微生物測(cè)定方法

關(guān)于微生物測(cè)定方法第一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日Part1寫(xiě)下大標(biāo)題第二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日我所在課題組主要研究方向是：

景觀水體富營(yíng)養(yǎng)化治理及水體修復(fù)與凈化技術(shù)故所關(guān)注的微生物主要與引起富營(yíng)養(yǎng)化的藻類(lèi)有關(guān)：主要研究的藻類(lèi)有：銅綠微囊藻、小球藻、偽魚(yú)腥藻、水華魚(yú)腥藻等。下面我就其中的來(lái)做一些說(shuō)明介紹。水華魚(yú)腥藻第三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日水華魚(yú)腥藻的圖片第四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

水華魚(yú)腥藻界門(mén)綱目科屬種植物界Alage

藍(lán)藻門(mén)Cyanophyta

藍(lán)藻綱Cyanophyceae

念珠藻目Nostocales

念珠藻科Nostocales

魚(yú)腥藻屬Anabaena

水華魚(yú)腥藻

Anabaenaaquae第五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日藍(lán)藻門(mén)藍(lán)藻細(xì)胞無(wú)色素體和真正的細(xì)胞核等細(xì)胞器，繁殖方式常為細(xì)胞分裂。常生長(zhǎng)在各種水體或潮濕土壤、巖石、樹(shù)干及樹(shù)葉上，不少種類(lèi)能在干旱的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。水生類(lèi)群常在含氮較高，有機(jī)質(zhì)豐富的堿水體中生長(zhǎng)。藍(lán)藻能進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)型微生物，其大量生長(zhǎng)可改變水體的理化環(huán)境，產(chǎn)生各種有害代謝產(chǎn)物，如毒素和異味物質(zhì)，給公眾健康帶來(lái)極大隱患，同時(shí)藍(lán)藻水華也給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、供水及旅游業(yè)帶來(lái)極大的危害。

第六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日魚(yú)腥藻屬植物體為單一絲體，或不定型膠質(zhì)塊，或柔軟膜塊；藻絲等寬或末端尖、直或不規(guī)則的螺旋狀彎曲；細(xì)胞球形，筒形；異形胞常為間位；孢子1個(gè)或幾個(gè)成串，緊靠異形胞或位于異形胞之間。水華魚(yú)腥藻

水華魚(yú)腥藻在國(guó)內(nèi)外發(fā)生的藍(lán)藻水華中經(jīng)常有報(bào)道。這是一種具有異形胞的絲狀體藍(lán)藻，一般不能作為魚(yú)類(lèi)餌料，有固氮的功能。在春末、夏初、初秋時(shí)，此類(lèi)藻常在湖沼、池塘大量繁殖，造成“水華”，引起水質(zhì)變臭，并且可產(chǎn)生藻毒素，對(duì)水生生物有毒害作用，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)。故可作為水體發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化的指標(biāo)，研究其生長(zhǎng)特征、生態(tài)生理功能及其環(huán)境效應(yīng)對(duì)解決水體富營(yíng)養(yǎng)化有重要意義！第七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日Part2寫(xiě)下大標(biāo)題第八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類(lèi)，由于多數(shù)微生物的個(gè)體較小，肉眼無(wú)法觀察，對(duì)其計(jì)數(shù)一般比較困難。此外，不同環(huán)境介質(zhì)中的微生物種類(lèi)和特點(diǎn)，以及所處的環(huán)境條件不同，那么所采取的微生物數(shù)量測(cè)定方法也有所差異。對(duì)微生物計(jì)數(shù)的方法主要有三大類(lèi)：總細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法和微生物生長(zhǎng)量測(cè)定法。一、方法概述總細(xì)胞計(jì)數(shù)法活細(xì)胞計(jì)數(shù)法

微生物生長(zhǎng)量計(jì)數(shù)法第九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）平板菌落計(jì)數(shù)法（2）比濁法（3）霉菌計(jì)數(shù)法3.1凱氏定氮計(jì)數(shù)法3.2DNA含量測(cè)定法

