蛋白質(zhì)的表達(dá)課件

ExpressionofproteinXuexiYangExpressionofproteinXuexiYan人工合成尿素自然界的礦物等無機物千年萬年，亙古不變，是沒有生命的；而有機物不同，是有生命的。無機物有機物（生命）動植物體內(nèi)存在著一種生命力，只有依靠這種生命力，才能產(chǎn)生出有機化合物，即有機物只能在有生命生物體內(nèi)產(chǎn)生。化學(xué)家在實驗室只能將有機物轉(zhuǎn)化為新的有機物，而不能用無機物制造出有機物。2NH4Cl+AgCNO—NH4CNO+AgCl

NH4CNO（熱）——（NH2）2CO有機化學(xué)第一人-維勒（1800-1882）

人工合成尿素自然界的礦物等無機物千年萬年，亙古不變，是沒有生蛋白質(zhì)的生物合成胰島素—有生物活性的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的生物合成胰島素—有生物活性的蛋白質(zhì)

Invitro

：invitroproteinsynthesissystem

ProkaryoticExpressionSystem-E.coli,B.subtilis

Invivoyeast

Eukaryotic

ExpressionSystem

insectcells

mammaliancellsⅠ.ExpressionsystemInvitro：invitroprotein香蕉與奶牛香蕉與奶牛Ⅱ.ProkaryoticExpressionSystem

Escherichia.coli,becauseofthewealthofknowledgeregardingitsbiochemistryandgeneticscanbeconsideredagoodfirstchoiceforthepreparationofproteins.However,E.colimightnotyieldproteinsuitableforanalysis,thenothersystemsmustbeexaminedⅡ.ProkaryoticExpressionSyst1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點。在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，與此同時，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？原核生物表達(dá)系統(tǒng)和2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法將真核基因克隆到1個強大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因處于原核啟動子的控制之下,轉(zhuǎn)錄物由于原核SDs能與核糖體rRNA結(jié)合,可在原核表達(dá).這是克服1,2困難的好辦法.從真核分離出mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,cDNA有完整的編碼順序,但無內(nèi)含子是采用偽裝辦法→將真核基因插到原核基因某密碼之后,其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽,這樣表達(dá)的融合蛋白,可躲避細(xì)菌蛋白酶降解作用.1.細(xì)菌RNApol不能識別真核的promotor,故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄.2.從真核轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列,不能結(jié)合到細(xì)菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白.3.真核基因有內(nèi)含子,而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNA不能形成,不能表達(dá)真核蛋白;4.表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解.2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法將真核3.大腸桿菌表達(dá)載體的組件復(fù)制起始點originofreplication選擇性基因selectionmarker多克隆位點MCS啟動子promoter終止子terminator核糖體結(jié)合位點ribosomebindingsite3.大腸桿菌表達(dá)載體的組件復(fù)制起始點originofrProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystem復(fù)制起始點

保證載體可以正確復(fù)制和增殖pBR322和pUC的復(fù)制起點，它們皆來源于ColE1質(zhì)粒質(zhì)粒具有不相容性通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子復(fù)制起始點

保證載體可以正確復(fù)制和增殖選擇性基因至少有一個選擇性基因，可用于轉(zhuǎn)化體的確定，并可在培養(yǎng)過程中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。LB倒板前加抗生素的溫度超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢選擇性基因至少有一個選擇性基因，可用于轉(zhuǎn)化體的確定，并可在培多克隆位點具有單一酶切位點的多克隆位點，便于外源基因的插入多克隆位點具有單一酶切位點的多克隆位點，便于外源基因的插入3.1啟動子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。-10區(qū)（pribnowbox）和

-35區(qū)組成分類轉(zhuǎn)錄形式組成型誘導(dǎo)型強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列。3.1啟動子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

啟動子Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理

具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）

正調(diào)節(jié)因子CAP

負(fù)調(diào)節(jié)因子

lacIIPTG誘導(dǎo)啟動子--LacLac表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

IPTG誘導(dǎo)啟動子--LacLac表達(dá)系統(tǒng)lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAPlacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac表達(dá)系統(tǒng)

