色譜法至少要考察6個不同個體的空白生物樣品3.伍用藥物的干擾

TDM時 —還要考慮患者可能同時服用藥物的干擾 通過比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號 如HPLC色譜峰的tR、n和T是否一致

來確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況443.伍用藥物的干擾 TDM時444.與參比方法的相關性

除上述方法外，有時還可使用參比方法對照法。 參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關系良好的色譜法。如在TDM中使用UV(或RIA)時,可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測定結果為橫坐標(X);擬定方法結果為縱坐標(Y) 用最小二乘法計算回歸方程Y＝a＋bX(坐標標度相等)、相關系數(shù)(r)—表示兩種方法測得結果的一致性，若r≠1，表示擬定方法為非線性，如RIA中抗血清滴度選擇不當454.與參比方法的相關性 除上述方法外，有4.與參比方法的相關性

Y＝a＋bX截距(a)—表示擬定方法受到恒定干擾的程度—內源性物質(UV) 斜率(b)—表示擬定方法受到比例干擾的程度—標記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關性比較，除顯示分析方法的特異性外，還反映分析方法的準確度。 —斜率b表示兩種方法測得結果的一致性

若參比方法準確度良好，且截距a≈0,則擬定方法的準確度(回收率)為100b(%)464.與參比方法的相關性 Y＝a＋bX46二、標準曲線與線性范圍

標準曲線（standardcurve）—校正（calibrationcurve）or工作（workingcurve） —指生物樣品中所測定藥物濃度與響應（峰面積或峰高）的相關性（呈比例的程度） —通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價 —除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式 —常用的回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權最小二乘法（weightedleastsquares） 線性范圍（linearrang）—標準曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 —在此線性范圍內，模擬生物樣品的測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度47二、標準曲線與線性范圍 標準曲線（standardcurv二、標準曲線與線性范圍(續(xù))

標準曲線—用模擬生物樣品建立 —線性范圍(不包括零點)應能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 —不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度

建立標準曲線所使用的模擬生物樣品應使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質制備48二、標準曲線與線性范圍(續(xù)) 標準曲線—用模擬生物樣品建立4標準曲線的一般建立過程：標準系列溶液的制備內標溶液的制備標準系列模擬生物樣品的制備、測定標準曲線的繪制加權最小二乘法限度要求49標準曲線的一般建立過程：標準系列溶液的制備內標溶液的制備標準曲線的一般建立方法

1.標準系列溶液的制備標準物質－對照品、標準品 溶劑—水或甲醇（或其他適當溶劑） 濃度—模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上 加入量為生物樣品總體積的2%以下 避免標準模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異。難溶性藥物，濃度較低—應除去溶劑后再加入生物基質結晶？否則,在實際樣品測定時應加入等體積的溶劑并渦旋混勻

50標準曲線的一般建立方法 1.標準系列溶液的制備50

至少含5～8個濃度點(不包括零點，即空白) —可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常數(shù)約為2) 若體內平均達峰濃度為50，其1/20為2.5 設定最高濃度為100，最低濃度為1(個體差異)51 至少含5～8個濃度點(不包括零點，即空白)512、內標溶液的制備內標物質－對照品、標準品或化學試劑適宜的溶劑－甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度－與標準系列溶液的中間濃度相當如：某標準溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，則內標的濃度應配制成40μg/ml

在這里，加內標溶液時并沒有象標準溶液那樣要求加入量為生物樣品總體積的2%以下，為什么？522、內標溶液的制備內標物質－對照品、標準品或化學試劑3.標準系列模擬生物樣品的制備

空白生物基質(如血漿)—加入標準系列溶液適量，渦旋混勻標準模擬生物樣品的最高濃度應高于生物體用藥后的達峰濃度，最低濃度應低于Cmax的10％～5％。目的—涵蓋 為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失？ ——①先加入標準溶液②再加入空白生物基質 ③渦旋混勻

