第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件

G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展Gprotein-coupledreceptor,GPCRG蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展Gprotein-coupledr1GPCRG蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupledreceptor,GPCR),是人體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)家族,迄今已報(bào)道了近2000種不同的GPCRs。GPCRs因能結(jié)合和調(diào)節(jié)G蛋白活性而得名。GPCRs的配體多種多樣,包括生物胺、肽類(lèi)、糖蛋白、脂類(lèi)、核苷酸、離子和蛋白酶等。各種光、嗅、味的信號(hào)分子也由GPCRs介導(dǎo)。大多數(shù)GPCRs通過(guò)G蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,例如,刺激或抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)和活化磷脂酶的活性,調(diào)節(jié)鉀及鈣離子通道的活性。有些GPCRs通過(guò)酪氨酸激酶、Src、Stat3途經(jīng)傳遞信息,與細(xì)胞增值、細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。GPCRG蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupled2人類(lèi)基因組測(cè)序表明,約有720個(gè)基因參與了GPCR的合成。GPCR功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生,如阿爾茨海默氏癥(alzheimers)、帕金森癥(Parkinsondisease)、侏儒癥(midgetism)、色盲癥(acritochronacy)以及哮喘(asthma)等。接近50%的藥物是用GPCR作為它們的靶標(biāo)。對(duì)于GPCR的研究具有極其重要的意義。人類(lèi)基因組測(cè)序表明,約有720個(gè)基因參與了GPCR的合成。3

GPCR的結(jié)構(gòu)GPCR的肽鏈N末端,7個(gè)跨膜α螺旋(TM1→TM7)。C末端,3個(gè)胞外環(huán)(ECL1→ECL3)及3~4個(gè)胞內(nèi)環(huán)(ICL1→ICL4)組成。N端在胞外,常常被糖基化。C端在胞內(nèi),多表現(xiàn)為磷酸化。7個(gè)跨膜的α螺旋反復(fù)穿過(guò)細(xì)胞膜的脂雙層。不同GPCR跨膜螺旋區(qū)的氨基酸比較保守,而C/N末端和回環(huán)區(qū)的氨基酸差異較大。GPCR的結(jié)構(gòu)GPCR的肽鏈4牛視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的模式圖胞外側(cè)胞內(nèi)側(cè)ECLICLTM1TM7牛視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的模式圖胞外側(cè)胞內(nèi)側(cè)ECLICLTM1TM75目前只有一種GPCR蛋白—牛視紫紅質(zhì)(bovinerhodopsin)的晶體三維結(jié)構(gòu)被構(gòu)建。細(xì)胞質(zhì)的末端區(qū)域通常被疏水殘基所環(huán)繞,它們一同形成了G蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。牛視紫質(zhì)受體在C末端有一段短的α螺旋,并與膜平行,稱(chēng)之為T(mén)M8,可能對(duì)于受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著重要的作用。一些亞家族受體間存在著一些相似的結(jié)構(gòu),如幾乎所有GPCR都具有二硫鍵等。目前只有一種GPCR蛋白—牛視紫紅質(zhì)(bovinerhod6GPCR分類(lèi)A族，又稱(chēng)為視紫紅質(zhì)(rhodopsin)/β2腎上腺素受體族，分為6個(gè)亞族:①生物胺受體;②膽囊收縮肽、內(nèi)皮素、速激肽、神經(jīng)肽Y等;③非脊椎動(dòng)物的視蛋白和緩激肽受體;④腺嘌呤、大麻類(lèi)、黑皮素及嗅覺(jué)受體;⑤趨化因子、互補(bǔ)因子、促性腺激素釋放激素(GnRH)等;⑥褪黑激素受體及其它。GPCR分類(lèi)A族，又稱(chēng)為視紫紅質(zhì)(rhodopsin)/β7B族,又稱(chēng)為胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族,分為4個(gè)亞族:①降鈣素和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體;②甲狀旁腺激素受體;③胰高血糖素、類(lèi)胰高血糖素肽、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽、血管活性腸肽和分泌素受體;④Latrotoxin受體。B族,又稱(chēng)為胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族,8C族,又稱(chēng)為神經(jīng)遞質(zhì)/鈣受體樣受體族,分為5個(gè)亞族:①谷氨酸受體;②γ-氨基丁酸(GABA)受體;③鈣受體;④鼻神經(jīng)外激素受體;⑤味覺(jué)受體。C族,又稱(chēng)為神經(jīng)遞質(zhì)/鈣受體樣受體族,分為5個(gè)亞族:9D族—真菌信息素(fungalpheromone)受體E族—cAMP受體(cAMPreceptor)D族—真菌信息素(fungalpheromone)受體10第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件11在GPCR家族中,A族受體數(shù)目最多。A族受體共有二十多個(gè)高度保守位點(diǎn)。A族的12個(gè)高度保守位點(diǎn)功能見(jiàn)表。B族受體的N末端較長(zhǎng)且較保守,主要結(jié)合一些大的配基,如胰高血糖素、分泌素等。C族受體的N未端(大約600個(gè)氨基酸)和C未端都很長(zhǎng),在C-Ⅰ與C-Ⅱ間也由兩個(gè)Cys形成二硫鍵,C-Ⅲ環(huán)短并且高度保守。在GPCR家族中,A族受體數(shù)目最多。12第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件13配體結(jié)合域A族受體的配體結(jié)合域一類(lèi)是小分子配體,小分子配體結(jié)合在受體跨膜α螺旋形成的結(jié)合裂隙中。經(jīng)典的小分子配體有腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、組胺(His)、乙酰膽堿(Ach)、前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)和嘌呤(purine)等。另一類(lèi)是大分子肽類(lèi)配體,肽類(lèi)配體主要結(jié)合在受體的胞外結(jié)構(gòu)域。P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B、血管緊張素、神經(jīng)肽Y、白介素8,抗利尿激素等肽類(lèi)配體。配體結(jié)合域A族受體的配體結(jié)合域14B族受體的配體結(jié)合域與A族的肽類(lèi)配體類(lèi)似,B族受體的肽類(lèi)配體結(jié)合部位主要位于受體的胞外結(jié)構(gòu)域。B族受體的N末端在大多數(shù)配體與受體的結(jié)合中起關(guān)鍵作用。例如分泌素、血管腸肽、胰高血糖素等肽類(lèi)配體,它們不僅與受體的N末端結(jié)合,而且與受體的ECL相互作用。B族受體的配體結(jié)合域15C族受體的配體結(jié)合域C族受體的配體主要有谷氨酸、GABA和Ca2+。這些配體雖然分子小,但是其與A族小分子配體在受體上的結(jié)合部位不同,均位于受體胞外的N末端。C族受體的配體結(jié)合域16第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件17GPCRs活化的分子機(jī)制1.分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處于靜止構(gòu)象在沒(méi)有激動(dòng)劑時(shí),分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處于靜止(非活性)構(gòu)象,當(dāng)受體與激動(dòng)劑結(jié)合或受體發(fā)生突變時(shí),破壞了受體分子內(nèi)相互作用力,使受體的關(guān)鍵序列暴露給G蛋白,從而活化G蛋白。可以認(rèn)為,分子內(nèi)相互作用力遭到破壞是GPCRs活化機(jī)制之一。使受體易于在活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變。2.質(zhì)子化是GPCRs活化的關(guān)鍵A族受體ICL2上有一保守的DRY(Glu/Asp-Arg-Tyr)基序,許多實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)受體活化時(shí),其Glu/Asp發(fā)生質(zhì)子化。GPCRs活化的分子機(jī)制1.分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處183.GPCRs活化中的構(gòu)象變化GPCRs活化中的構(gòu)象變化,研究的最多的是視紫紅質(zhì)。多種光譜技術(shù)的研究結(jié)果表明,在視紫紅質(zhì)活化為變視紫紅質(zhì)Ⅱ的過(guò)程中,發(fā)生了構(gòu)象重排。4.GPCR與G蛋白偶聯(lián)信號(hào)從活化受體傳遞給G蛋白的機(jī)理還不清楚。實(shí)驗(yàn)證實(shí),GPCRs的ICL2和ICL3在與G蛋白偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用。其中ICL3決定偶聯(lián)G蛋白α亞基的特異性,ICL2決定G蛋白的活化。3.GPCRs活化中的構(gòu)象變化195.受體二聚化研究表明,許多GPCRs,包括視紫紅質(zhì)、分泌素、谷氨酸受體等能形成二聚體。激動(dòng)劑有時(shí)能提高受體二聚體的水平,有時(shí)卻降低或不改變受體二聚體的水平。受體二聚化的作用還不清楚,可能與受體個(gè)體發(fā)育和受體功能的多樣性有關(guān)。5.受體二聚化20①GPCRs雙聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