總細(xì)胞計(jì)數(shù)法

活細(xì)胞計(jì)數(shù)法

微生物生長(zhǎng)量計(jì)數(shù)法（1）血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（2）細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（3）膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法第十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日各方法的比較總結(jié)：第十一頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)菌計(jì)數(shù)板：常用于測(cè)定單細(xì)胞或孢子,相對(duì)比較準(zhǔn)確；顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：不辨死活；膜過(guò)濾：用于測(cè)定細(xì)胞濃度很低的樣品,平板菌落計(jì)數(shù)：形成菌落的微生物，對(duì)多數(shù)微生物的測(cè)定都適用,相對(duì)復(fù)雜；比濁法：相對(duì)準(zhǔn)確,但需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，不用于顏色太深的樣品；凱氏定氮法和DNA含量測(cè)定法：對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)含量相對(duì)穩(wěn)定的物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定,再算出細(xì)胞的數(shù)量,操作相對(duì)復(fù)雜。測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量：適于濃度較高的樣品各方法的比較總結(jié)：第十二頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日（一）空氣中

空氣中沒(méi)有可為微生物直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和足夠的水分，它不是微生物生長(zhǎng)繁殖的天然環(huán)境，因此空氣中沒(méi)有固定的微生物種類(lèi)。它主要通過(guò)土壤塵埃、小水滴、人和動(dòng)物體表的干燥脫落物、呼吸道的排泄物等方式被帶入空氣。由于微生物能產(chǎn)生各種休眠體，故可在空氣中存活相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期而不至死亡?？諝庵形⑸锏姆N類(lèi)，主要為真菌和細(xì)菌。其數(shù)量則取決于所處的環(huán)境和飛揚(yáng)的塵埃量。適用于空氣中微生物數(shù)量測(cè)定方法主要有：1.自然沉降法（沉降平板法）2.撞擊法

3.過(guò)濾法

4.液體撞擊法

二、空氣中微生物數(shù)量測(cè)定方法第十三頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

：1.自然沉降法（沉降平板法）根據(jù)空氣中攜有微生物氣溶膠粒子在地心引力作用下，以垂直的自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24h,37℃溫箱培養(yǎng)計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)奧梅梁斯基建議，面積為100cm2的平板培養(yǎng)基，暴露于空氣中5min,于37℃溫箱培養(yǎng)24h后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)相當(dāng)于10L空氣中的細(xì)菌數(shù)?？諝庵械募?xì)菌數(shù)（cfu/m3）=1000×{（100/A）×(5/t)×(1/10)}×N=50000N/(A×T)A----平板面積cm2；T----暴露時(shí)間min；N----平均菌落數(shù)(cfu/皿)

特點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便，但穩(wěn)定性差，直徑1~5um的粒子在5min內(nèi)沉降距離有限，使小粒子采集效率低。

二、空氣中微生物數(shù)量測(cè)定方法舉例第十四頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

2.撞擊法Anderson采樣器原理：多級(jí)篩孔型采樣器由6個(gè)帶有微細(xì)針孔的金屬撞擊盤(pán)構(gòu)成，盤(pán)下放置有培養(yǎng)基的平皿，每個(gè)圓盤(pán)上有400個(gè)環(huán)形排列小孔，由上到下孔徑逐漸減小。氣流從頂罩進(jìn)第一級(jí)，較小的粒子會(huì)由于動(dòng)量不足隨氣流繞過(guò)平皿進(jìn)入下一級(jí)。經(jīng)6次撞擊后，可把絕大部分的微生物采集下?？諝夂?cfu/m3)=【六級(jí)采樣板的總菌數(shù)(cfu)÷28.3(L/min)×采樣時(shí)間(min)】×1000

：a.采集粒譜范圍廣，一般在0.2~20um以上；

b.采集效率高，逃逸少；

c.微生物存活率高。

二、空氣中微生物數(shù)量測(cè)定方法特點(diǎn)第十五頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

3.過(guò)濾法使一定量的空氣通過(guò)吸附劑（滅菌生理鹽水），然后培養(yǎng)吸附劑中的細(xì)菌，計(jì)算出菌落數(shù)。

4.液體撞擊法和固體撞擊式采樣器一樣，是利用噴射氣流方式將空氣中的微生物粒子采集到小體積液體中，適用于高濃度的空氣微生物采樣。

二、空氣中微生物數(shù)量測(cè)定方法第十六頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

（二）水樣中：

適用于水樣中微生物數(shù)量測(cè)定方法有：

三、水樣中微生物數(shù)量測(cè)定方法水樣中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定水中細(xì)菌活菌數(shù)測(cè)定分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌數(shù)量1.直接計(jì)數(shù)法２.染色涂片計(jì)數(shù)法3.比濁度法

1.平板菌落計(jì)數(shù)法

2.液體稀釋法

3.濾膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法應(yīng)用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)定（標(biāo)準(zhǔn)曲線）第十七頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