正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與

lac操縱子上專一位點結(jié)合后，能促進(jìn)RNA聚合酶與–35、–10序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Plac

介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPlacIPlacLac表達(dá)系統(tǒng)lacUV5突變體PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受

lacI的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時比野生型Plac更易操作。Lac表達(dá)系統(tǒng)Lac表達(dá)系統(tǒng)

負(fù)調(diào)節(jié)因子

lacI在無誘導(dǎo)物情形下，

lacI

基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。lacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNALac表達(dá)系統(tǒng)lacIP轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá)IAA誘導(dǎo)啟動子--TrpTrp表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

IAA誘導(dǎo)啟動子--TrpTrp表達(dá)系統(tǒng)Trp表達(dá)系統(tǒng)

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Trp表達(dá)系統(tǒng)Tac表達(dá)系統(tǒng)tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于

trp和lacUV5

啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

雜合啟動子--TacTac表達(dá)系統(tǒng)啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PL

和PR

表達(dá)系統(tǒng)

以l噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR

為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

在野生型l噬菌體中，PL、PR

啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了l噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。溫度誘導(dǎo)啟動子--PL和PRPL和PR表達(dá)系統(tǒng)溫度誘導(dǎo)啟動子--PL和PRPL

和PR

表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理由

l噬菌體PE啟動子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物。cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細(xì)胞因子來控制cI

基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。

因此PL、PR表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落PL和PR表達(dá)系統(tǒng)

T7表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。最常用啟動子--T7T7表達(dá)系統(tǒng)最常用啟動子--T7T7表達(dá)系統(tǒng)

T7噬菌體編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。

在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。T7表達(dá)系統(tǒng)T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。

T7RNA聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNAT7啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為

化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG誘導(dǎo)T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA聚合酶基因lac啟動T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

溫度誘導(dǎo)型

PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)cI857T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA聚合酶基因PL啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

雙質(zhì)粒系統(tǒng)一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRT7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA熱誘導(dǎo)T7啟動子3.2TheTerminatorStopsRNAsynthesisatspecificpointsalongtheDNAtemplateTheenzymestopspolymerisingnucleotidesintoRNA,releasestheRNAchainandleavestheDNAtoeventuallyreinitiateatanotherpromoter.Features:AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20nucleotidesbeforetheendoftheRNAthisleadstoatranscriptthatcanformanhairpinloopRunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhicharetranscribedintoUsattheendoftheRNA3.2TheTerminatorStopsRNAHowcouldthesetwostructural

featurescausetermination?Howcouldthesetwostructural強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性終止子強終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子強終止子的選擇與使用終止子核糖體結(jié)合位點外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）

3.3核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點3.3核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點4.常見原核表達(dá)系統(tǒng)面面俱到Novagen

因為純化愛上你

--GE（原安瑪西亞）

更快克隆Invitrogen

4.常見原核表達(dá)系統(tǒng)面面俱到Novagen面面俱到Novagen

面面俱到Novagen面面俱到Novagen

是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用pETBlue系列載體除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式Novagen提供菌株種類多種菌株:BL21,Rosetta,Origami除了常用培養(yǎng)基LB、TB、M9、M9ZB等：可以直接進(jìn)行過夜培養(yǎng)培養(yǎng)基OvernightExpress?AutoinductionSystemNovagen還有表達(dá)雙外源蛋白的載體pCDFDuet-1DNA、pETDuet?-1DNA、pRSFDuet-1DNA：最多可以同時表達(dá)8個外源蛋白有許多不同系列的載體、菌株供選擇；與原核表達(dá)的各種相關(guān)產(chǎn)品都一應(yīng)俱全：載體、菌株、培養(yǎng)基、檢測表達(dá)的抗體、純化產(chǎn)品面面俱到Novagen是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇抗性和標(biāo)簽抗性和標(biāo)簽BL21:lon,ompT

BL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gami

OrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)菌株種類BL21:lon,ompT菌株種類菌株種類蛋白酶缺陷型

都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，這包括有BL21,Origami?,Rosetta?。可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá)

Origami?B和Rosetta?這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。蛋白表達(dá)濃度可以隨著IPTG濃度而改變。通過對IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或者大量表達(dá)。