①②③533.標準系列模擬生物樣品的制備空白生物基質(如血漿)—4.標準曲線的繪制

以待測藥物的檢測響應(如色譜峰面積或峰高)或與內標物質的檢測響應的比值(內標法)(因變量,y)對模擬血藥濃度(自變量,x) —求得回歸方程(y＝a＋bx)及其相關系數(shù)() 在一組由至少7個濃度(不包括零點)構成的標準曲線中，至多可有2個濃度點數(shù)據，可予剔除。但應有確切原因，如： （1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問題；（3）顯著偏離標準曲線 —其余應有至少5個濃度點在標準曲線上544.標準曲線的繪制 以待測藥物的檢測響應(如色譜峰面積或5.加權最小二乘法

普通最小二乘法—每個濃度點絕對誤差(yi－yi’)賦予同等的重要性

若標準曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達102) —低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求。加權最小二乘法—回歸計算時增加一個權重因子(w) —各濃度的響應值與回歸值的相對離差平方和達到最小式中，wi為標準曲線上第i個濃度點的權重因子555.加權最小二乘法 普通最小二乘法—每個濃1）回歸方程(y=a+bx)參數(shù)的計算

現(xiàn)在有專業(yè)軟件561）回歸方程(y=a+bx)參數(shù)的計算 現(xiàn)在有專業(yè)2）權重因子的選擇 選擇加權因子時—兼顧考慮曲線上高、中、低各濃度點的準確度，賦予低濃度點以更大的權重 在實際工作中的一般方法 （1）當wi=1/(yi’)2時，則 （2）而yi與xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 當高濃度點測量值的準確度下降過大 低濃度點權重過大，降低低濃度點的權重，wi=k/xi572）權重因子的選擇 選擇加權因子時—兼顧考慮曲線上高、中、標準曲線的限度要求

—標準曲線至少包括5個濃度(通常為5～8個濃度,不包括零點)—最高濃度應高于用藥后生物體內藥物的達峰濃度(Cmax)，最低濃度應為方法的LOQ(非LOD)，并應低于Cmax的10％～5％（1/10-1/20）—若標準曲線濃度范圍較寬，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權回歸—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200—相關系數(shù)要求≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學方法)—回歸方程的截距應接近于零，b≥1使之具有較高的靈敏度--與坐標的標度選擇有關在藥代動力學或生物利用度研究中：58標準曲線的限度要求 —標準曲線至少包括5個濃度(通常為5～8三、準確度

方法準確度(accuracy)—系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 理論上應使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的。所以，通常使用模擬生物樣品測定，以測得的濃度與添加的理論濃度比較計算求得。 一般用相對回收率(relativerecovery，RR)或相對誤差(relativeerror，RE)表示59三、準確度 方法準確度(accuracy)—系指用該1.測定法

取空白生物基質（如血漿）數(shù)份，照標準曲線項下方法操作，在標準曲線范圍內制備質控(qualitycontrol，QC)樣品 —高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3個濃度 —每一濃度至少5個樣本 —與隨行的標準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次，用標準曲線計算測得的濃度601.測定法 取空白生物基質（如血漿）數(shù)份，照標準曲線項2.結果計算與限度要求

計算 —測定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求 —相對回收率應在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近為±20%)612.結果計算與限度要求 計算61四、精密度

方法精密度(precision) —系指每次測定結果與多次測定的平均值的偏離程度 —表示該分析方法的可重復性(reproducibility) —反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一 理論上，精密度應使用實際生物樣品測定。但實際上生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml) —使用模擬生物樣品測定，且通常與方法準確度評價同時進行，如日內精密度即可使用方法準確度的測定數(shù)據計算。62四、精密度 方法精密度(precision)621.表示方法

