藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件

第八章

藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)

第八章藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)

第一節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述第一節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述（一）轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來的可直接參與蛋白質(zhì)翻譯的mRNA（編碼RNA）總和，而其他所有非編碼RNA均可歸為RNA組（RNome）。（一）轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指生命單元（通常是1.轉(zhuǎn)錄組來自于基因組,量小得多但重要（人類基因組包含有30億個(gè)堿基對(duì)，其中大約只有3萬個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA分子，轉(zhuǎn)錄后的mRNA能被翻譯生成蛋白質(zhì)的也只占整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的40%左右）。2.轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。（二）轉(zhuǎn)錄組與基因組的關(guān)系1.轉(zhuǎn)錄組來自于基因組,量小得多但重要（人類基因組包含有30（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在整體水平上研究細(xì)胞編碼基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法：1.基因芯片技術(shù)2.基因表達(dá)系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)4.RNA測(cè)序技術(shù)（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在整體水平1.基因芯片技術(shù)基因芯片（genechip）又稱DNA芯片，指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。1.基因芯片技術(shù)基因芯片（genechip）又稱DNA按用途分表達(dá)譜芯片診斷芯片指紋圖譜芯片測(cè)序芯片毒理芯片芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)按用途分基因芯片的特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高序列數(shù)量大檢測(cè)效率高應(yīng)用范圍廣成本較低基因芯片的特點(diǎn)：DNA芯片技術(shù)步驟芯片制備實(shí)性材料：硅芯片、玻片和瓷片需進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團(tuán)。膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸DNA芯片技術(shù)步驟芯片制備樣品制備樣品分離純化DNA,mRNA擴(kuò)增PCR,RT—PCR，固相PCR標(biāo)記熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標(biāo)記樣品制備樣品分離純化分子雜交樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分子雜交樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。④檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號(hào)軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理④檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光2.基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）是通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個(gè)EST（expresssequencedtags）來尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而比較完整地獲得基因組的表達(dá)信息。SAGE能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息，對(duì)已知基因進(jìn)行量化分析。SAGE也能應(yīng)用于尋找新基因。2.基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析（SerialAnalEST（ExpressedSequencetags，表達(dá)序列標(biāo)簽）是從已建好的cDNA庫(kù)中隨機(jī)抽取克隆，從5’末端或3’末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。EST（ExpressedSequencetags，表達(dá)SAGE的主要依據(jù)

第一，一個(gè)9～10堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認(rèn)一種轉(zhuǎn)錄物。第二，如果能將9堿基的標(biāo)簽集中于一個(gè)克隆中進(jìn)行測(cè)序，并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理，就能對(duì)數(shù)以千計(jì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析。SAGE的主要依據(jù)

第一，一個(gè)9～10堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽SAGE的主要過程第一階段：SAGE文庫(kù)的構(gòu)建①以biotin-oligodT為引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)錨定酶（AnchoringEnzyme,AE）酶（如NlaⅢ、Sau3AⅠ等）切后收集cDNA的3’端部分。SAGE的主要過程第一階段：SAGE文庫(kù)的構(gòu)建anchor錨，靠山synthesis綜合物zyme酶，病菌enzyme酶anchor錨，靠山synthesis綜合物②將收集的3’端cDNA等分為兩部分，分別同接頭A、B相連接。每一種接頭的結(jié)構(gòu)都由PCR擴(kuò)增引物A或B的序列、標(biāo)簽酶識(shí)別位點(diǎn)和錨定酶識(shí)別位點(diǎn)三部分組成。標(biāo)簽酶（TaggingEnzyme,TE）是一種IIS類限制性內(nèi)切酶，如BsmFI等，它在距識(shí)別位點(diǎn)下游約20bp的位置切割DNA雙鏈。②將收集的3’端cDNA等分為兩部分，分別同接頭A、B相連接藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件③連接產(chǎn)物以標(biāo)簽酶酶切后用Klenow酶補(bǔ)平5’突出端，得到兩組分別帶有接頭A、B的短cDNA片段（約50bp）?；旌喜⑦B接兩組短cDNA片段，形成一個(gè)約100bp的雙標(biāo)簽體（ditag）群，并以引物A和B對(duì)其進(jìn)PCR擴(kuò)增。③連接產(chǎn)物以標(biāo)簽酶酶切后用Klenow酶補(bǔ)平5’突出端，得到