二硫鍵形成與溶解性增強

Novagen專門設(shè)計了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（gor）和/或硫氧還蛋白還原酶（trxB）缺陷型的，包括BL21trxB，Origami，OrigamiB和Rosetta-gami??？梢愿蟪潭却龠M(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。稀有密碼子的補給

Rosetta?是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子tRNA。硒蛋氨酸標(biāo)記

B834是來源于BL21的蛋氨酸（met）營養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35S-met標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。菌株種類蛋白酶缺陷型

都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）作為蛋白純化的專家,GE的原核表達(dá)系統(tǒng)以便于產(chǎn)物純化而見長。融合表達(dá)系統(tǒng)的pGEX是我們極為熟悉的GST親和純化表達(dá)系統(tǒng),其表達(dá)產(chǎn)物純化體系已經(jīng)非常成熟。選擇表達(dá)系統(tǒng)的時，表達(dá)后的純化方法是必需考慮的非常重要的問題。因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）作為蛋白純化的專家,GE因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare)安瑪西亞：ECL，Sepharose、Sephadex因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEH因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）GST是一個高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到一種促進(jìn)表達(dá)量提高的作用。對于表達(dá)分子量小的目標(biāo)蛋白來說選擇GST就比6xHistag更有優(yōu)勢GST純化填料的專一性則非常高因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）GST是一個高度可溶的蛋白因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）GST系列總共有13個載體。有9個的多克隆位點是擴(kuò)展過的，有6個限制性酶切位點。載體上都有將GST切割下來的蛋白酶識別位點，可以分成T系列、X系列和P系列，分別采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE的PreScission?蛋白酶。pGEX所有載體都提供了三種不同的翻譯讀碼框選擇；都是利用乳糖操縱子調(diào)控模式，啟動子都是Ptac。因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）GST系列總共有13個載體因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）在表達(dá)后的檢測和純化方面，GE醫(yī)療的產(chǎn)品堪稱經(jīng)典：WesternBlot檢測表達(dá)，純化親和層析柱，即使GE醫(yī)療沒有6×組氨酸標(biāo)記的載體，但是6×組氨酸親和純化相關(guān)產(chǎn)品卻絕對出色純化是表達(dá)后絕對不可小視的一步。所以，“因為純化愛上你”，就是選擇pGEX的最好理由吧！因為純化愛上你:GE（原安瑪西亞）在表達(dá)后的檢測和純化方面，更快克隆InvitrogenInvitrogen是TA克隆的創(chuàng)始者定向TOPO克隆完全不需要酶切和傳統(tǒng)連接反應(yīng)，五分鐘就可以做出一個克隆。其他載體主要用傳統(tǒng)的酶切、鏈接方式做重組質(zhì)粒，Invitrogen的表達(dá)系統(tǒng)大量運用TOPO技術(shù)和Gateway技術(shù)Invitrogen有四個原核表達(dá)系統(tǒng)：Champion?pETExpressionSystem、HisPatchThioFusionSystem、pBADInducibleBacterialSystem、pLSystem和T7-basedSystems。幾乎囊括所有啟動子。更快克隆InvitrogenInvitrogen是TA克隆的5.表達(dá)前的分析比什么都重要翻譯起始位點GC含量二級結(jié)構(gòu)基因或者蛋白的大小親疏水性成功的實驗都是一樣的，失敗的實驗各有各的不幸。5.表達(dá)前的分析比什么都重要翻譯起始位點成功的實驗都是一樣6.避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對策構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)6.避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對策構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)7.大腸桿菌表達(dá)研究四重境界初次嘗試掃盲篇亂棍打棗入門篇系統(tǒng)優(yōu)化中級篇自成一體高手篇7.大腸桿菌表達(dá)研究四重境界初次嘗試掃盲篇ⅢEukaryotic