方法精密度一般用標準偏差(standarddeviation，SD)或相對標準偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示SD= RSD= =在體內藥物分析中，方法精密度一般用RSD表示。631.表示方法 方法精密度一般用標準偏差(standard批內(within-run或intra-assay)RSD系指在同一分析批內測定結果之間的RSD。一個分析批通常在一個工作日內完成，又稱為日內(within-day)RSD。

無論是藥代動力學試驗或治療藥物監(jiān)測監(jiān)測，通常在一個工作日內難以完成全部樣品的分析。在不同工作日之間的實驗條件有可能發(fā)生微小變化，對分析結果有可能產生影響。所以，方法精密度除要考察批內RSD外，同時還有考察批間RSD。

批間(between-run或inter-assay)RSD系指在不同分析批的測定結果之間的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日內完成，又稱為日間(between-day，day-to-day)RSD。64批內(within-run或intra-assay)R2.測定法—分別測定法(Ⅰ)

取空白生物基質(如血漿)數(shù)份，照準確度項下方法，分別在同一批內和不同批間制備高、中、低3個濃度的QC樣品，并分析測定批內RSD：一個工作日內完成，隨行制備一條標準曲線和每一濃度5～6個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標準曲線分別計算3個濃度的RSD批間RSD：在至少5個工作日內完成，每一工作日內完成一個分析批的測定。每一分析批內制備一條標準曲線和每一濃度1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標準曲線計算3個濃度(每一濃度5～6個分析批數(shù)據)的RSD652.測定法—分別測定法(Ⅰ) 取空白生物基質(如血漿)數(shù)2.測定法

若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行3個批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為5～6個樣本)—采用多次分析的方差分析法 批間RSD= 批內RSD= =批內與批間RSD662.測定法 若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進3.限度要求

在藥代動力學和生物利用度研究中

對g/ml級水平的RSD一般應≤10% ng/ml級水平的RSD一般應≤15% 在LOQ附近RSD應≤20%。

673.限度要求 在藥代動力學和生物利用度研究中67五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度(sensitivity) —標準曲線上的最低濃度點(最低濃度點≥LOQ)

要求—應能滿足測定3～5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的10％～5％ —準確度在80%～120%(或RE在±20%的范圍內) —RSD≤20%68五、定量限 方法定量限(limitofquantitat最低檢測限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下識別生物樣品中藥物的最低濃度，一般認為信噪比（S/N）≥3，信號可被檢測，故以S/N＝3時的樣品濃度作為LOD。LOQ的檢測信號至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作為LOQ的估計值。69最低檢測限（limitofdetectionLOD）：LODTestS/N＝370LODTestS/N＝370六、穩(wěn)定性生物樣品量較大時，在一個工作日內難以完成全部樣品的分析；有時樣品需進行復測。因此生物樣品及其預處理后的殘渣或溶液的穩(wěn)定性就顯得尤為重要。需要對樣品的存放條件和時間進行考察，以保證分析結果的準確、可靠方法穩(wěn)定性

生物樣品的穩(wěn)定性穩(wěn)定性71六、穩(wěn)定性生物樣品量較大時，在一個工作日內難（一）方法穩(wěn)定性：首先考察待測藥物的標準品（內標、衍生化試劑）或其分析溶液在實驗室溫度、濕度、光照及暴露空氣等條件下的穩(wěn)定性；在分析方法的建立時要考慮模擬生物樣品的預處理過程（提取、凈化及相轉移）及待測物（蒸干后的殘渣及其溶液）在室溫或冰箱中存放的穩(wěn)定性。72（一）方法穩(wěn)定性：首先考察待測藥物的標準品（內標、衍生化試劑短期穩(wěn)定性：主要考察模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及凍－融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性（二）生物樣品的穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性：主要考察生物樣品長期冰凍（－20℃或－80℃）后的穩(wěn)定性，考察期限從生物樣品的采集到分析完畢的整個時間區(qū)間。73短期穩(wěn)定性：主要考察模擬生物樣品在室溫、4℃或－20℃以及測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復測定三次，平均值應為零時測定的±5％以內（經衍生化處理±15％以內）。若考察時間大于1天，則應與新制QC樣品比較，若考察時間很長，可與在液氮中保存的樣品在相同條件下的測定值比較2、穩(wěn)定性期限要求室溫下存放一般僅考察1個工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中－數(shù)個工作日（或數(shù)星期、數(shù)月）74測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件七、萃取回收率（Extactionrecovvvery）