ample充足的amplifiy增強(qiáng)放大ample充足的amplifiy增強(qiáng)放大④用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化去除接頭后的雙標(biāo)簽體（約26bp），并使之相互連接成為大片段的連接體，克隆至質(zhì)粒載體內(nèi)形成一個(gè)SAGE文庫(kù)以備集中測(cè)序。④用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化去除接頭后的雙標(biāo)簽體（約26藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件第二階段：SAGE文庫(kù)的測(cè)序

第三階段：標(biāo)簽序列的提取

對(duì)測(cè)序得到的標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。在所測(cè)得序列中的每個(gè)雙標(biāo)簽體之間由錨定酶序列相間隔，每一標(biāo)簽序列是否出現(xiàn)以及出現(xiàn)的頻率將代表基因是否表達(dá)以及表達(dá)的水平。一般一個(gè)測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果可得到約20個(gè)雙標(biāo)簽體，亦即包含了約40個(gè)轉(zhuǎn)錄本的信息。

第二階段：SAGE文庫(kù)的測(cè)序

第三階段：標(biāo)簽序列的提取

3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)是以基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的新技術(shù)，其方法學(xué)基礎(chǔ)是一個(gè)標(biāo)簽序列（10-20bp）含有能夠特異識(shí)別轉(zhuǎn)錄子的信息，標(biāo)簽序列與長(zhǎng)的連續(xù)分子連接在一起，便于克隆與序列分析。通過定量測(cè)定可以提供相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)水平，也就是將mRNA的一端測(cè)出一個(gè)包含10-20個(gè)堿基的標(biāo)簽序列，每一個(gè)標(biāo)簽序列在樣品中的頻率（拷貝數(shù)）就代表了與該標(biāo)簽相應(yīng)的基因表達(dá)水平。3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)MPSS(m技術(shù)方法(1)首先將cDNA模板體外“克隆”到直徑5μm的微球體上?！翱寺　钡姆椒ㄖ饕抢萌斯ぴO(shè)計(jì)長(zhǎng)度不同的兩類互補(bǔ)寡核苷酸,分別與cDNA模板和微球體連接之后,再將cDNA模板與微球體連接起來。為了能裝載下細(xì)胞內(nèi)所有的cDNA模板(若以3～4×104個(gè)基因計(jì)算),寡核苷酸的數(shù)量至少應(yīng)該要比模板的量多100倍以上。技術(shù)方法(1)首先將cDNA模板體外“克隆”到直徑5μm藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件(2)用DpnII酶切處理微球體上的cDNA模板,形成粘性末端。(3)用含有II型限制性內(nèi)切酶Bbv1識(shí)別位點(diǎn)的不同寡核苷酸接頭與連接在微球體上的cDNA模板相連接,另外每一種接頭的3’端還帶有一個(gè)熒光標(biāo)記,可與熒光探針雜交,產(chǎn)生熒光信號(hào),該信號(hào)可以反映出接頭5’端與模板cDNA雜交的不同位置上的堿基信息,從而獲取模板cDNA的序列信息。(2)用DpnII酶切處理微球體上的cDNA模板,形成(4)分別加入能產(chǎn)生紅黃藍(lán)綠雜交信號(hào)的四套熒光探針,進(jìn)行雜交,每次雜交完畢用洗脫液清洗微球體陣列,除去上一輪雜交的熒光探針。用顯微拍照的方法記錄熒光信號(hào),并將四種信號(hào)的圖像輸入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存。(5)用II型限制性酶Bbv1進(jìn)一步消化cDNA模板,Bbv1能在距識(shí)別位點(diǎn)約13個(gè)堿基的位置切割cDNA雙鏈,并在cDNA模板上產(chǎn)生下4個(gè)堿基末端。(4)分別加入能產(chǎn)生紅黃藍(lán)綠雜交信號(hào)的四套熒光探針,進(jìn)行雜(6)洗脫除去寡核苷酸接頭,經(jīng)過Bbv1酶切后的cDNA模板,進(jìn)入下一輪分析。重復(fù)(3)～(5)的步驟4～5次后,分析所得到的16～20張熒光顯微照片,就可以讀出微球體陣列中每一個(gè)微球體上長(zhǎng)度為16～20bp的cDNA模板序列。(6)洗脫除去寡核苷酸接頭,經(jīng)過Bbv1酶切后的cDNA三者比較芯片無法同時(shí)大量地分析組織或細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的狀況，而且由于芯片技術(shù)需要準(zhǔn)備基因探針，所以可能漏掉那些未知的、表達(dá)豐度不高的、可能是很重要的調(diào)節(jié)基因。