FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件

FDNB法測(cè)定氨基酸含量主講教師: 王英武電話: 5619955電子信箱: wyw@FDNB法測(cè)定氨基酸含量主講教師: 王英武實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜どV儀器的組成及原理了解色譜分離的原理.重點(diǎn)介紹反相色譜柱(以C18為例)定量分析的方法(外標(biāo)法)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)及氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜どV儀器的組成及原理2色譜儀器的組成及原理IHPLC組成

脫氣系統(tǒng)(在線與離線)氦氣脫氣真空脫氣超聲脫氣流動(dòng)相傳輸系統(tǒng)(色譜泵)一元二元三元四元多元評(píng)價(jià)指標(biāo):壓力限制,流速范圍及精度沖程大小等進(jìn)樣系統(tǒng)(手動(dòng)與自動(dòng)進(jìn)樣器)評(píng)價(jià)指標(biāo):精度重現(xiàn)性死體積速度可控性(溫度及各種其他功能)色譜儀器的組成及原理IHPLC組成3柱溫箱 功能:維持流動(dòng)相與固定相的溫度恒定 評(píng)價(jià)指標(biāo):溫度范圍升溫或降溫的速度溫度 維持的精度死體積大小檢測(cè)系統(tǒng) 紫外視差檢測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè) 熒光檢測(cè)DAD檢測(cè)蒸發(fā)光色散檢測(cè)等數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) 軟件的可操作性,采集速率,文件存儲(chǔ)能力色譜儀器的組成及原理II柱溫箱色譜儀器的組成及原理II4色譜分離的原理色譜分離的基本原理是不同化合物在色譜柱上的差速遷移導(dǎo)致的色譜分離分離方式多種多樣色譜分離的原理色譜分離的基本原理是不同化合物在色譜柱上的差速5min00.511.522.53mAU0204060801.939

分流對(duì)紫外檢測(cè)的影響min00.511.522.53mAU020406086黃色 0.5mL/min白色 1.0mL/min紅色 2.0mL/minmin0123456789mAU-20020406080100120140Area:2028High:1427.65

3.911.94Area:1021High:110Area:544High:85流速對(duì)保留時(shí)間及峰面積的影響黃色 0.5mL/minmin0123456789mA7有機(jī)相比例對(duì)出峰時(shí)間和峰面積的影響

有機(jī)相比例對(duì)出峰時(shí)間和峰面積的影響

8HPLC條件的優(yōu)化洗脫方式一般采取等梯度洗脫，這樣分析速度快但有時(shí)也會(huì)采取梯度洗脫如分析多肽類化合物一般采取梯度洗脫，此時(shí)的信號(hào)會(huì)比等梯度洗脫時(shí)強(qiáng)很多，而且可以加大進(jìn)樣量。是提高靈敏度的一種措施，但是分析時(shí)間較長(zhǎng)。需要有平衡的時(shí)間。HPLC條件的優(yōu)化洗脫方式90500100015002000250030003500400045000123456time(min)peakheight梯度洗脫05001000150020002500300035004010HPLC條件的優(yōu)化柱溫對(duì)色譜行為的影響依那普利HPLC條件的優(yōu)化柱溫對(duì)色譜行為的影響11色譜柱色譜柱的規(guī)格填料顆粒粒徑孔徑廠商流動(dòng)相組成洗脫方式柱溫檢測(cè)方式及具體條件流動(dòng)相的組成對(duì)分離度的影響流速對(duì)色譜行為的影響柱溫對(duì)色譜行為的影響溶劑對(duì)色譜的影響pH值離子強(qiáng)度緩沖液離子對(duì)等其他因素的影響色譜柱色譜柱的規(guī)格填料顆粒粒徑孔徑廠商12FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件13FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件14FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件15定量分析的方法(外標(biāo)法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(外標(biāo)法)16定量分析的方法(內(nèi)標(biāo)法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(內(nèi)標(biāo)法)17

氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)FDNB法的原理2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger試劑。DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）

氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)FDNB法的原理181儀器：四元泵waters；柱溫箱無(wú)；紫外可變雙波長(zhǎng)檢測(cè)器2487;手動(dòng)進(jìn)樣器;Millennia工作站色譜柱：ZorbaxExclipseXDB1504.6mm5mm一儀器與試劑1儀器：四元泵waters；一儀器與試劑19儀器與試劑保護(hù)柱： XDBC184.6x12.5mm GuardfittingKit化學(xué)試劑：氨基酸標(biāo)樣250，500，1000pmol/mL

1%FDBN（大連化物所可購(gòu)） 磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉，氫氧化鉀， 乙腈，重蒸水輔助品： 2mL棕色小瓶，pH試紙，恒溫水浴箱， 溶劑過(guò)濾器，樣品過(guò)濾器， 可變量程微量移液器(10-00mL)。儀器與試劑保護(hù)柱： XDBC184.6x12.5mm20二實(shí)驗(yàn)步驟

衍生化：于2mL棕色瓶里精確加入30mL不同濃度的AA標(biāo)樣，30mL0.5NNaHCO3(pH=9)和1%FDBN10mL，于60C暗處加熱60min。放置室溫，加1mL（0.01N,pH=7.0）KH2PO4，搖勻，待HPLC分析。HPLC條件：流動(dòng)相A：0.04NKH2PO4pH=7.2