從生物樣品基質中回收得到分析物質的響應值與加入的標準品的響應值的百分比即為分析物的萃取回收率。也可以說是將供試生物樣品中分析物萃取出來供分析的比例。

應考察高、中、低3個濃度的萃取回收率，其結果應當精密和可重現(xiàn)75七、萃取回收率（Extactionrecovvvery）1.測定法

取空白生物基質(如血漿)，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次 另取等量的相同3個濃度的標準溶液，用溶解模擬生物樣品經提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定

AT—經萃取后的QC樣品的檢測信號或比值(內標法) AS—未經萃取的標準溶液的檢測信號或比值(內標法)761.測定法 取空白生物基質(如血漿)，制備高、中、低3個實驗過程中的注意事項1、要考察是內源性物質還是提取方法對提取回收率產生影響2、測定回收率時，如采用內標法，內標應在提取之后，溶劑蒸發(fā)之前加入3、采用內標法定量時，應同時測定內標物質的提取回收率，只需配制一個中間濃度的QC樣品5份，同法測定。77實驗過程中的注意事項1、要考察是內源性物質還是提取方法對提取2.限度要求在生物利用度或TDM時高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應≥70%高、中濃度的RSD應≤15%低濃度的RSD應≤20%內標法中內標物質的提取回收率應≥50%（RSD≤15%)782.限度要求在生物利用度或TDM時78

（1）方法準確度(或相對回收率，relativerecovery)（2）萃取回收率(絕對回收率，absoluterecovery)萃取回收率與相對回收率的比較：（1）萃取回收率主要考察生物樣品預處理過程造成的藥物的程度損失（2）相對回收率主要用來考察測定方法的準確度，采用標準曲線可準確計算生物樣品中藥物濃度79 （1）方法準確度(或相對回收率，relativereco有時，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水性藥物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。解決辦法：表面硅烷化處理或加入可降低吸附的試劑如異丙醇、異戊醇、乙二胺等。80有時，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水八、質量控制1、質控樣品（QualitycontrolQC）：是指將已知量的待測藥物加入到空白生物基質中配制的模擬生物樣品，用于整個分析過程中的質量控制，一般配制高、中、低三個濃度的樣品分析方法建立并通過驗證后，方可進行實際生物樣品的測定，此時仍需對分析數(shù)據的質量進行監(jiān)控！質控樣品池由不負責生物樣品測試的人員（推薦由獨立的人員）在實驗開始時制備，并與實際生物樣品在相同條件下儲存81八、質量控制1、質控樣品（Qualitycontrol2、質量控制（1）測定法：在測定過程中，每批生物樣品都應建立相應的標準曲線，并隨行間隔以高→低或低→高測定高、中、低至少3個濃度的6個QC樣品（2）限度要求：6個QC樣品中至少4個的測定結果的準確度在各自正常濃度80％～120％，RSD≤20%，允許有2個QC樣品超出各自的±20％822、質量控制82由于生物基質中存在內源性的該物質，難以測定方法的LOQ和準確度，此時可通過以下方法制備空白生物基質：1、對生物基質進行處理---活性炭濾過、透析2、使用不含內源性物質的生物基質—周期性變化的內源性物質如某些激素。3、使用替代基質—如兔血漿、人血清蛋白、緩沖液九、生物樣品測定中其它情況（一）作為外源性藥物使用的內源性物質的測定83由于生物基質中存在內源性的該物質，難以測定方法的LO出現(xiàn)以下情況時，分析方法需進行再評價或交互驗證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法－樣品的前處理方法改變后需要對效能指標進行重新考察2、改變生物基質不同物種的同種生物基質（大鼠血漿人血漿）、同一物種的不同生物基質（血漿血清）、甚至使用相同基質而使用不同抗凝劑等。（二）方法的再評價或交互驗證：84出現(xiàn)以下情況時，分析方法需進行再評價或交互驗證：（二）方法的（三）實際濃度超出標準曲線的處理：1、濃度高于定量上限－取樣品用空白基質稀釋，同時制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋后測定，以確認稀釋的有效性。2、濃度低于LOQ－增加生物樣品的體積，使測定液的濃度高于LOQ。應在相同條件下制備QC樣品和增加體積后的空白生物基質進行試驗，以確認方法的準確度、精密度和特異性符合要求。85（三）實際濃度超出標準曲線的處理：85第四節(jié)體內藥物分析方法