標(biāo)準(zhǔn)平皿法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)（1）采集水樣；（2）取10ml注入90ml無(wú)菌水的三角瓶中，混勻成10-1稀釋液，注意吸水樣前，水樣及稀釋水應(yīng)混合均勻；（3）吸取稀釋液1ml按10倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4等系列的稀釋度；(4)根據(jù)水樣潔凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4三個(gè)連續(xù)稀釋度，中等的選取10-1、10-2、10-3稀釋度。稀釋度的選擇是關(guān)鍵，選擇適宜，平皿上菌落總數(shù)介于30到300間；（5）吸取由高倍到低倍的稀釋液，每個(gè)稀釋液分別注入兩個(gè)培養(yǎng)皿，每皿1ml;(6)注入徹底融化且冷卻到45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml,立即旋搖培養(yǎng)皿，充分混勻。讓平皿培養(yǎng)基于水平位置至固化；（7）接種河水水樣的培養(yǎng)皿，倒置于37℃培養(yǎng)24h。接種海水水樣的培養(yǎng)皿則置于18~20℃培養(yǎng)5d(長(zhǎng)出明顯菌落)；(8)根據(jù)菌落計(jì)算原則和方法計(jì)算。

三、水中微生物數(shù)量測(cè)定方法舉例第十八頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

（三）土壤中：

土壤是最復(fù)雜、最豐富的微生物基因庫(kù)，所含微生物不僅數(shù)量巨大，而且各類(lèi)繁多，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌三大類(lèi)，是土壤最活躍的成分。適于土壤微生物數(shù)量測(cè)定方法可分為三大類(lèi)：

四、土壤中微生物數(shù)量測(cè)定方法將土壤微生物染色后，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，稱為直接鏡檢法，包括:a.涂片法、b.瓊脂薄片法c.膜過(guò)濾法根據(jù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)來(lái)計(jì)算土壤微生物數(shù)量，統(tǒng)稱為培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，主要有：a.稀釋平板法、b.最大或然計(jì)數(shù)法①②③直接將微生物從土壤中分離和提取出來(lái)后再進(jìn)行測(cè)定，主要有離心分離法。第十九頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

1.稀釋平板法測(cè)定土壤中微生物數(shù)量（1）土壤系列稀釋液制備

：取新鮮土壤（＜2㎜）10.00g，放入裝有70ml水的廣口瓶中，在振蕩機(jī)上振蕩10min。迅速吸取10ml，放入滅菌的裝有90ml水的廣口瓶中，混合均勻。如此依次配制一系列土壤稀釋液。上述操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以避免污染。（2）平板制備和培養(yǎng)

：

從兩個(gè)稀釋倍數(shù)的土壤稀釋液中吸取1.00ml，分別放入五套培養(yǎng)皿中；再向培養(yǎng)皿內(nèi)注入45～50℃的培養(yǎng)基10ml，立即混合均勻，靜置凝固后，倒置放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌和放線菌在28℃下培養(yǎng)7～10d，真菌在25℃下培養(yǎng)3～5d。（3）鏡檢計(jì)數(shù)

：用顯微鏡觀察，明顯有菌絲的一般是真菌，絲狀分枝，比較粗大；而放線菌菌絲呈放射狀，較細(xì)。細(xì)菌有球狀和桿狀，酵母菌個(gè)體比較大，一般有圓形、橢圓形、卵形、檸檬形或黃瓜形，有些還有瘤狀芽。

在兩級(jí)稀釋度中，選細(xì)菌和放線菌菌落數(shù)為30～200個(gè)、真菌菌落數(shù)為20～40個(gè)的培養(yǎng)皿各5個(gè)，取其平均值計(jì)算出每組的菌落數(shù)。如果菌落很多，可將其分成2～4等份進(jìn)行計(jì)數(shù)。微生物生物量可以通過(guò)微生物細(xì)胞個(gè)體大小和密度計(jì)算得到。4）計(jì)算

：土壤微生物數(shù)量（cfu/g）=MD/W

式中:M為菌落平均數(shù)：D為稀釋倍數(shù)；W為土壤烘干質(zhì)量（g）。

四、土壤中微生物數(shù)量測(cè)定方法舉例第二十頁(yè)，共二十二頁(yè)，2022年，8月28日

2.FDA染色涂片法測(cè)定土壤中活菌絲數(shù)（1）土壤分散

取10.00g新鮮土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95

ml

0.06

mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液，充分振蕩15

min。

（2）染色

取1

ml

土壤