ExpressionSystem1.YeastExpressionSystems2.BaculovirusExpressionSystems3.AnimalcellsExpressionSystemsⅢEukaryoticExpressionSystem1.酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點，還具有原核表達(dá)系統(tǒng)所不具有的對外源蛋白的翻譯后修飾等特點。最先被研究和應(yīng)用的是釀酒酵母體系，但釀酒酵母系統(tǒng)由于缺乏強有力的啟動子、分泌效率差、表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等缺點，逐漸被甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)代替，其中畢赤酵母應(yīng)用最為廣泛。1.酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點優(yōu)點：1）含有強有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；2）表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)。3）發(fā)酵工藝成熟。已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點優(yōu)點：1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點缺點：利用易燃的甲醇做原料，表達(dá)產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮篩選藥物價格昂貴也給生產(chǎn)應(yīng)用帶來局限信號肽加工不完全，修飾功能欠完善以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象，給外源蛋白的純化和工業(yè)化帶來了困難。1.1畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點缺點：1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母（methylotrophicyeast)

指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。畢赤酵母（Pichiapastoris)漢森酵母（Hansenulaploymorpha)假絲酵母（Candiaboidinii)1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母（methylotr1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)

1.2甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶啟動子1.3畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)模式載體1.3畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)模式載體1.4選擇標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記His4、Ura3、Leu2抗性選擇標(biāo)記G418、Amp1.4選擇標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記2.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒只來源于無脊椎動物。

基因組為單一閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為80～160kb，其基因組可在昆蟲細(xì)胞核復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

用作外源基因表達(dá)載體的桿狀病毒，目前僅限于核型多角體病毒

多角體基因缺失后，并不影響后代病毒的感染與復(fù)制，意味著重組病毒不需要輔助病毒的功能。

2.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒只來源于無脊椎動物。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理NPV基因組巨大，不適于體外操作，需構(gòu)建一個能與NPV基因組DNA重組的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體上含有多角體蛋白基因的啟動子及多角體蛋白基因的旁側(cè)序列。將目的基因克隆至轉(zhuǎn)移載體的多接頭的合適酶切位點處，使其處于多角體基因啟動子的控制之下。重組轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，目的基因通過細(xì)胞內(nèi)同源重組而插入病毒基因組中。利用空斑形態(tài)的差異進(jìn)行篩選、純化重組病毒，再以純化的重組病毒感染昆蟲細(xì)胞，即可獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理NPV基因組巨大，不適于體外操作，需構(gòu)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：修飾的位點與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全一致，但修飾的寡糖種類卻不完全一樣。表達(dá)水平高：與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50％。能容納大分子的插入片段：能同時表達(dá)多個基因：既可采用不同的重組病毒同時感染細(xì)胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。不足：非連續(xù)性表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物的糖基化相對簡單，多不分支。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能：表達(dá)產(chǎn)物與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。與大腸桿菌相比，哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)水平低、獲得高表達(dá)細(xì)胞株所需的時間長、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的成本高等導(dǎo)致哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的成本較高。3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄后修飾的基因研究蛋白的生物合成和體內(nèi)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運機制表達(dá)大腸桿菌和酵母不能表達(dá)的含有內(nèi)含子的基因序列

哺乳動物細(xì)胞是最理想的表達(dá)人類基因的系統(tǒng)，應(yīng)為首選。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄后修飾的基因哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)（Invitrotranslationsystem）又稱之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(invitroproteinsynthesissystem)，是一種細(xì)胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)加入外源mRNA，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS—PAGE后可檢測出翻譯活性。

常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種：

1.兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物(reticylocytelysatesystem)2.

小麥胚抽提物(wheatgermextract)3.