盡管GPCRs在分子結(jié)構(gòu)上都有七個(gè)跨膜區(qū),但不同的GPCRs在細(xì)胞膜內(nèi)外的結(jié)構(gòu)卻有較大的差別,因此分子內(nèi)部發(fā)生雙聚化的區(qū)域、方式也不盡相同。有的GPCRs雙聚化依靠二硫鍵,還原劑可以減弱或消除雙聚體形成;另一些則可能通過(guò)分子間的疏水鍵相互作用形成雙聚體,可被SDS(二烷基硫酸鈉)解聚。GPCRs的雙聚化可發(fā)生在胞外的N端、跨膜區(qū)、胞內(nèi)環(huán)、胞外環(huán)以及胞內(nèi)的C末端。①GPCRs雙聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)21例如mGluR5含19個(gè)Cys的胞外N端,其中9個(gè)在近膜區(qū),其雙聚化可以被還原劑DTT完全消除,表明二硫鍵在形成雙聚化中起關(guān)鍵作用,用胰蛋白酶水解除去受體胞外N端后,則不再發(fā)生雙聚化,這表明mGluR5雙聚化在胞外N端。類(lèi)似的受體還有GluRlα和CaR。阿片受體有彼此同源性較高的DOR、κ受體(KOR)、μ受體(MOR)三種亞型。例如22②GPCRs雙聚化對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

GABABR屬于GPCRs。GABABR又包括GBR1和GBR2兩種亞型。GBR1＋GBR2→表達(dá)→功能受體間相互作用可促進(jìn)受體蛋白合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位,也解釋了體外單獨(dú)表達(dá)的GBR1不具有天然組織受體功能的分子機(jī)制。在功能方面,單獨(dú)表達(dá)兩受體,激動(dòng)劑引起的AC抑制、35s-GTP-s結(jié)合、GIRK的激活等幾乎不能發(fā)生,而共表達(dá)后上述功能明顯增強(qiáng)。用免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)兩受體可通過(guò)C末端形成雙聚體.可見(jiàn),GBR1在膜上的定位及發(fā)揮功能依賴(lài)于和GBR2形成雙聚體。②GPCRs雙聚化對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響23受體的雙聚化有病理和藥理學(xué)方面的意義抗CCR5N端的抗體在體外培養(yǎng)細(xì)胞和小鼠體內(nèi)顯示出較強(qiáng)的抑制HIV-1復(fù)制的作用,而抗體與激動(dòng)劑均可誘導(dǎo)CCR5雙聚體的形成,而針對(duì)受體其它部位的抗體不能導(dǎo)致受體雙聚化,也不能抑制HIV-1的感染。因此提示,誘導(dǎo)CCR5的雙聚化可以阻斷HIV-1通過(guò)CCR5引起的感染。受體的雙聚化有病理和藥理學(xué)方面的意義246.GPCRs的失敏及內(nèi)吞作用絕大多數(shù)與G蛋白相偶聯(lián)的受體在激動(dòng)劑的長(zhǎng)期或反復(fù)刺激下都會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性降低的現(xiàn)象稱(chēng)為失敏(desensitization)。受體失敏作用隨著激動(dòng)劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)經(jīng)歷不同的變化過(guò)程。在激動(dòng)劑刺激后幾秒至幾小時(shí)內(nèi),受體對(duì)刺激的反應(yīng)性降低,但細(xì)胞膜表面的受體數(shù)量并未減少;如果這種作用持續(xù)存在,會(huì)引起膜表面受體數(shù)量降低,即發(fā)生內(nèi)吞(internalization);甚至進(jìn)一步發(fā)生不可逆的降解,從而引起受體下調(diào)(down-regulation).6.GPCRs的失敏及內(nèi)吞作用25大多數(shù)的GPCRs激活后,在第二信使激酶或G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用下發(fā)生快速磷酸化;受體的磷酸化提高了其對(duì)arrestin(阻礙蛋白)的親和力,兩者形成復(fù)合體并促使受體與G蛋白解偶聯(lián);進(jìn)而此復(fù)合體與籠形蛋白衣被小泡結(jié)合并在dynamin(發(fā)動(dòng)蛋白)的調(diào)解作用下發(fā)生內(nèi)吞,并隱沒(méi)(sequestration)于胞內(nèi)。內(nèi)吞后的受體可能發(fā)生兩種變化:一是在衣被小泡內(nèi)發(fā)生去磷酸化,通過(guò)再循環(huán)回到胞膜表面,完成復(fù)敏(resensitization);二是受體被降解,發(fā)生下調(diào)。但是有些受體在此過(guò)程中并不需要arrestin和dynamin的介導(dǎo),如血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)受體。大多數(shù)的GPCRs激活后,在第二信使激酶或G蛋白偶聯(lián)受體激酶26GPCRs＋GPinternalizationdown-regulationarrestinGPCRs＋arrestinGPresensitizationdynaminenzymeGPCRsinternalizationdown-regul27①與受體磷酸化相關(guān)的激酶GPCRs被配體激活后,在激發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的同時(shí),GPCRs本身也會(huì)發(fā)生快速的磷酸化,作用于受體的蛋白激酶家族已知有兩種:第二信使激酶：包括cAMP依賴(lài)的蛋白激酶(PKA)、蛋白激酶C(PKC)等,其中PKA主要作用于Gs偶聯(lián)受體,而PKC則作用于Gq偶聯(lián)受體;GPCRs激酶(Gprotein-coupledreceptorkinases,GRKs)：主要作用于經(jīng)典的信號(hào)反饋調(diào)節(jié)通路,介導(dǎo)第二信使系統(tǒng)間的相互對(duì)話(huà)。GRKs有六種:視紫紅質(zhì)激酶(GRK2)、腎上腺素受體激酶(βGRKs)的兩種異型體(GRK1和GRK3)、遺傳性慢性舞蹈病患者4號(hào)染色體中克隆出的IT11(GRK4、GRK5)以及一些從果蠅中克隆的多種同源物.①與受體磷酸化相關(guān)的激酶28②受體磷酸化激酶的作用機(jī)制視紫紅質(zhì)激酶和β-腎上腺素受體激酶存在于胞質(zhì)中,但它們的作用底物卻在胞膜上,因此,他們發(fā)揮作用時(shí)必須由胞質(zhì)向胞膜發(fā)生移位(translocation)。視紫紅質(zhì)激酶發(fā)生移位的主要機(jī)制：其C末端的Cys發(fā)生異戊二烯化(isoprenylation),使得C末端水解,最終導(dǎo)致激酶由胞質(zhì)向胞膜移位。如將C末端的Cys點(diǎn)突變?yōu)镾er,異戊二烯化被阻斷,視紫紅質(zhì)激酶的作用隨之降低。β-腎上腺素受體激酶的移位機(jī)制：激酶本身并不發(fā)生異戊二烯化,而是與受體相偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生異戊二烯化。受體被激活后,G蛋白的β、γ亞基可激活β-腎上腺素受體激酶,同時(shí)γ亞基也發(fā)生異戊二烯化,進(jìn)而對(duì)激酶接近胞膜上的受體起易化作用。②受體磷酸化激酶的作用機(jī)制29③arrestin蛋白、籠形蛋白與籠形蛋白衣被Arrestin最重要的作用是促使激活的、磷酸化的受體與G蛋白解偶聯(lián),加速受體的失敏。③arrestin蛋白、籠形蛋白與籠形蛋白衣被30內(nèi)吞的可能機(jī)制衣被復(fù)合體主要有三類(lèi):衣被蛋白I(Coatprotein-I,cop-Ⅰ)、衣被蛋白Ⅱ(Coatprotem-Ⅱ-,copⅡ)和籠形蛋白(clathrin)。衣被蛋Ⅰ和衣被蛋白Ⅱ主要參與小泡在高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的轉(zhuǎn)運(yùn);籠形蛋白則主要參與液相物質(zhì)和受體由胞膜以及反向高爾基網(wǎng)(transGolginet-work,TGN)向內(nèi)涵體(endosome)的轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)吞后的受體隱沒(méi)于內(nèi)涵體。內(nèi)涵體中的磷酸酶在酸性條件下可以特異地引起磷酸化的受體去磷酸化,進(jìn)而使得受體復(fù)敏并再循環(huán)至胞膜重新發(fā)揮作用。這一過(guò)程與受體的失敏和內(nèi)吞一樣,G蛋白受體激酶,arrestin和籠型衣被小泡起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)吞的可能機(jī)制31GPCRs的活化模式1.二態(tài)模式受體處在非活性構(gòu)象(R)與活性構(gòu)象(R*)的平衡之中,即R?R*。在沒(méi)有激動(dòng)劑的情況下,R占絕大多數(shù),R和R*之間的能障很低,使一部分R自發(fā)地變成R*。激動(dòng)劑與R*有很強(qiáng)的親和力,使平衡發(fā)生移動(dòng),增加R*的比例。拮抗劑能穩(wěn)定R,使平衡從R*移向R。中性拮抗劑與R及R*有相同的親和力,因此不能改變平衡。GPCRs的活化模式1.二態(tài)模式322.多態(tài)模式受體自發(fā)地在多個(gè)活性和非活性構(gòu)象之間變化,因而配體引起的生物效應(yīng)取決于配體高親和力結(jié)合的受體構(gòu)象。如果與G蛋白偶聯(lián)的受體構(gòu)象是活性的,那么該配體則作為激動(dòng)劑；如果受體的構(gòu)象是非活性的,則配體作為拮抗劑與受體結(jié)合。2.多態(tài)模式333.“順序結(jié)合和構(gòu)象選擇”模式受體自發(fā)地在不同的構(gòu)象(非活性R和活性R*)之間轉(zhuǎn)變,激動(dòng)劑不是一步直接與R*結(jié)合,而是按一定順序結(jié)合,因此在R和R*之間產(chǎn)生了一系列的中間構(gòu)象(R′和R")。R→R′→R"→…→R*開(kāi)始,激動(dòng)劑的一個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)與受體相互作用,然后TM的結(jié)構(gòu)域自發(fā)地運(yùn)動(dòng),激動(dòng)劑的其他基團(tuán)按順序地與受體作用,每一次相互作用穩(wěn)定了一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,最終激動(dòng)劑穩(wěn)定R*。3.“順序結(jié)合和構(gòu)象選擇”模式34GPCR固有活性研究與新藥開(kāi)發(fā)1