應用示例

第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究

一、文獻調研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。

86第四節(jié)體內藥物分析方法

應用示例 第三代喹諾酮藥動學參數(shù)吸收過程—空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%～70%Cmax—口服500mg后平均Cmax為2.4～2.6mg/LTmax—1～2hT1/2—血中T1/2約為4h，腎功能減退時稍有延長至6h蛋白結合率—20%～40%代謝—口服給藥24h內，40%～50%原形、15%代謝物經腎排出87藥動學參數(shù)吸收過程—空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為4體內分析方法

RP-HPLC 色譜柱—ODS色譜柱 流動相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液(三乙胺調節(jié)pH2.3～3.5)，或離子對色譜:溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨) 檢測—紫外或熒光檢測

生物樣品預處理 蛋白沉淀法—甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣 溶劑萃取法—二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑 蛋白沉淀-溶劑萃取—乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取

88體內分析方法 RP-HPLC88二、分析方法設計

1．分析方法 血漿蛋白結合率低(20%～40%)、以原形從腎排泄 生物等效性研究—測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法

2．檢測方法 紫外—靈敏度＜1ng，若取血漿0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，當Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時基本可滿足生物等效性研究要求

熒光—靈敏度＜0.1ng，能滿足本試驗要求

89二、分析方法設計 1．分析方法89

3．樣品制備方法 初步擬定—采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進樣分析 預試—含75%乙腈的提取液100l進樣后，色譜峰理論板數(shù)、對稱性下降(前沿峰)，進而導致檢測靈敏度降低(峰高降低) 經進一步試驗，確定為： 血漿0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-異丙醇(95:5)5ml萃取→60℃氮氣流吹干→流動相200l溶解→20l進樣 靈敏度可達2ng/ml(血漿濃度)，符合要求(Cmax＞2g/ml)

90 3．樣品制備方法90三、實驗方案

1．給藥方案 20名受試者隨機分為兩組，每組10人 第1次試驗—第一組口服受試制劑(相當于環(huán)丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑 第2次試驗—第1次服藥后第7天（有足夠長的清洗期）開始，兩組交換給藥91三、實驗方案 1．給藥方案91

2．血樣的采集與處理

分別口服給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(5～7個t1/2)小時 由肘正中靜脈取血4ml 立即移入經肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心15分鐘(3000rpm)，分離血漿，-20℃冰箱中保存待測92 2．血樣的采集與處理92

3．血樣分析法

色譜條件 —高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp泵，RF-530熒光檢測器)；色譜柱為KromasilODS-AP(200mm×4.6mm，5m) —流動相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min —激發(fā)波長為ex=277nm，發(fā)射em=445nm —柱溫為40℃。