兩棲動物卵母細(xì)胞4.原核體外翻譯系統(tǒng)Ⅳ

體外翻譯系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)（Invitrotranslationsy蛋白質(zhì)的表達(dá)課件ⅤCommonlyconfrontedquestionsShouldtheprotein(s)beexpressedinbacteria,inyeast,ininsectcellsorinhumancells?Whichexpressionvectorshouldbeused?Ifbacterialexpressionisused,whichstrain(s)shouldbechosen?Shouldoneexpressthefulllengthproteinorafragmentthereof?Shouldtheproteinbetagged,andwhichaffinitytagisthebest?Whatisagoodpurificationstrategy,andwhatarethecommonpitfalls?ⅤCommonlyconfrontedquestionUnfortunately,becauseeveryproteinisdifferent,therecanbeno‘right’answertoanyofthesequestionsapriori.Unfortunately,becauseeverypHowtochooseproteinexpressionsystemChoiceofhost(system)ChoiceofvectorChoiceoftagChoiceofstrainsHowtochooseproteinexpressi1.Choiceofhostbacteria,fungi,plants,insectormammaliancellsgrowninculture,andtransgenicanimalsorplants“MyExpressionSystemisBetterthanYours”Syndrome--Thereisnooneexpressionsystemthatdoeseverythingwell,Eachsystemhasitsstrengthsandweaknesses1.Choiceofhostbacteria,funTheamountandthedegreeofpurityoftheproduct,aswellasitsbiologicalintegrityandpotentialtoxicityshouldbeconsidered.TheexpressionofeachcDNAorgenepresentsitsownpeculiarsetofproblems.Thesynthesisofforeignproteinisstilllargelyempirical.Theamountandthedegreeofp2.ChoiceofvectorThechoiceofvectorfamilyislargelygovernedbythehost.Theexpressionofarecombinantproteinfusedtoatagofknownsizeandbiologicalfunctioncangreatlysimplifysubsequentpurificationanddetection2.ChoiceofvectorThechoiceExpressionoffusionproteinsAdvantages:1.foreignproteinsareoftenrapidlydegradedbyhostprotease,andthismaysometimesbeavoidedbyagenefusionstrategy.2.Generalandefficientpurificationschemesmaybeobtainedwhichallowrapidrecoveryofgeneproducts.3.theproteinscanbelocalisedtodifferentcompartmentsofthehostcell(periplasm,cellwall,culturemedium)throughspecificpeptidesfusedtotheprotein.ExpressionoffusionproteinsADisadvantagesThefusionpeptidemaypreventthecorrectfoldingoftherecombinantproteinandalteritsproperties.Forthatreasonthebacterialsegmentshouldberemovable,usuallychemicallyorenzymatically.EvenafterremovalofthefusionpeptidesomeproteinshavebeenunabletoachievethecorrectfoldingDisadvantages3.ChoiceoftagThetwomostcommonlyusedtagsare(histidine)6andGST3.ChoiceoftagThetwomostc4.ChoiceofstrainsBL21:lon,ompT

BL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gami

OrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)4.ChoiceofstrainsBL21:lon,ExpressionofproteinXuexiYangExpressionofproteinXuexiYan人工合成尿素自然界的礦物等無機物千年萬年，亙古不變，是沒有生命的；而有機物不同，是有生命的。無機物有機物（生命）動植物體內(nèi)存在著一種生命力，只有依靠這種生命力，才能產(chǎn)生出有機化合物，即有機物只能在有生命生物體內(nèi)產(chǎn)生。化學(xué)家在實驗室只能將有機物轉(zhuǎn)化為新的有機物，而不能用無機物制造出有機物。2NH4Cl+AgCNO—NH4CNO+AgCl

NH4CNO（熱）——（NH2）2CO有機化學(xué)第一人-維勒（1800-1882）

人工合成尿素自然界的礦物等無機物千年萬年，亙古不變，是沒有生蛋白質(zhì)的生物合成胰島素—有生物活性的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的生物合成胰島素—有生物活性的蛋白質(zhì)

Invitro

：invitroproteinsynthesissystem

ProkaryoticExpressionSystem-E.coli,B.subtilis

Invivoyeast

Eukaryotic

ExpressionSystem

insectcells

mammaliancellsⅠ.ExpressionsystemInvitro：invitroprotein香蕉與奶牛香蕉與奶牛Ⅱ.ProkaryoticExpressionSystem