GPCR固有活性及反相激動(dòng)劑概念在非活性狀態(tài)下,GPCRs與GP解偶聯(lián),而在活性狀態(tài)下,GPCRs結(jié)合并激活GP。固有活性：一個(gè)GPCR在缺乏激動(dòng)劑的條件下,自發(fā)地產(chǎn)生構(gòu)型變化,從失活狀態(tài)構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)構(gòu)型的能力。R┄→R*激動(dòng)劑：能穩(wěn)定GPCR與激活狀態(tài)(R*),促使反應(yīng)平衡向R*狀態(tài)轉(zhuǎn)構(gòu)。R─→R*反相激動(dòng)劑：能穩(wěn)定GPCR于失活狀態(tài)(R),促使反應(yīng)平衡向R狀態(tài)轉(zhuǎn)構(gòu)。R←─R*拮抗劑：不改變反應(yīng)平衡狀態(tài),但能阻斷激動(dòng)劑的刺激作用和反相激動(dòng)劑的抑制作用。GPCR固有活性研究與新藥開(kāi)發(fā)1GPCR固有活性及反相激動(dòng)35RR*FullAgonistAgonistAntagonistPartialinverseagonistFullinverseagonistThetwostate-modelofGPCRactivationRR*FullAgonistAgonistAntago36激動(dòng)劑增加基礎(chǔ)G蛋白及效應(yīng)系統(tǒng)活性,拮抗劑對(duì)基礎(chǔ)活性無(wú)效應(yīng),反相激動(dòng)劑降低G蛋白基礎(chǔ)活性激動(dòng)劑增加基礎(chǔ)G蛋白及效應(yīng)系統(tǒng)活性,拮抗劑對(duì)基礎(chǔ)活性無(wú)效應(yīng),372

G蛋白偶聯(lián)受體固有活性研究進(jìn)展①G蛋白在GPCR固有活性中的作用大約有50%具有固有活性的GPCR偶聯(lián)Gi/Go,有25%具有固有活性的GPCR偶聯(lián)Gs或Gq;主要是Gq和Gs調(diào)節(jié)的固有活性與疾病發(fā)生相關(guān)。但實(shí)際上很多偶聯(lián)Gi/Go的GPCR與疾病發(fā)生有重要關(guān)系。因此,在缺乏激動(dòng)劑條件下,GPCR自發(fā)的產(chǎn)生構(gòu)型變化是否改變GPCR對(duì)不同G蛋白親和力,或者說(shuō)這種自發(fā)性構(gòu)型變化是否會(huì)改變G蛋白偶聯(lián)是非常重要的問(wèn)題。2G蛋白偶聯(lián)受體固有活性研究進(jìn)展38②G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與受體表達(dá)水平關(guān)系受體的固有活性會(huì)隨著受體在細(xì)胞中的表達(dá)量的增加而增加,隨著受體表達(dá)量的相應(yīng)增加,受體對(duì)于激動(dòng)劑的反應(yīng)(效價(jià)和效能都增加)以及無(wú)激動(dòng)劑條件下受體的固有活性也增加。用不同濃度的β腎上腺素受體cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載黑素細(xì)胞,隨著受體的表達(dá)量的增加,NPY2、NPY4、CXCR4和CCR5的固有活性和對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)增加。產(chǎn)生固有活性的這些受體和抑制性G蛋白的特性都用百日咳毒素預(yù)處理進(jìn)行了證實(shí)。②G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與受體表達(dá)水平關(guān)系39③GPCR同源或異源二聚體與固有活性的關(guān)系具有固有活性的GPCR大多數(shù)都能形成同源或異源二聚體,二聚體形成與固有活性之間的關(guān)系是非常值得探討的問(wèn)題。目前有一些二聚體形成和固有活性關(guān)系研究報(bào)道,但結(jié)論并不一致。大部分受體二聚化與固有活性水平正相關(guān),但也有例外,如趨化因子甲酸甲殼胺酸苯丙酸受體(Thehumanformylpeptidereceptor)和補(bǔ)體C5a受體雖然具高固有活性,但是一旦形成二聚體,固有活性就幾乎消失。這些可以解釋為GPCR形成二聚體后可能會(huì)引起受體構(gòu)型的變化,或形成有利于自發(fā)的偶聯(lián)G蛋白的構(gòu)型,或形成有利于偶聯(lián)原來(lái)不同G蛋白構(gòu)型。③GPCR同源或異源二聚體與固有活性的關(guān)系40④激動(dòng)劑暴露對(duì)GPCR固有活性的作用

慢性暴露μ-和δ-阿片受體或β2腎上腺素受體于它們的選擇性激動(dòng)劑,增加這些受體的固有活性,并且使一些原來(lái)表現(xiàn)出部分激動(dòng)劑或中性拮抗劑性質(zhì)的化合物表現(xiàn)為反相激動(dòng)劑。阿片等物質(zhì)成癮與藥物暴露有關(guān)。阿片類(lèi)慢性處理導(dǎo)致的μ-阿片受體自發(fā)性激活增加可能與阿片類(lèi)依賴(lài)發(fā)生有密切關(guān)系,提示μ-阿片受體固有活性抑制劑可能是尋找和發(fā)現(xiàn)阿片類(lèi)成癮治療藥物的方向之一。④激動(dòng)劑暴露對(duì)GPCR固有活性的作用41⑤G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與基礎(chǔ)神經(jīng)活性的關(guān)系許多有固有活性的野生型G蛋白偶聯(lián)受體是那些神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素、5羥色胺、褪黑素、多巴胺、乙酰膽堿、組胺、腺苷、阿片肽、神經(jīng)激肽、谷氨酸的受體。這些發(fā)現(xiàn)提示神經(jīng)遞質(zhì)的G蛋白偶聯(lián)受體的固有活性很可能與基礎(chǔ)神經(jīng)活性有關(guān)。⑤G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與基礎(chǔ)神經(jīng)活性的關(guān)系42⑥固有活性激活的GPCR突變體與疾病的關(guān)系