93 3．血樣分析法93

3．血樣分析法 血漿樣品的預處理 取血漿0.5ml，加內標溶液(10g/ml諾氟沙星甲醇溶液）50l、乙腈1.0ml，渦旋混合30s，離心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-異丙醇(95:5)混合溶劑5ml，渦旋振蕩1min，離心5min，棄去上層水相，吸取下層有機相，60℃下氮氣流吹干，殘渣加流動相200l，渦旋溶解30s，離心5min，取上清液20l進樣94 3．血樣分析法94四、分析方法驗證

1．方法特異性

環(huán)丙沙星峰tR=12.4min，諾氟沙星(內標物質)tR=10.9min，各峰均獲得完全分離，內源性物質峰(與空白血漿樣品一致)tR=8.6min對測定無干擾。志愿者用藥后的血漿樣品色譜圖中環(huán)丙沙星與內標物質峰與模擬血漿樣品中環(huán)丙沙星與內標物質峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不認為代謝物有干擾95四、分析方法驗證 1．方法特異性95

2．標準曲線

標準系列溶液——取鹽酸環(huán)丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的標準系列溶液，冰箱保存 標準系列模擬血漿樣品——取空白血漿0.5ml，加環(huán)丙沙星標準系列溶液各50l，配制成相當于濃度為0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/ml的QC樣品，冰凍(-20℃) 測定法——取QC樣品，照“血漿樣品的預處理”項下方法操作，以環(huán)丙沙星濃度C為橫坐標，環(huán)丙沙星與內標物質的峰面積比值Y為縱坐標，用加權最小二乘法經Excel運算，求得的直線回歸方程為：Y=1.33·C-0.02583，R2=0.9951(C=0.1～5.0g/ml)96 2．標準曲線96

3．方法精密度與準確度

QC樣品—濃度為0.1、0.5和2.0g/ml 分析批次—3批，每批5樣品 測得濃度—0.0988、0.4537和2.128g/ml 準確度RE(%)—-1.2%、-9.3%和6.4% 精密度 批內(%)—6.7%、4.6%和3.9% 批間(%)—8.9%、9.6%和12.3%97 3．方法精密度與準確度97

4．方法定量限 受試制劑和參比制劑的Cmax分別為 —3.2020.496和3.3000.730g/ml 方法的LOQ為0.1g/ml＜0.16g/ml(Cmax的1/20) —準確度和精密度均符合要求：RE為-1.2% 日內RSD為6.7% 日間RSD為8.9%98 4．方法定量限98表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批內RSD（%）6.74.63.9批間RSD（%）8.99.612.3表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批內RSD（%）6.74.63.9批間RSD（%）8.99.612.3血漿冰凍血漿凍融殘渣冷藏室溫放置時間（d）As/Ai循環(huán)次As/Ai時間（d）As/Ai時間（h）As/Ai02.728604.359502.989203.4263102.911314.490212.978183.4350202.781924.313923.0595243.43515．樣品穩(wěn)定性99表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察 6．提取回收率

取空白血漿0.5ml，按“標準曲線”項下方法制備低、中、高三個濃度(分別為0.1，0.5，2.0g/ml)的QC樣品，并與相應濃度的未經處理的溶液比較，計算環(huán)丙沙星與內標物的提取回收率分別為： 0.1g/ml—67.7%(RSD為2.5%) 0.5g/ml—68.3%(RSD為4.2%) 2.0g/ml—67.4%(RSD為11.1%) 內標物—64.5%(RSD為4.8%)

均大于50%，且結果穩(wěn)定表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批內RSD（%）6.74.63.9批間RSD（%）8.99.612.3表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批內RSD（%）6.74.63.9批間RSD（%）8.99.612.3100 6．提取回收率表4-2血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準第四章

體內藥物分析

方法的建立與驗證101第四章體內藥物分析1第一節(jié)

分析方法的設計依據

在建立分析方法之前，應充分利用現(xiàn)代科技成就和前人的研究成果，系統(tǒng)檢索國內外的科技文獻，對藥物在生物體內的存在狀況、藥代動力學參數(shù)、分析檢測方法等相關資料加以分析和研究，以供借鑒。對于尚無文獻報道的藥物，亦可參考同類藥物的相關文獻。