SAGE是近年來發(fā)展的以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的分析特定組織或細(xì)胞類型中基因群體表達(dá)狀態(tài)的一項(xiàng)技術(shù)。其顯著特點(diǎn)是快速高效地、接近完整地獲得基因組的表達(dá)信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表達(dá)情況，在疾病組織、癌細(xì)胞等差異表達(dá)譜的研究中，SAGE可以幫助獲得完整轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜、發(fā)現(xiàn)新的基因及其功能、作用機(jī)制和通路等信息。三者比較芯片無法同時(shí)大量地分析組織或細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的狀況，MPSS是對(duì)SAGE的改進(jìn)，它能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)全部基因的表達(dá)情況，是功能基因組研究的有效工具。因其需要配套的軟硬件較為昂貴，目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道不多。MPSS技術(shù)對(duì)于致病基因的識(shí)別、揭示基因在疾病中的作用、分析藥物的藥效等都非常有價(jià)值，該技術(shù)的發(fā)展將在基因組功能方面及其相關(guān)領(lǐng)域研究中發(fā)揮巨大的作用。MPSS是對(duì)SAGE的改進(jìn)，它能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)全4.RNA測(cè)序技術(shù)RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，就是把mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA等或者其中一些用高通量測(cè)序技術(shù)把它們的序列測(cè)出來。反映出它們的表達(dá)水平。優(yōu)點(diǎn)：（1）避免亞克隆引入的偏差；（2）測(cè)定序列更長(zhǎng)更精確；（3）可得到轉(zhuǎn)錄可變剪接序列；（4）準(zhǔn)確檢測(cè)低表達(dá)基因，定量轉(zhuǎn)錄水平。4.RNA測(cè)序技術(shù)RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，就是把mR藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)的意義以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。通過測(cè)序技術(shù)揭示造成差異的情況，已是目前最常用的手段。（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)的意義以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因第二節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用第二節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用一、藥靶候選基因的鑒定藥物靶標(biāo)是指體內(nèi)具有藥效功能并能被藥物作用的生物大分子，如某些蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子。那些編碼靶標(biāo)蛋白的基因也被稱為靶標(biāo)基因。事先確定靶向特定疾病有關(guān)的靶標(biāo)分子是現(xiàn)代新藥開發(fā)的基礎(chǔ)。一、藥靶候選基因的鑒定藥物靶標(biāo)是指體內(nèi)具有藥效功能并能被藥物發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的途徑有效單體化合物基因表達(dá)差異蛋白質(zhì)表達(dá)差異蛋白質(zhì)相互作用等基因表達(dá)和疾病發(fā)生發(fā)展有時(shí)間空間差異發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的途徑有效單體化合物基因表達(dá)和疾病發(fā)生發(fā)展有時(shí)間二、反義藥物和siRNA藥物（一）反義藥物反義技術(shù)(antisensetechnology)是通過堿基互補(bǔ)原理，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工乃至輸出和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等。根據(jù)結(jié)合部位的不同分為反義DNA（asDNA）、反義RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。二、反義藥物和siRNA藥物（一）反義藥物根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：

Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：

Ⅰ類反義RNA直接反義DNA是指能與靶DNA或靶RNA互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子，主要指反義寡核苷酸。核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類：(1)異體催化剪切型，如RNaseP；(2)自體催化的剪切型，如植物類病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA；(3)第一組內(nèi)含子自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA；(4)第二組內(nèi)含子自我剪接型。反義DNA是指能與靶DNA或靶RNA互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子反義藥物通常指反義寡核苷酸(ODNs),即其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA互補(bǔ),抑制或封閉基因的轉(zhuǎn)換和表達(dá),或誘導(dǎo)RnaseH識(shí)別或切割mRNA,使其喪失功能。反義藥物通常指反義寡核苷酸(ODNs),即其核苷酸序列可與反義藥物與傳統(tǒng)藥物的性質(zhì)和作用對(duì)象明顯不同表現(xiàn)為:

1、新的化學(xué)物質(zhì)-核酸；

2、新的藥物受體-mRNA，DNA；

3、新的受體結(jié)合方式-Watson-Crick雜交；

4、新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)-如RNaseH介導(dǎo)的靶RNA的降解。

反義藥物與傳統(tǒng)藥物的性質(zhì)和作用對(duì)象明顯不同表現(xiàn)為:反義藥物與傳統(tǒng)藥物相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、特異性較強(qiáng)。一個(gè)15聚體的反義寡核苷酸含有30-45氫鍵，而低分子的傳統(tǒng)藥物（200-600u）與靶點(diǎn)一般只形成1-4個(gè)鍵；2、信息量較大。遺傳信息從DNA-RNA-蛋白質(zhì)，用互補(bǔ)寡核苷酸阻斷某種蛋白的合成是很準(zhǔn)確的；3、反義藥物以核酸為靶點(diǎn)，與蛋白質(zhì)作為靶點(diǎn)比較，更易合理設(shè)計(jì)新藥物。4、比傳統(tǒng)藥物更具選擇性及效率，副作用可能更少。反義藥物與傳統(tǒng)藥物相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：（二）siRNA藥物小干擾RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）是一個(gè)長(zhǎng)21到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，可以阻斷異常蛋白的產(chǎn)生。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是由同源雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因沉寂，阻斷基因活性的現(xiàn)象。（二）siRNA藥物小干擾RNA（Small藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為siRNA設(shè)計(jì)應(yīng)注意：①物種特異性②靶標(biāo)一般在CDS區(qū)③siRNA的轉(zhuǎn)染效率siRNA設(shè)計(jì)應(yīng)注意：①物種特異性三、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥用植物中的應(yīng)用

四、轉(zhuǎn)錄組在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用三、轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥用植物中的應(yīng)用

四、轉(zhuǎn)錄組在代謝工程領(lǐng)域的第八章

藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)

第八章藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)