病理性以及人工誘變的固有活性直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生。例如：將人工誘變的固有活性激活的α,β-去甲腎上腺素表達(dá)于小鼠的心臟或血管平滑肌,產(chǎn)生心肌肥厚和高血壓。固有活性激活的KSHV-GPCR突變體與卡波氏肉瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。固有活性激活的PTH-PTHrPR的突變體在軟骨發(fā)育異常疾病中有重要的作用。先天性夜盲、家族性甲亢、低血鈣等疾病分別與固有活性激活的視紫紅質(zhì)受體、TSH受體、鈣受體突變體有關(guān)。反相激動(dòng)劑是治療上述疾病的潛在藥物。⑥固有活性激活的GPCR突變體與疾病的關(guān)系433反相激動(dòng)劑與固有活性研究根據(jù)兩態(tài)模型,G蛋白偶聯(lián)受體固有活性上調(diào),反相激動(dòng)劑的抑制效應(yīng)相應(yīng)增加,而反相激動(dòng)劑作用各種野生型G蛋白偶聯(lián)受體的效應(yīng)分析更進(jìn)一步證實(shí)了兩態(tài)模型。反相激動(dòng)劑與G蛋白偶聯(lián)受體固有活性的這種關(guān)系,使反相激動(dòng)劑成為驗(yàn)證固有活性的有力工具?，F(xiàn)在反相激動(dòng)劑已經(jīng)成為了研究受體固有活性的經(jīng)典工具。3反相激動(dòng)劑與固有活性研究44相當(dāng)多的G蛋白偶聯(lián)受體具有反相激動(dòng)劑。例如,δ阿片受體的反相激動(dòng)劑ICI174、864,ICI154、129,RTI-5989-25μ阿片受體的反相激動(dòng)劑-chlornal-trexamine多巴胺受體的反相激動(dòng)劑(+)-butaclam-o,l5-羥色胺受體的反相激動(dòng)劑Mianserinβ2腎上腺素的反相激動(dòng)劑ICI118、551等等。反相激動(dòng)劑對(duì)于具固有活性的G蛋白偶聯(lián)受體所造成的疾病有治療價(jià)值。KSHV-G蛋白偶聯(lián)受體的反相激動(dòng)劑可用于治療卡波濟(jì)肉瘤。反相激動(dòng)劑對(duì)TSHR和LHR的作用可分別用來(lái)治療甲狀腺功能亢進(jìn)癥以及青春期早熟。相當(dāng)多的G蛋白偶聯(lián)受體具有反相激動(dòng)劑。454

GPCR固有活性與新藥開(kāi)發(fā)

在固有活性激活受體篩選模型中,主要采用CART

(Constitutivelyactivatingreceptortechnology)技術(shù)。(A)用受體過(guò)表達(dá),或G蛋白胞內(nèi)胞外環(huán)分子結(jié)構(gòu)突變產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體的CART激活,來(lái)建立達(dá)到一定水平的受體固有活性。(B)轉(zhuǎn)染CART激活的受體入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,從而使表達(dá)在細(xì)胞表面的受體產(chǎn)生CART激活。而突變GPCR胞外所有跨膜環(huán)都是預(yù)選藥物作用區(qū)域。(C)分析含有CART激活的G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞,檢測(cè)它們的生物反應(yīng),并利用這一系列的生物反應(yīng)來(lái)開(kāi)發(fā)相關(guān)的功能分析陣列。篩選靶向含有CART激活G蛋白受體細(xì)胞或細(xì)胞膜的小分子化合物庫(kù),來(lái)鑒定與這些受體相互作用的小分子化合物。用各種功能分析陣列檢測(cè)激活或抑制性的小分子與受體的作用。4GPCR固有活性與新藥開(kāi)發(fā)46GeneralprocessofCART(A)(B)(C)GeneralprocessofCART(A)(B)(47與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的藥物作用與治療1

RGS調(diào)節(jié)藥物在GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中,除受體、G蛋白和效應(yīng)器外,還有其他蛋白與G蛋白相互作用影響GTP循環(huán),調(diào)節(jié)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。G蛋白信號(hào)的調(diào)節(jié)物質(zhì)(RGS)是能夠通過(guò)G蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白家族。部分RGS具有激活GTP酶活性的功能,也稱(chēng)為GTP酶激活蛋白(GAP),能增強(qiáng)GTP酶活性,減少由于受體激活介導(dǎo)的信號(hào)過(guò)程,進(jìn)而削弱激動(dòng)劑的作用。RGS可以直接拮抗Gα效應(yīng)分子,阻斷信號(hào)向效應(yīng)蛋白傳遞;與β亞基結(jié)合后拮抗Gβγ介導(dǎo)的生物效應(yīng);直接與受體結(jié)合或作為Gα效應(yīng)分子調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的藥物作用與治療1RGS調(diào)節(jié)藥物48目前,已經(jīng)確認(rèn)了RGS的幾個(gè)家族成員,其中RGS7,RGS4,RGS9等亞型與疾病發(fā)生密切相關(guān),。RGS9拮抗劑用于治療帕金森??；RGS4用于治療精神分裂癥；但目前RGS調(diào)節(jié)劑尚未成藥。目前,已經(jīng)確認(rèn)了RGS的幾個(gè)家族成員,其中RGS7,RGS4492