檢索文獻，可在最短時間、最小的花費（磨刀不誤砍柴工）建立一個好的分析方法！這是試驗前要做的第一件事！大四的同學們，你們查過文獻嗎？102第一節(jié)分析方法的設計依據在建立分析方法之前，血藥濃度94-20085122篇103血藥濃度94-20085122篇3104410551992年創(chuàng)刊的《中國臨床藥學雜志》

2001年第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院主辦的《藥學服務與研究》兩刊于2004年同時成為中國科技核心期刊

臨床藥學專業(yè)性的學術期刊有：1061992年創(chuàng)刊的《中國臨床藥學雜志》臨床藥學專業(yè)性的學術期不想當將軍的士兵不是好士兵容量大的U盤：《中國臨床藥學雜志》、《藥學服務與研究》中大量的相關文獻拷貝下來另外以“臨床藥學”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學監(jiān)護”、“血藥濃度”等為關鍵詞，查找相關的文獻，copy!看文獻寫論文提職稱107不想當將軍的士兵不是好士兵容量大的U盤：這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告??！實驗一改進的柱前衍生-HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度由老師提供文獻?？赐晡墨I后，考慮一個問題：該如何設計、優(yōu)化實驗條件？實驗二姜黃素-PVP固體分散體在兔體內的藥代動力學參數(shù)的測定大家到圖書館電子閱覽室查閱文獻?。?！

關鍵詞：姜黃素，血藥濃度或：姜黃素，（藥代）動力學要看PDF文檔，電腦要安裝ADOBEREADER軟件108這門課有兩個實驗，要求大家以論文的形式寫實驗報告??！實驗一一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況準確測定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過一定的生物樣品預處理使待測物從結合物或綴合物中釋放出來。故此，應首先考慮樣品預處理方法 待測藥物的理化性質 藥物在生物體內的存在狀況 藥物在生物體內的生物轉化(代謝)途徑建立分析檢測方法的主要依據有：109一、待測藥物的理化性質及體內存在狀況準確測定生物(一)待測藥物的理化性質

藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等—決定預處理方法及萃取方法 具有親脂性—在適當?shù)膒H值下用溶劑萃取 具有強極性或親水性—沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等 具有揮發(fā)性—GC測定法 具有光譜或電化學特性—分析檢測方法 藥物的穩(wěn)定性—萃取濃縮技術 對酸堿不穩(wěn)定—避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩(wěn)定—避免高溫蒸發(fā)溶劑---一個例子110(一)待測藥物的理化性質 藥物的pKa值、親脂性、溶解另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥”---青蒿素

瘧疾是危害人類最大的疾病之一。全球每年瘧疾病人超過5億，死亡100萬人以上。屠呦呦：古醫(yī)書中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機溶劑提取物對瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫(yī)書：“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之?！焙椭兴幊Ｓ玫募灏痉ú煌?？原來里面用的是青蒿鮮汁！改用沸點較低的乙醚提取，抑制率達100%溫度！?。?！111另一個“兩彈一星”：拯救5億人的“中國神藥”---青蒿素(二)待測藥物的體內存在狀態(tài)與血漿蛋白結合的強弱及結合率的高低 —決定分離萃取方法指標：提取回收率

蛋白結合較強（非極性強）—不宜直接采用溶劑萃取？有機溶劑沒選對？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內濃度高低、代謝過程及其代謝產物

—決定分析檢測技術

濃度較低（尤其有代謝產物共存） —代謝產物的干擾與特定代謝產物的同時測定 —采用HPLC或LC-MS等分析檢測技術112(二)待測藥物的體內存在狀態(tài)與血漿蛋白結合的強弱及結合率的二、分析測定的目的與要求

體內藥物分析的目的—影響分析方法的應用

藥代動力學—研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄過程—血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產物