第一節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述第一節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述（一）轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來的可直接參與蛋白質(zhì)翻譯的mRNA（編碼RNA）總和，而其他所有非編碼RNA均可歸為RNA組（RNome）。（一）轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指生命單元（通常是1.轉(zhuǎn)錄組來自于基因組,量小得多但重要（人類基因組包含有30億個(gè)堿基對(duì)，其中大約只有3萬個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA分子，轉(zhuǎn)錄后的mRNA能被翻譯生成蛋白質(zhì)的也只占整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的40%左右）。2.轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。（二）轉(zhuǎn)錄組與基因組的關(guān)系1.轉(zhuǎn)錄組來自于基因組,量小得多但重要（人類基因組包含有30（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在整體水平上研究細(xì)胞編碼基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法：1.基因芯片技術(shù)2.基因表達(dá)系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)4.RNA測(cè)序技術(shù)（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在整體水平1.基因芯片技術(shù)基因芯片（genechip）又稱DNA芯片，指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。1.基因芯片技術(shù)基因芯片（genechip）又稱DNA按用途分表達(dá)譜芯片診斷芯片指紋圖譜芯片測(cè)序芯片毒理芯片芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)按用途分基因芯片的特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高序列數(shù)量大檢測(cè)效率高應(yīng)用范圍廣成本較低基因芯片的特點(diǎn)：DNA芯片技術(shù)步驟芯片制備實(shí)性材料：硅芯片、玻片和瓷片需進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團(tuán)。膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸DNA芯片技術(shù)步驟芯片制備樣品制備樣品分離純化DNA,mRNA擴(kuò)增PCR,RT—PCR，固相PCR標(biāo)記熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標(biāo)記樣品制備樣品分離純化分子雜交樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分子雜交樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。④檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號(hào)軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理④檢測(cè)分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光2.基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）是通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個(gè)EST（expresssequencedtags）來尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而比較完整地獲得基因組的表達(dá)信息。SAGE能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息，對(duì)已知基因進(jìn)行量化分析。SAGE也能應(yīng)用于尋找新基因。2.基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析（SerialAnalEST（ExpressedSequencetags，表達(dá)序列標(biāo)簽）是從已建好的cDNA庫(kù)中隨機(jī)抽取克隆，從5’末端或3’末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。EST（ExpressedSequencetags，表達(dá)SAGE的主要依據(jù)

第一，一個(gè)9～10堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認(rèn)一種轉(zhuǎn)錄物。第二，如果能將9堿基的標(biāo)簽集中于一個(gè)克隆中進(jìn)行測(cè)序，并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理，就能對(duì)數(shù)以千計(jì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析。SAGE的主要依據(jù)

第一，一個(gè)9～10堿基的短核苷酸序列標(biāo)簽SAGE的主要過程第一階段：SAGE文庫(kù)的構(gòu)建①以biotin-oligodT為引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)錨定酶（AnchoringEnzyme,AE）酶（如NlaⅢ、Sau3AⅠ等）切后收集cDNA的3’端部分。SAGE的主要過程第一階段：SAGE文庫(kù)的構(gòu)建anchor錨，靠山synthesis綜合物zyme酶，病菌enzyme酶anchor錨，靠山synthesis綜合物②將收集的3’端cDNA等分為兩部分，分別同接頭A、B相連接。每一種接頭的結(jié)構(gòu)都由PCR擴(kuò)增引物A或B的序列、標(biāo)簽酶識(shí)別位點(diǎn)和錨定酶識(shí)別位點(diǎn)三部分組成。標(biāo)簽酶（TaggingEnzyme,TE）是一種IIS類限制性內(nèi)切酶，如BsmFI等，它在距識(shí)別位點(diǎn)下游約20bp的位置切割DNA雙鏈。②將收集的3’端cDNA等分為兩部分，分別同接頭A、B相連接藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件③連接產(chǎn)物以標(biāo)簽酶酶切后用Klenow酶補(bǔ)平5’突出端，得到兩組分別帶有接頭A、B的短cDNA片段（約50bp）?；旌喜⑦B接兩組短cDNA片段，形成一個(gè)約100bp的雙標(biāo)簽體（ditag）群，并以引物A和B對(duì)其進(jìn)PCR擴(kuò)增。③連接產(chǎn)物以標(biāo)簽酶酶切后用Klenow酶補(bǔ)平5’突出端，得到

ample充足的amplifiy增強(qiáng)放大ample充足的amplifiy增強(qiáng)放大④用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化去除接頭后的雙標(biāo)簽體（約26bp），并使之相互連接成為大片段的連接體，克隆至質(zhì)粒載體內(nèi)形成一個(gè)SAGE文庫(kù)以備集中測(cè)序。④用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化去除接頭后的雙標(biāo)簽體（約26藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件第二階段：SAGE文庫(kù)的測(cè)序