GPCR信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)GPCR的數(shù)量很多,但效應(yīng)蛋白數(shù)量和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常有限,因此,維持多樣化的細(xì)胞功能必然存在著某些特定的精細(xì)信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。精細(xì)調(diào)節(jié)可能與GPCR和G蛋白偶聯(lián)的特異性、膜組構(gòu)、信號(hào)途徑的互相調(diào)節(jié)有關(guān)。一種GPCR可能與幾種G蛋白偶聯(lián),例如,α2A-腎上腺素能受體分別與Gi,Gs,Gq偶聯(lián);相反,不同的GPCR可能與同一個(gè)代謝途徑、同一類(lèi)型的G蛋白偶聯(lián),如5-HT2A和毒蕈堿型乙酰膽堿M5受體都與Gq偶聯(lián)。某種細(xì)胞功能可能受到多種物質(zhì)共同的精細(xì)調(diào)節(jié)。2GPCR信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)50信號(hào)途徑互相調(diào)節(jié)是指信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間可能存在的相互作用,激活或抑制某種受體可以調(diào)節(jié)其他受體的反應(yīng)。臨床上,抑郁癥、帕金森病的發(fā)病機(jī)制都與信號(hào)途徑的相互作用有關(guān)。膜組構(gòu)指不同GPCR和G蛋白定位于特定的細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域,而不是隨機(jī)分布。不同細(xì)胞調(diào)節(jié)相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的差異與相同G蛋白偶聯(lián)的兩種受體的信號(hào)并不會(huì)出現(xiàn)疊加。信號(hào)途徑互相調(diào)節(jié)是指信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間可能存在的相互作用,激活51激動(dòng)劑定向的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ADTRS)理論認(rèn)為,激活GPCR后,只能選擇性刺激某一種G蛋白亞型,激活一種代謝途徑,這可能是由于不同的受體活性狀態(tài)激活不同的G蛋白造成的。只選擇性激活一種受體活性狀態(tài)的激動(dòng)劑，被稱(chēng)作配體選擇性激動(dòng)劑或受體活性狀態(tài)選擇性激動(dòng)劑。藥物不僅對(duì)受體亞型有選擇性,而且對(duì)同一受體介導(dǎo)的代謝途徑也有選擇性,能激活有利的代謝途徑,阻斷不利的代謝途徑。與ADTRS有關(guān)的另一個(gè)新的概念是變構(gòu)激動(dòng)作用,這種特殊的激動(dòng)作用是指在不同系統(tǒng)中激動(dòng)劑作用于同一受體,既可能產(chǎn)生激動(dòng)作用也可能產(chǎn)生反向激動(dòng)作用。激動(dòng)劑定向的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ADTRS)理論認(rèn)為,激活GPCR后,52受體的功能還可通過(guò)受體轉(zhuǎn)運(yùn)得到調(diào)節(jié),經(jīng)典的受體轉(zhuǎn)運(yùn)包括激動(dòng)劑誘導(dǎo)的GPCR激活、受體脫敏、受體內(nèi)吞和受體再循環(huán)。阿片、致幻劑的藥物渴求行為與阿片受體的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);長(zhǎng)期使用抗抑郁藥、抗精神病藥都與5-HT2A受體下調(diào)有關(guān);調(diào)節(jié)多巴胺受體轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物對(duì)于帕金森病亦具有治療作用。受體的功能還可通過(guò)受體轉(zhuǎn)運(yùn)得到調(diào)節(jié),經(jīng)典的受體轉(zhuǎn)運(yùn)包括激動(dòng)劑53受體脫敏和下調(diào)是可分的,藥物可以引起受體失敏,但不一定誘發(fā)受體下調(diào);受體內(nèi)吞對(duì)失敏受體的去磷酸化和再循環(huán)是必要的,因此,抑制受體內(nèi)吞但不影響受體脫敏的藥物會(huì)使處于失敏狀態(tài)的受體數(shù)量增加,例如,嗎啡和芬太尼會(huì)使脫敏的μ阿片受體大量增加。嗎啡和埃托啡處理小鼠7d后導(dǎo)致耐受的產(chǎn)生,但只有埃托啡能使受體下調(diào),表明阿片受體激動(dòng)劑對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)方式是不同的。受體脫敏和下調(diào)是可分的,藥物可以引起受體失敏,但不一定誘發(fā)受54GPCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)精細(xì)調(diào)節(jié)的另一個(gè)機(jī)制是GPCR的二聚化和寡聚化。受體二聚化對(duì)激動(dòng)劑的有效結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)甚至產(chǎn)生新的藥物結(jié)合位點(diǎn)都是必需的。受體間既可形成同源二聚體,也能形成異源二聚體例如腺苷A1受體可以與多巴胺D1受體形成二聚體,因此,腺苷受體也有可能成為治療帕金森病的藥物新靶點(diǎn)。GPCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)精細(xì)調(diào)節(jié)的另一個(gè)機(jī)制是GPCR的二聚化和寡55藥物反應(yīng)的個(gè)體化與群體化可能是由于基因的多型性造成的。受體存在基因多型性,如β1和β2-受體、5-HT2C受體。對(duì)純合子β2-腎上腺素能受體遺傳密碼子16Arg/Arg的病人應(yīng)盡早高強(qiáng)度地進(jìn)行抗炎治療。氟西汀可以引起小鼠mRNA的剪接發(fā)生變化,從而對(duì)抗抑郁的產(chǎn)生。在高血壓病人、Ⅰ型假性甲狀旁腺功能減退的病人都發(fā)現(xiàn)了G蛋白的突變。藥物反應(yīng)的個(gè)體化與群體化可能是由于基因的多型性造成的。56GPCRs配體的多樣性決定了其活化機(jī)制的復(fù)雜性。GPCRs不僅僅是簡(jiǎn)單的開(kāi)關(guān)裝置,而是高度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),處于非活性和活性構(gòu)象的平衡之中。不僅激動(dòng)劑,而且拮抗劑也能調(diào)節(jié)受體功能。GPCRs是一大類(lèi)具有重要生理功能的受體,GPCRs失敏與許多疾病和病理生理過(guò)程有著密切的聯(lián)系,例如阿片類(lèi)藥物的耐受和依賴(lài)與阿片受體的失敏和內(nèi)吞關(guān)系密切,受體的失敏與內(nèi)吞對(duì)受體功能的調(diào)節(jié)非常重要GPCRs配體的多樣性決定了其活化機(jī)制的復(fù)雜性。GPCRs不57G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展Gprotein-coupledreceptor,GPCRG蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展Gprotein-coupledr58GPCRG蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupledreceptor,GPCR),是人體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)家族,迄今已報(bào)道了近2000種不同的GPCRs。GPCRs因能結(jié)合和調(diào)節(jié)G蛋白活性而得名。GPCRs的配體多種多樣,包括生物胺、肽類(lèi)、糖蛋白、脂類(lèi)、核苷酸、離子和蛋白酶等。各種光、嗅、味的信號(hào)分子也由GPCRs介導(dǎo)。大多數(shù)GPCRs通過(guò)G蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,例如,刺激或抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)和活化磷脂酶的活性,調(diào)節(jié)鉀及鈣離子通道的活性。有些GPCRs通過(guò)酪氨酸激酶、Src、Stat3途經(jīng)傳遞信息,與細(xì)胞增值、細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。GPCRG蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupled59人類(lèi)基因組測(cè)序表明,約有720個(gè)基因參與了GPCR的合成。GPCR功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生,如阿爾茨海默氏癥(alzheimers)、帕金森癥(Parkinsondisease)、侏儒癥(midgetism)、色盲癥(acritochronacy)以及哮喘(asthma)等。接近50%的藥物是用GPCR作為它們的靶標(biāo)。對(duì)于GPCR的研究具有極其重要的意義。人類(lèi)基因組測(cè)序表明,約有720個(gè)基因參與了GPCR的合成。60