要求—同時測定原形藥物和代謝產物

檢測—寬線性范圍(Cmax～Cmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產物的分離)

方法—不必強調方法的簡便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術，如HPLC、LC-MS建立分析檢測方法的主要依據有：113二、分析測定的目的與要求 體內藥物分析的目的—影二、分析測定的目的與要求

臨床治療藥物監(jiān)測

藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近

方法—盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定，大多采用UV、RIA或EIA等。？

中毒患者的臨床搶救

藥物濃度極高

方法—不必強調方法的靈敏度，強調方法的特異性和分析速度 —大多采用色譜及其聯(lián)用技術GC、GC-MS、RIA或EIA？114二、分析測定的目的與要求 臨床治療藥物監(jiān)測14三、生物樣品的類型與預處理方法 生物樣品的類型與預處理方法—決定分析方法的應用

以血漿或血清為分析樣品

采用蛋白沉淀、溶劑萃取預處理技術 —分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測

用RIA分析？FPIA法 —樣品的預處理方法可較為粗放 —經過簡單的蛋白沉淀或不經任何預處理直接測定115三、生物樣品的類型與預處理方法 生物樣品的類型與預處理方法—四、實驗室條件 在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。此外，還應從方法的可行性、每個樣品測定耗時多少（10min）、操作的難易及技術要求及儀器、設備要求、費用多少等等方面加以考慮。116四、實驗室條件 在設計體內藥物分析方法時，還應充分考慮到

在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5ng/ml～1μg/ml，其檢測方法可采用HPLC法、LC-MS法和微生物法等數(shù)種方法。若用HPLC法來檢測該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對樣品進行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-MS法來檢測該樣品，則由于LC-MS儀器的靈敏度足以檢測濃度為1ng/ml以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來檢測該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。

例子1117在阿齊霉素制劑生物等效性研究過程中，血樣中阿齊

當然，用LC-MS法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血樣處理最好采用蛋白沉淀法。118當然，用LC-MS法來檢測阿齊霉素時，有些分析上作

蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩(wěn)定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優(yōu)于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。119蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀

如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-內酰胺類抗生素，對酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。----具體問題具體分析----信息，查文獻例子2120如果測定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為β-第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇二、分析方法的建立 (一)

檢測條件的篩選 (二)分離條件的篩選121第二節(jié)分析方法

建立的一般步驟一、分析方法的選擇一、分析方法的選擇

體內藥物分析方法的設計受多種因素影響 生物樣品中的藥物濃度—決定分析方法的首要要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產物的濃度低、樣品量少 —難以通過增加取樣量提高方法靈敏度 —通過選擇適當?shù)姆治龇椒ㄟm應樣品分析需求。常用分析方法的檢測限度及分離能力見表4-1122一、分析方法的選擇 體內藥物分析方法的設計受多種因素影響22摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則二○○五年三月SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜－質譜聯(lián)用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數(shù)藥物的檢測；（2）免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質多肽類物質檢測；（3）微生物學方法，可用于抗生素藥物的測定。從目前發(fā)展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LC－MS、GC－MS法，這類方法靈敏度、特異性、準確性一般都能適應臨床藥代動力學研究的需要，多數(shù)實驗室也具備條件，因此應用最廣，大約90%的藥物濃度測定可以用色譜法來完成。具體選用何種分析方法應根據藥物的化學結構、理化性質、儀器條件以及借鑒文獻方法多方面因素來考慮確定。123摘自:化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則（一）常用分析方二、分析方法的建立初步擬定分析方法后 進行一系列試驗工作，以選擇最佳分析條件

同時驗證分析方法的可行性，以確認是否適用于實際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選124二、分析方法的建立初步擬定分析方法后24(一)檢測條件的篩選

標準物質—照擬定的分析方法(不包括生物基質的預處理)測定—確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度

HPLC—調整檢測器(類型、條件