第三階段：標(biāo)簽序列的提取

對(duì)測(cè)序得到的標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。在所測(cè)得序列中的每個(gè)雙標(biāo)簽體之間由錨定酶序列相間隔，每一標(biāo)簽序列是否出現(xiàn)以及出現(xiàn)的頻率將代表基因是否表達(dá)以及表達(dá)的水平。一般一個(gè)測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果可得到約20個(gè)雙標(biāo)簽體，亦即包含了約40個(gè)轉(zhuǎn)錄本的信息。

第二階段：SAGE文庫(kù)的測(cè)序

第三階段：標(biāo)簽序列的提取

3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)是以基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的新技術(shù)，其方法學(xué)基礎(chǔ)是一個(gè)標(biāo)簽序列（10-20bp）含有能夠特異識(shí)別轉(zhuǎn)錄子的信息，標(biāo)簽序列與長(zhǎng)的連續(xù)分子連接在一起，便于克隆與序列分析。通過定量測(cè)定可以提供相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)水平，也就是將mRNA的一端測(cè)出一個(gè)包含10-20個(gè)堿基的標(biāo)簽序列，每一個(gè)標(biāo)簽序列在樣品中的頻率（拷貝數(shù)）就代表了與該標(biāo)簽相應(yīng)的基因表達(dá)水平。3.大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)MPSS(m技術(shù)方法(1)首先將cDNA模板體外“克隆”到直徑5μm的微球體上?！翱寺　钡姆椒ㄖ饕抢萌斯ぴO(shè)計(jì)長(zhǎng)度不同的兩類互補(bǔ)寡核苷酸,分別與cDNA模板和微球體連接之后,再將cDNA模板與微球體連接起來。為了能裝載下細(xì)胞內(nèi)所有的cDNA模板(若以3～4×104個(gè)基因計(jì)算),寡核苷酸的數(shù)量至少應(yīng)該要比模板的量多100倍以上。技術(shù)方法(1)首先將cDNA模板體外“克隆”到直徑5μm藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件(2)用DpnII酶切處理微球體上的cDNA模板,形成粘性末端。(3)用含有II型限制性內(nèi)切酶Bbv1識(shí)別位點(diǎn)的不同寡核苷酸接頭與連接在微球體上的cDNA模板相連接,另外每一種接頭的3’端還帶有一個(gè)熒光標(biāo)記,可與熒光探針雜交,產(chǎn)生熒光信號(hào),該信號(hào)可以反映出接頭5’端與模板cDNA雜交的不同位置上的堿基信息,從而獲取模板cDNA的序列信息。(2)用DpnII酶切處理微球體上的cDNA模板,形成(4)分別加入能產(chǎn)生紅黃藍(lán)綠雜交信號(hào)的四套熒光探針,進(jìn)行雜交,每次雜交完畢用洗脫液清洗微球體陣列,除去上一輪雜交的熒光探針。用顯微拍照的方法記錄熒光信號(hào),并將四種信號(hào)的圖像輸入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存。(5)用II型限制性酶Bbv1進(jìn)一步消化cDNA模板,Bbv1能在距識(shí)別位點(diǎn)約13個(gè)堿基的位置切割cDNA雙鏈,并在cDNA模板上產(chǎn)生下4個(gè)堿基末端。(4)分別加入能產(chǎn)生紅黃藍(lán)綠雜交信號(hào)的四套熒光探針,進(jìn)行雜(6)洗脫除去寡核苷酸接頭,經(jīng)過Bbv1酶切后的cDNA模板,進(jìn)入下一輪分析。重復(fù)(3)～(5)的步驟4～5次后,分析所得到的16～20張熒光顯微照片,就可以讀出微球體陣列中每一個(gè)微球體上長(zhǎng)度為16～20bp的cDNA模板序列。(6)洗脫除去寡核苷酸接頭,經(jīng)過Bbv1酶切后的cDNA三者比較芯片無法同時(shí)大量地分析組織或細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的狀況，而且由于芯片技術(shù)需要準(zhǔn)備基因探針，所以可能漏掉那些未知的、表達(dá)豐度不高的、可能是很重要的調(diào)節(jié)基因。SAGE是近年來發(fā)展的以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的分析特定組織或細(xì)胞類型中基因群體表達(dá)狀態(tài)的一項(xiàng)技術(shù)。其顯著特點(diǎn)是快速高效地、接近完整地獲得基因組的表達(dá)信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表達(dá)情況，在疾病組織、癌細(xì)胞等差異表達(dá)譜的研究中，SAGE可以幫助獲得完整轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜、發(fā)現(xiàn)新的基因及其功能、作用機(jī)制和通路等信息。