GPCR的結(jié)構(gòu)GPCR的肽鏈N末端,7個(gè)跨膜α螺旋(TM1→TM7)。C末端,3個(gè)胞外環(huán)(ECL1→ECL3)及3~4個(gè)胞內(nèi)環(huán)(ICL1→ICL4)組成。N端在胞外,常常被糖基化。C端在胞內(nèi),多表現(xiàn)為磷酸化。7個(gè)跨膜的α螺旋反復(fù)穿過(guò)細(xì)胞膜的脂雙層。不同GPCR跨膜螺旋區(qū)的氨基酸比較保守,而C/N末端和回環(huán)區(qū)的氨基酸差異較大。GPCR的結(jié)構(gòu)GPCR的肽鏈61牛視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的模式圖胞外側(cè)胞內(nèi)側(cè)ECLICLTM1TM7牛視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的模式圖胞外側(cè)胞內(nèi)側(cè)ECLICLTM1TM762目前只有一種GPCR蛋白—牛視紫紅質(zhì)(bovinerhodopsin)的晶體三維結(jié)構(gòu)被構(gòu)建。細(xì)胞質(zhì)的末端區(qū)域通常被疏水殘基所環(huán)繞,它們一同形成了G蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。牛視紫質(zhì)受體在C末端有一段短的α螺旋,并與膜平行,稱(chēng)之為T(mén)M8,可能對(duì)于受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著重要的作用。一些亞家族受體間存在著一些相似的結(jié)構(gòu),如幾乎所有GPCR都具有二硫鍵等。目前只有一種GPCR蛋白—牛視紫紅質(zhì)(bovinerhod63GPCR分類(lèi)A族，又稱(chēng)為視紫紅質(zhì)(rhodopsin)/β2腎上腺素受體族，分為6個(gè)亞族:①生物胺受體;②膽囊收縮肽、內(nèi)皮素、速激肽、神經(jīng)肽Y等;③非脊椎動(dòng)物的視蛋白和緩激肽受體;④腺嘌呤、大麻類(lèi)、黑皮素及嗅覺(jué)受體;⑤趨化因子、互補(bǔ)因子、促性腺激素釋放激素(GnRH)等;⑥褪黑激素受體及其它。GPCR分類(lèi)A族，又稱(chēng)為視紫紅質(zhì)(rhodopsin)/β64B族,又稱(chēng)為胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族,分為4個(gè)亞族:①降鈣素和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體;②甲狀旁腺激素受體;③胰高血糖素、類(lèi)胰高血糖素肽、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽、血管活性腸肽和分泌素受體;④Latrotoxin受體。B族,又稱(chēng)為胰高血糖素/血管活性腸肽/降鈣素受體樣受體族,65C族,又稱(chēng)為神經(jīng)遞質(zhì)/鈣受體樣受體族,分為5個(gè)亞族:①谷氨酸受體;②γ-氨基丁酸(GABA)受體;③鈣受體;④鼻神經(jīng)外激素受體;⑤味覺(jué)受體。C族,又稱(chēng)為神經(jīng)遞質(zhì)/鈣受體樣受體族,分為5個(gè)亞族:66D族—真菌信息素(fungalpheromone)受體E族—cAMP受體(cAMPreceptor)D族—真菌信息素(fungalpheromone)受體67第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件68在GPCR家族中,A族受體數(shù)目最多。A族受體共有二十多個(gè)高度保守位點(diǎn)。A族的12個(gè)高度保守位點(diǎn)功能見(jiàn)表。B族受體的N末端較長(zhǎng)且較保守,主要結(jié)合一些大的配基,如胰高血糖素、分泌素等。C族受體的N未端(大約600個(gè)氨基酸)和C未端都很長(zhǎng),在C-Ⅰ與C-Ⅱ間也由兩個(gè)Cys形成二硫鍵,C-Ⅲ環(huán)短并且高度保守。在GPCR家族中,A族受體數(shù)目最多。69第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件70配體結(jié)合域A族受體的配體結(jié)合域一類(lèi)是小分子配體,小分子配體結(jié)合在受體跨膜α螺旋形成的結(jié)合裂隙中。經(jīng)典的小分子配體有腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、組胺(His)、乙酰膽堿(Ach)、前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)和嘌呤(purine)等。另一類(lèi)是大分子肽類(lèi)配體,肽類(lèi)配體主要結(jié)合在受體的胞外結(jié)構(gòu)域。P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B、血管緊張素、神經(jīng)肽Y、白介素8,抗利尿激素等肽類(lèi)配體。配體結(jié)合域A族受體的配體結(jié)合域71B族受體的配體結(jié)合域與A族的肽類(lèi)配體類(lèi)似,B族受體的肽類(lèi)配體結(jié)合部位主要位于受體的胞外結(jié)構(gòu)域。B族受體的N末端在大多數(shù)配體與受體的結(jié)合中起關(guān)鍵作用。例如分泌素、血管腸肽、胰高血糖素等肽類(lèi)配體,它們不僅與受體的N末端結(jié)合,而且與受體的ECL相互作用。B族受體的配體結(jié)合域72C族受體的配體結(jié)合域C族受體的配體主要有谷氨酸、GABA和Ca2+。這些配體雖然分子小,但是其與A族小分子配體在受體上的結(jié)合部位不同,均位于受體胞外的N末端。C族受體的配體結(jié)合域73第四講-G蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展課件74GPCRs活化的分子機(jī)制1.分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處于靜止構(gòu)象在沒(méi)有激動(dòng)劑時(shí),分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處于靜止(非活性)構(gòu)象,當(dāng)受體與激動(dòng)劑結(jié)合或受體發(fā)生突變時(shí),破壞了受體分子內(nèi)相互作用力,使受體的關(guān)鍵序列暴露給G蛋白,從而活化G蛋白?？梢哉J(rèn)為,分子內(nèi)相互作用力遭到破壞是GPCRs活化機(jī)制之一。使受體易于在活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變。2.質(zhì)子化是GPCRs活化的關(guān)鍵A族受體ICL2上有一保守的DRY(Glu/Asp-Arg-Tyr)基序,許多實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)受體活化時(shí),其Glu/Asp發(fā)生質(zhì)子化。GPCRs活化的分子機(jī)制1.分子內(nèi)相互作用力使GPCRs處753.GPCRs活化中的構(gòu)象變化GPCRs活化中的構(gòu)象變化,研究的最多的是視紫紅質(zhì)。多種光譜技術(shù)的研究結(jié)果表明,在視紫紅質(zhì)活化為變視紫紅質(zhì)Ⅱ的過(guò)程中,發(fā)生了構(gòu)象重排。4.GPCR與G蛋白偶聯(lián)信號(hào)從活化受體傳遞給G蛋白的機(jī)理還不清楚。實(shí)驗(yàn)證實(shí),GPCRs的ICL2和ICL3在與G蛋白偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用。其中ICL3決定偶聯(lián)G蛋白α亞基的特異性,ICL2決定G蛋白的活化。3.GPCRs活化中的構(gòu)象變化765.受體二聚化研究表明,許多GPCRs,包括視紫紅質(zhì)、分泌素、谷氨酸受體等能形成二聚體。激動(dòng)劑有時(shí)能提高受體二聚體的水平,有時(shí)卻降低或不改變受體二聚體的水平。受體二聚化的作用還不清楚,可能與受體個(gè)體發(fā)育和受體功能的多樣性有關(guān)。5.受體二聚化77①GPCRs雙聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

盡管GPCRs在分子結(jié)構(gòu)上都有七個(gè)跨膜區(qū),但不同的GPCRs在細(xì)胞膜內(nèi)外的結(jié)構(gòu)卻有較大的差別,因此分子內(nèi)部發(fā)生雙聚化的區(qū)域、方式也不盡相同。有的GPCRs雙聚化依靠二硫鍵,還原劑可以減弱或消除雙聚體形成;另一些則可能通過(guò)分子間的疏水鍵相互作用形成雙聚體,可被SDS(二烷基硫酸鈉)解聚。GPCRs的雙聚化可發(fā)生在胞外的N端、跨膜區(qū)、胞內(nèi)環(huán)、胞外環(huán)以及胞內(nèi)的C末端。①GPCRs雙聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)78例如mGluR5含19個(gè)Cys的胞外N端,其中9個(gè)在近膜區(qū),其雙聚化可以被還原劑DTT完全消除,表明二硫鍵在形成雙聚化中起關(guān)鍵作用,用胰蛋白酶水解除去受體胞外N端后,則不再發(fā)生雙聚化,這表明mGluR5雙聚化在胞外N端。類(lèi)似的受體還有GluRlα和CaR。阿片受體有彼此同源性較高的DOR、κ受體(KOR)、μ受體(MOR)三種亞型。例如79②GPCRs雙聚化對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