流動(dòng)相B：乙腈/水=55/45(v/v)梯度：B：14%4min---10min/40%----20min/80%---21min,100%,流速：1mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；柱溫：40C；進(jìn)樣量：10mL二實(shí)驗(yàn)步驟衍生化：21二實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，求算未知樣品濃度完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題為什么要保持反應(yīng)溶液的堿性環(huán)境為什么要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化處理保護(hù)柱的作用是什么反相色譜分離的原理是什么實(shí)驗(yàn)中有哪些注意事項(xiàng)二實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，求算未知樣品濃度22min0510152025mAU020406080ASPGLUDNP-OHSERHISARGGLYTHRPROALAVALMETCYS-SIIELEUPHELYSTYR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

min0510152025mAU020406080A23FDNB法測(cè)定氨基酸含量主講教師: 王英武電話: 5619955電子信箱: wyw@FDNB法測(cè)定氨基酸含量主講教師: 王英武實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜どV儀器的組成及原理了解色譜分離的原理.重點(diǎn)介紹反相色譜柱(以C18為例)定量分析的方法(外標(biāo)法)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)及氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜どV儀器的組成及原理25色譜儀器的組成及原理IHPLC組成

脫氣系統(tǒng)(在線與離線)氦氣脫氣真空脫氣超聲脫氣流動(dòng)相傳輸系統(tǒng)(色譜泵)一元二元三元四元多元評(píng)價(jià)指標(biāo):壓力限制,流速范圍及精度沖程大小等進(jìn)樣系統(tǒng)(手動(dòng)與自動(dòng)進(jìn)樣器)評(píng)價(jià)指標(biāo):精度重現(xiàn)性死體積速度可控性(溫度及各種其他功能)色譜儀器的組成及原理IHPLC組成26柱溫箱 功能:維持流動(dòng)相與固定相的溫度恒定 評(píng)價(jià)指標(biāo):溫度范圍升溫或降溫的速度溫度 維持的精度死體積大小檢測(cè)系統(tǒng) 紫外視差檢測(cè)質(zhì)譜檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè) 熒光檢測(cè)DAD檢測(cè)蒸發(fā)光色散檢測(cè)等數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) 軟件的可操作性,采集速率,文件存儲(chǔ)能力色譜儀器的組成及原理II柱溫箱色譜儀器的組成及原理II27色譜分離的原理色譜分離的基本原理是不同化合物在色譜柱上的差速遷移導(dǎo)致的色譜分離分離方式多種多樣色譜分離的原理色譜分離的基本原理是不同化合物在色譜柱上的差速28min00.511.522.53mAU0204060801.939

分流對(duì)紫外檢測(cè)的影響min00.511.522.53mAU0204060829黃色 0.5mL/min白色 1.0mL/min紅色 2.0mL/minmin0123456789mAU-20020406080100120140Area:2028High:1427.65

3.911.94Area:1021High:110Area:544High:85流速對(duì)保留時(shí)間及峰面積的影響黃色 0.5mL/minmin0123456789mA30有機(jī)相比例對(duì)出峰時(shí)間和峰面積的影響

有機(jī)相比例對(duì)出峰時(shí)間和峰面積的影響

31HPLC條件的優(yōu)化洗脫方式一般采取等梯度洗脫，這樣分析速度快但有時(shí)也會(huì)采取梯度洗脫如分析多肽類化合物一般采取梯度洗脫，此時(shí)的信號(hào)會(huì)比等梯度洗脫時(shí)強(qiáng)很多，而且可以加大進(jìn)樣量。是提高靈敏度的一種措施，但是分析時(shí)間較長(zhǎng)。需要有平衡的時(shí)間。HPLC條件的優(yōu)化洗脫方式320500100015002000250030003500400045000123456time(min)peakheight梯度洗脫05001000150020002500300035004033HPLC條件的優(yōu)化柱溫對(duì)色譜行為的影響依那普利HPLC條件的優(yōu)化柱溫對(duì)色譜行為的影響34色譜柱色譜柱的規(guī)格填料顆粒粒徑孔徑廠商流動(dòng)相組成洗脫方式柱溫檢測(cè)方式及具體條件流動(dòng)相的組成對(duì)分離度的影響流速對(duì)色譜行為的影響柱溫對(duì)色譜行為的影響溶劑對(duì)色譜的影響pH值離子強(qiáng)度緩沖液離子對(duì)等其他因素的影響色譜柱色譜柱的規(guī)格填料顆粒粒徑孔徑廠商35FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件36FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件37FDNB法測(cè)定氨基酸含量課件38定量分析的方法(外標(biāo)法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(外標(biāo)法)39定量分析的方法(內(nèi)標(biāo)法)2.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)定量分析的方法(內(nèi)標(biāo)法)40

氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)FDNB法的原理2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）也叫做Sanger試劑。DNFB在弱堿性溶液中與氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，生成黃色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitrophenylaminoacid,DNP氨基酸）

氨基酸衍生化實(shí)驗(yàn)(FDNB法)FDNB法的原理411儀器：四元泵waters；柱溫箱無(wú)；紫外可變雙波長(zhǎng)檢測(cè)器2487;手動(dòng)進(jìn)樣器;Millennia工作站色譜柱：ZorbaxExclipseXDB1504.6mm5mm一儀器與試劑1儀器：四元泵waters；一儀器與試劑42儀器與試劑保護(hù)柱： XDBC184.6x12.5mm GuardfittingKit化學(xué)試劑：氨基酸標(biāo)樣250，500，1000pmol/mL

1%FDBN（大連化物所可購(gòu)） 磷酸二氫鉀，碳酸氫鈉，氫氧化鉀， 乙腈，重蒸水輔助品： 2mL棕色小瓶，pH試紙，恒溫水浴箱， 溶劑過(guò)濾器，樣品過(guò)濾器， 可變量程微量移液器(10-00mL)。儀器與試劑保護(hù)柱： XDBC184.6x12.5mm43二實(shí)驗(yàn)步驟

衍生化：于2mL棕色瓶里精確加入30mL不同濃度的AA標(biāo)樣，30mL0