三者比較芯片無法同時(shí)大量地分析組織或細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的狀況，MPSS是對(duì)SAGE的改進(jìn)，它能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)全部基因的表達(dá)情況，是功能基因組研究的有效工具。因其需要配套的軟硬件較為昂貴，目前國(guó)內(nèi)外的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道不多。MPSS技術(shù)對(duì)于致病基因的識(shí)別、揭示基因在疾病中的作用、分析藥物的藥效等都非常有價(jià)值，該技術(shù)的發(fā)展將在基因組功能方面及其相關(guān)領(lǐng)域研究中發(fā)揮巨大的作用。MPSS是對(duì)SAGE的改進(jìn)，它能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)全4.RNA測(cè)序技術(shù)RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，就是把mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA等或者其中一些用高通量測(cè)序技術(shù)把它們的序列測(cè)出來。反映出它們的表達(dá)水平。優(yōu)點(diǎn)：（1）避免亞克隆引入的偏差；（2）測(cè)定序列更長(zhǎng)更精確；（3）可得到轉(zhuǎn)錄可變剪接序列；（4）準(zhǔn)確檢測(cè)低表達(dá)基因，定量轉(zhuǎn)錄水平。4.RNA測(cè)序技術(shù)RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，就是把mR藥物轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)的意義以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。通過測(cè)序技術(shù)揭示造成差異的情況，已是目前最常用的手段。（三）轉(zhuǎn)錄組學(xué)的意義以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因第二節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用第二節(jié)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用一、藥靶候選基因的鑒定藥物靶標(biāo)是指體內(nèi)具有藥效功能并能被藥物作用的生物大分子，如某些蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子。那些編碼靶標(biāo)蛋白的基因也被稱為靶標(biāo)基因。事先確定靶向特定疾病有關(guān)的靶標(biāo)分子是現(xiàn)代新藥開發(fā)的基礎(chǔ)。一、藥靶候選基因的鑒定藥物靶標(biāo)是指體內(nèi)具有藥效功能并能被藥物發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的途徑有效單體化合物基因表達(dá)差異蛋白質(zhì)表達(dá)差異蛋白質(zhì)相互作用等基因表達(dá)和疾病發(fā)生發(fā)展有時(shí)間空間差異發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的途徑有效單體化合物基因表達(dá)和疾病發(fā)生發(fā)展有時(shí)間二、反義藥物和siRNA藥物（一）反義藥物反義技術(shù)(antisensetechnology)是通過堿基互補(bǔ)原理，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工乃至輸出和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等。根據(jù)結(jié)合部位的不同分為反義DNA（asDNA）、反義RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。二、反義藥物和siRNA藥物（一）反義藥物根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：

Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：

Ⅰ類反義RNA直接反義DNA是指能與靶DNA或靶RNA互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子，主要指反義寡核苷酸。核酶(ribozyme)是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類：(1)異體催化剪切型，如RNaseP；(2)自體催化的剪切型，如植物類病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA；(3)第一組內(nèi)含子自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA；(4)第二組內(nèi)含子自我剪接型。反義DNA是指能與靶DNA或靶RNA互補(bǔ)結(jié)合的短小DNA分子反義藥物通常指反義寡核苷酸(ODNs),即其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA互補(bǔ),