GABABR屬于GPCRs。GABABR又包括GBR1和GBR2兩種亞型。GBR1＋GBR2→表達(dá)→功能受體間相互作用可促進(jìn)受體蛋白合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位,也解釋了體外單獨(dú)表達(dá)的GBR1不具有天然組織受體功能的分子機(jī)制。在功能方面,單獨(dú)表達(dá)兩受體,激動(dòng)劑引起的AC抑制、35s-GTP-s結(jié)合、GIRK的激活等幾乎不能發(fā)生,而共表達(dá)后上述功能明顯增強(qiáng)。用免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)兩受體可通過(guò)C末端形成雙聚體.可見(jiàn),GBR1在膜上的定位及發(fā)揮功能依賴(lài)于和GBR2形成雙聚體。②GPCRs雙聚化對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響80受體的雙聚化有病理和藥理學(xué)方面的意義抗CCR5N端的抗體在體外培養(yǎng)細(xì)胞和小鼠體內(nèi)顯示出較強(qiáng)的抑制HIV-1復(fù)制的作用,而抗體與激動(dòng)劑均可誘導(dǎo)CCR5雙聚體的形成,而針對(duì)受體其它部位的抗體不能導(dǎo)致受體雙聚化,也不能抑制HIV-1的感染。因此提示,誘導(dǎo)CCR5的雙聚化可以阻斷HIV-1通過(guò)CCR5引起的感染。受體的雙聚化有病理和藥理學(xué)方面的意義816.GPCRs的失敏及內(nèi)吞作用絕大多數(shù)與G蛋白相偶聯(lián)的受體在激動(dòng)劑的長(zhǎng)期或反復(fù)刺激下都會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性降低的現(xiàn)象稱(chēng)為失敏(desensitization)。受體失敏作用隨著激動(dòng)劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)經(jīng)歷不同的變化過(guò)程。在激動(dòng)劑刺激后幾秒至幾小時(shí)內(nèi),受體對(duì)刺激的反應(yīng)性降低,但細(xì)胞膜表面的受體數(shù)量并未減少;如果這種作用持續(xù)存在,會(huì)引起膜表面受體數(shù)量降低,即發(fā)生內(nèi)吞(internalization);甚至進(jìn)一步發(fā)生不可逆的降解,從而引起受體下調(diào)(down-regulation).6.GPCRs的失敏及內(nèi)吞作用82大多數(shù)的GPCRs激活后,在第二信使激酶或G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用下發(fā)生快速磷酸化;受體的磷酸化提高了其對(duì)arrestin(阻礙蛋白)的親和力,兩者形成復(fù)合體并促使受體與G蛋白解偶聯(lián);進(jìn)而此復(fù)合體與籠形蛋白衣被小泡結(jié)合并在dynamin(發(fā)動(dòng)蛋白)的調(diào)解作用下發(fā)生內(nèi)吞,并隱沒(méi)(sequestration)于胞內(nèi)。內(nèi)吞后的受體可能發(fā)生兩種變化:一是在衣被小泡內(nèi)發(fā)生去磷酸化,通過(guò)再循環(huán)回到胞膜表面,完成復(fù)敏(resensitization);二是受體被降解,發(fā)生下調(diào)。但是有些受體在此過(guò)程中并不需要arrestin和dynamin的介導(dǎo),如血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)受體。大多數(shù)的GPCRs激活后,在第二信使激酶或G蛋白偶聯(lián)受體激酶83GPCRs＋GPinternalizationdown-regulationarrestinGPCRs＋arrestinGPresensitizationdynaminenzymeGPCRsinternalizationdown-regul84①與受體磷酸化相關(guān)的激酶GPCRs被配體激活后,在激發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的同時(shí),GPCRs本身也會(huì)發(fā)生快速的磷酸化,作用于受體的蛋白激酶家族已知有兩種:第二信使激酶：包括cAMP依賴(lài)的蛋白激酶(PKA)、蛋白激酶C(PKC)等,其中PKA主要作用于Gs偶聯(lián)受體,而PKC則作用于Gq偶聯(lián)受體;GPCRs激酶(Gprotein-coupledreceptorkinases,GRKs)：主要作用于經(jīng)典的信號(hào)反饋調(diào)節(jié)通路,介導(dǎo)第二信使系統(tǒng)間的相互對(duì)話(huà)。GRKs有六種:視紫紅質(zhì)激酶(GRK2)、腎上腺素受體激酶(βGRKs)的兩種異型體(GRK1和GRK3)、遺傳性慢性舞蹈病患者4號(hào)染色體中克隆出的IT11(GRK4、GRK5)以及一些從果蠅中克隆的多種同源物.①與受體磷酸化相關(guān)的激酶85②受體磷酸化激酶的作用機(jī)制視紫紅質(zhì)激酶和β-腎上腺素受體激酶存在于胞質(zhì)中,但它們的作用底物卻在胞膜上,因此,他們發(fā)揮作用時(shí)必須由胞質(zhì)向胞膜發(fā)生移位(translocation)。視紫紅質(zhì)激酶發(fā)生移位的主要機(jī)制：其C末端的Cys發(fā)生異戊二烯化(isoprenylation),使得C末端水解,最終導(dǎo)致激酶由胞質(zhì)向胞膜移位。如將C末端的Cys點(diǎn)突變?yōu)镾er,異戊二烯化被阻斷,視紫紅質(zhì)激酶的作用隨之降低。β-腎上腺素受體激酶的移位機(jī)制：激酶本身并不發(fā)生異戊二烯化,而是與受體相偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生異戊二烯化。受體被激活后,G蛋白的β、γ亞基可激活β-腎上腺素受體激酶,同時(shí)γ亞基也發(fā)生異戊二烯化,進(jìn)而對(duì)激酶接近胞膜上的受體起易化作用。②受體磷酸化激酶的作用機(jī)制86③arrestin蛋白、籠形蛋白與籠形蛋白衣被Arrestin最重要的作用是促使激活的、磷酸化的受體與G蛋白解偶聯(lián),加速受體的失敏。③arrestin蛋白、籠形蛋白與籠形蛋白衣被87內(nèi)吞的可能機(jī)制衣被復(fù)合體主要有三類(lèi):衣被蛋白I(Coatprotein-I,cop-Ⅰ)、衣被蛋白Ⅱ(Coatprotem-Ⅱ-,copⅡ)和籠形蛋白(clathrin)。衣被蛋Ⅰ和衣被蛋白Ⅱ主要參與小泡在高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的轉(zhuǎn)運(yùn);籠形蛋白則主要參與液相物質(zhì)和受體由胞膜以及反向高爾基網(wǎng)(transGolginet-work,TGN)向內(nèi)涵體(endosome)的轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)吞后的受體隱沒(méi)于內(nèi)涵體。內(nèi)涵體中的磷酸酶在酸性條件下可以特異地引起磷酸化的受體去磷酸化,進(jìn)而使得受體復(fù)敏并再循環(huán)至胞膜重新發(fā)揮作用。這一過(guò)程與受體的失敏和內(nèi)吞一樣,G蛋白受體激酶,arrestin和籠型衣被小泡起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)吞的可能機(jī)制88GPCRs的活化模式1.二態(tài)模式受體處在非活性構(gòu)象(R)與活性構(gòu)象(R*)的平衡之中,即R?R*。在沒(méi)有激動(dòng)劑的情況下,R占絕大多數(shù),R和R*之間的能障很低,使一部分R自發(fā)地變成R*。激動(dòng)劑與R*有很強(qiáng)的親和力,使平衡發(fā)生移動(dòng),增加R*的比例。拮抗劑能穩(wěn)定R,使平衡從R*移向R。中性拮抗劑與R及R*有相同的親和力,因此不能改變平衡。GPCRs的活化模式1.二態(tài)模式892.多態(tài)模式受體自發(fā)地在多個(gè)活性和非活性構(gòu)象之間變化,因而配體引起的生物效應(yīng)取決于配體高親和力結(jié)合的受體構(gòu)象。如果與G蛋白偶聯(lián)的受體構(gòu)象是活性的,那么該配體則作為激動(dòng)劑；如果受體的構(gòu)象是非活性的,則配體作為拮抗劑與受體結(jié)合。2.多態(tài)模式903.“順序結(jié)合和構(gòu)象選擇”模式受體自發(fā)地在不同的構(gòu)象(非活性R和活性R*)之間轉(zhuǎn)變,激動(dòng)劑不是一步直接與R*結(jié)合,而是按一定順序結(jié)合,因此在R和R*之間產(chǎn)生了一系列的中間構(gòu)象(R′和R")。R→R′→R"→…→R*開(kāi)始,激動(dòng)劑的一個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)與受體相互作用,然后TM的結(jié)構(gòu)域自發(fā)地運(yùn)動(dòng),激動(dòng)劑的其他基團(tuán)按順序地與受體作用,每一次相互作用穩(wěn)定了一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,最終激動(dòng)劑穩(wěn)定R*。3.“順序結(jié)合和構(gòu)象選擇”模式91GPCR固有活性研究與新藥開(kāi)發(fā)1

GPCR固有活性及反相激動(dòng)劑概念在非活性狀態(tài)下,GPCRs與GP解偶聯(lián),而在活性狀態(tài)下,GPCRs結(jié)合并激活GP。固有活性：一個(gè)GPCR在缺乏激動(dòng)劑的條件下,自發(fā)地產(chǎn)生構(gòu)型變化,從失活狀態(tài)構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)構(gòu)型的能力。R┄→R*激動(dòng)劑：能穩(wěn)定GPCR與激活狀態(tài)(R*),促使反應(yīng)平衡向R*狀態(tài)轉(zhuǎn)構(gòu)。R─→R*反相激動(dòng)劑：能穩(wěn)定GPCR于失活狀態(tài)(R),促使反應(yīng)平衡向R狀態(tài)轉(zhuǎn)構(gòu)。R←─R*拮抗劑：不改變反應(yīng)平衡狀態(tài),但能阻斷激動(dòng)劑的刺激作用和反相激動(dòng)劑的抑制作用。GPCR固有活性研究與新藥開(kāi)發(fā)1GPCR固有活性及反相激動(dòng)92RR*FullAgonistAgonistAntagonistPartialinverseagonistFullinverseagonistThetwostate-modelofGPCRactivationRR*FullAgonistAgonistAntago93激動(dòng)劑增加基礎(chǔ)G蛋白及效應(yīng)系統(tǒng)活性,拮抗劑對(duì)基礎(chǔ)活性無(wú)效應(yīng),反相激動(dòng)劑降低G蛋白基礎(chǔ)活性激動(dòng)劑增加基礎(chǔ)G蛋白及效應(yīng)系統(tǒng)活性,拮抗劑對(duì)基礎(chǔ)活性無(wú)效應(yīng),942

G蛋白偶聯(lián)受體固有活性研究進(jìn)展①G蛋白在GPCR固有活性中的作用大約有50%具有固有活性的GPCR偶聯(lián)Gi/Go,有25%具有固有活性的GPCR偶聯(lián)Gs或Gq;主要是Gq和Gs調(diào)節(jié)的固有活性與疾病發(fā)生相關(guān)。但實(shí)際上很多偶聯(lián)Gi/Go的GPCR與疾病發(fā)生有重要關(guān)系。因此,在缺乏激動(dòng)劑條件下,GPCR自發(fā)的產(chǎn)生構(gòu)型變化是否改變GPCR對(duì)不同G蛋白親和力,或者說(shuō)這種自發(fā)性構(gòu)型變化是否會(huì)改變G蛋白偶聯(lián)是非常重要的問(wèn)題。2G蛋白偶聯(lián)受體固有活性研究進(jìn)展95②G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與受體表達(dá)水平關(guān)系受體的固有活性會(huì)隨著受體在細(xì)胞中的表達(dá)量的增加而增加,隨著受體表達(dá)量的相應(yīng)增加,受體對(duì)于激動(dòng)劑的反應(yīng)(效價(jià)和效能都增加)以及無(wú)激動(dòng)劑條件下受體的固有活性也增加。用不同濃度的β腎上腺素受體cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載黑素細(xì)胞,隨著受體的表達(dá)量的增加,NPY2、NPY4、CXCR4和CCR5的固有活性和對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)增加。產(chǎn)生固有活性的這些受體和抑制性G蛋白的特性都用百日咳毒素預(yù)處理進(jìn)行了證實(shí)。②G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與受體表達(dá)水平關(guān)系96③GPCR同源或異源二聚體與固有活性的關(guān)系具有固有活性的GPCR大多數(shù)都能形成同源或異源二聚體,二聚體形成與固有活性之間的關(guān)系是非常值得探討的問(wèn)題。目前有一些二聚體形成和固有活性關(guān)系研究報(bào)道,但結(jié)論并不一致。大部分受體二聚化與固有活性水平正相關(guān),但也有例外,如趨化因子甲酸甲殼胺酸苯丙酸受體(Thehumanformylpeptidereceptor)和補(bǔ)體C5a受體雖然具高固有活性,但是一旦形成二聚體,固有活性就幾乎消失。這些可以解釋為GPCR形成二聚體后可能會(huì)引起受體構(gòu)型的變化,或形成有利于自發(fā)的偶聯(lián)G蛋白的構(gòu)型,或形成有利于偶聯(lián)原來(lái)不同G蛋白構(gòu)型。③GPCR同源或異源二聚體與固有活性的關(guān)系97④激動(dòng)劑暴露對(duì)GPCR固有活性的作用

慢性暴露μ-和δ-阿片受體或β2腎上腺素受體于它們的選擇性激動(dòng)劑,增加這些受體的固有活性,并且使一些原來(lái)表現(xiàn)出部分激動(dòng)劑或中性拮抗劑性質(zhì)的化合物表現(xiàn)為反相激動(dòng)劑。阿片等物質(zhì)成癮與藥物暴露有關(guān)。阿片類(lèi)慢性處理導(dǎo)致的μ-阿片受體自發(fā)性激活增加可能與阿片類(lèi)依賴(lài)發(fā)生有密切關(guān)系,提示μ-阿片受體固有活性抑制劑可能是尋找和發(fā)現(xiàn)阿片類(lèi)成癮治療藥物的方向之一。④激動(dòng)劑暴露對(duì)GPCR固有活性的作用98⑤G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與基礎(chǔ)神經(jīng)活性的關(guān)系許多有固有活性的野生型G蛋白偶聯(lián)受體是那些神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素、5羥色胺、褪黑素、多巴胺、乙酰膽堿、組胺、腺苷、阿片肽、神經(jīng)激肽、谷氨酸的受體。這些發(fā)現(xiàn)提示神經(jīng)遞質(zhì)的G蛋白偶聯(lián)受體的固有活性很可能與基礎(chǔ)神經(jīng)活性有關(guān)。⑤G蛋白偶聯(lián)受體固有活性與基礎(chǔ)神經(jīng)活性的關(guān)系99⑥固有活性激活的GPCR突變體與疾病的關(guān)系

病理性以及人工誘變的固有活性直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生。例如：將人工誘變的固有活性激活的α,β-去甲腎上腺素表達(dá)于小鼠的心臟或血管平滑肌,產(chǎn)生心肌肥厚和高血壓。固有活性激活的KSHV-GPCR突變體與卡波氏肉瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。固有活性激活的PTH-PTHrPR的突變體在軟骨發(fā)育異常疾病中有重要的作用。先天性夜盲、家族性甲亢、低血鈣等疾病分別與固有活性激活的視紫紅質(zhì)受體、TSH受體、鈣受體突變體有關(guān)。反相激動(dòng)劑是治療上述疾病的潛在藥物。⑥固有活性激活的GPCR突變體與疾病的關(guān)系1003反相激動(dòng)劑與固有活性研究根據(jù)兩態(tài)模型,G蛋白偶聯(lián)受體固有活性上調(diào),反相激動(dòng)劑的抑制效應(yīng)相應(yīng)增加,而反相激動(dòng)劑作用各種野生型G蛋白偶聯(lián)受體的效應(yīng)分析更進(jìn)一步證實(shí)了兩態(tài)模型。反相激動(dòng)劑與G蛋白偶聯(lián)受體固有活性的這種關(guān)系,使反相激動(dòng)劑成為驗(yàn)證固有活性的有力工具?，F(xiàn)在反相激動(dòng)劑已經(jīng)成為了研究受體固有活性的經(jīng)典工具。3反相激動(dòng)劑與固有活性研究101相當(dāng)多的G蛋白偶聯(lián)受體具有反相激動(dòng)劑。例如,δ阿片受體的反相激動(dòng)劑ICI174、864,ICI154、129,RTI-5989-25μ阿片受體的反相激動(dòng)劑-chlornal-trexamine多巴胺受體的反相激動(dòng)劑(+)-butaclam-o,l5-羥色胺受體的反相激動(dòng)劑Mianserinβ2腎上腺素的反相激動(dòng)劑ICI118、551等等。反相激動(dòng)劑對(duì)于具固有活性的G蛋白偶聯(lián)受體所造成的疾病有治療價(jià)值。KSHV-G蛋白偶聯(lián)受體的反相激動(dòng)劑可用于治療卡波濟(jì)肉瘤。反相激動(dòng)劑對(duì)TSHR和LHR的作用可分別用來(lái)治療甲狀腺功能亢進(jìn)癥以及青春期早熟。相當(dāng)多的G蛋白偶聯(lián)受體具有反相激動(dòng)劑。1024

GPCR固有活性與新藥開(kāi)發(fā)

在固有活性激活受體篩選模型中,主要采用CART

(Constitutivelyactivatingreceptortechnology)技術(shù)。(A)用受體過(guò)表達(dá),或G蛋白胞內(nèi)胞外環(huán)分子結(jié)構(gòu)突變產(chǎn)生的G蛋白偶聯(lián)受體的CART激活,來(lái)建立達(dá)到一定水平的受體固有活性。(B)轉(zhuǎn)染CART激活的受體入哺乳動(dòng)物細(xì)胞,從而使表達(dá)在細(xì)胞表面的受體產(chǎn)生CART激活。而突變GPCR胞外所有跨膜環(huán)都是預(yù)選藥物作用區(qū)域。(C)分析含有CART激活的G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞,檢測(cè)它們的生物反應(yīng),并利用這一系列的生物反應(yīng)來(lái)開(kāi)發(fā)相關(guān)的功能分析陣列。篩選靶向含有CART激活G蛋白受體細(xì)胞或細(xì)胞膜的小分子化合物庫(kù),來(lái)鑒定與這些受體相互作用的小分子化合物。用各種功能