Escherichia.coli,becauseofthewealthofknowledgeregardingitsbiochemistryandgeneticscanbeconsideredagoodfirstchoiceforthepreparationofproteins.However,E.colimightnotyieldproteinsuitableforanalysis,thenothersystemsmustbeexaminedⅡ.ProkaryoticExpressionSyst1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點。在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA，與此同時，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。1.基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？原核生物表達(dá)系統(tǒng)和2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法將真核基因克隆到1個強大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因處于原核啟動子的控制之下,轉(zhuǎn)錄物由于原核SDs能與核糖體rRNA結(jié)合,可在原核表達(dá).這是克服1,2困難的好辦法.從真核分離出mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,cDNA有完整的編碼順序,但無內(nèi)含子是采用偽裝辦法→將真核基因插到原核基因某密碼之后,其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽,這樣表達(dá)的融合蛋白,可躲避細(xì)菌蛋白酶降解作用.1.細(xì)菌RNApol不能識別真核的promotor,故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄.2.從真核轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列,不能結(jié)合到細(xì)菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白.3.真核基因有內(nèi)含子,而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNA不能形成,不能表達(dá)真核蛋白;4.表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定,易被細(xì)菌蛋白酶降解.2.真核基因在原核系統(tǒng)表達(dá)的困難及其解決方法將真核3.大腸桿菌表達(dá)載體的組件復(fù)制起始點originofreplication選擇性基因selectionmarker多克隆位點MCS啟動子promoter終止子terminator核糖體結(jié)合位點ribosomebindingsite3.大腸桿菌表達(dá)載體的組件復(fù)制起始點originofrProkaryoticExpressionSystemProkaryoticExpressionSystem復(fù)制起始點

保證載體可以正確復(fù)制和增殖pBR322和pUC的復(fù)制起點，它們皆來源于ColE1質(zhì)粒質(zhì)粒具有不相容性通常表達(dá)載體都會選用高拷貝的復(fù)制子復(fù)制起始點

保證載體可以正確復(fù)制和增殖選擇性基因至少有一個選擇性基因，可用于轉(zhuǎn)化體的確定，并可在培養(yǎng)過程中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。LB倒板前加抗生素的溫度超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢選擇性基因至少有一個選擇性基因，可用于轉(zhuǎn)化體的確定，并可在培多克隆位點具有單一酶切位點的多克隆位點，便于外源基因的插入多克隆位點具有單一酶切位點的多克隆位點，便于外源基因的插入3.1啟動子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。-10區(qū)（pribnowbox）和

-35區(qū)組成分類轉(zhuǎn)錄形式組成型誘導(dǎo)型強弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列。3.1啟動子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

啟動子Ptac=3Ptrp=11Plac啟動子-轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理

具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）

正調(diào)節(jié)因子CAP

負(fù)調(diào)節(jié)因子

lacIIPTG誘導(dǎo)啟動子--LacLac表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

IPTG誘導(dǎo)啟動子--LacLac表達(dá)系統(tǒng)lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄cAMPCAPlacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄Lac表達(dá)系統(tǒng)

正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP復(fù)合物與

lac操縱子上專一位點結(jié)合后，能促進(jìn)RNA聚合酶與–35、–10序列的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Plac

介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPlacIPlacLac表達(dá)系統(tǒng)lacUV5突變體PlacUV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受

lacI的調(diào)控，因此用它構(gòu)建的表達(dá)載體在使用時比野生型Plac更易操作。Lac表達(dá)系統(tǒng)Lac表達(dá)系統(tǒng)

負(fù)調(diào)節(jié)因子

lacI在無誘導(dǎo)物情形下，

lacI

基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。lacI

PlaclacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄lacI

PlaclacO

lacZlacYlacA高效轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶IPTGmRNALac表達(dá)系統(tǒng)lacIP轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá)IAA誘導(dǎo)啟動子--TrpTrp表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌trp操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

IAA誘導(dǎo)啟動子--TrpTrp表達(dá)系統(tǒng)Trp表達(dá)系統(tǒng)

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉(zhuǎn)錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Trp表達(dá)系統(tǒng)Tac表達(dá)系統(tǒng)tac啟動子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。

調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高于

trp和lacUV5

啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用tac啟動子比用lacUV5啟動子更優(yōu)越。啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

雜合啟動子--TacTac表達(dá)系統(tǒng)啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PL

和PR

表達(dá)系統(tǒng)

以l噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL、PR

為核心構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)

在野生型l噬菌體中，PL、PR

啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了l噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。溫度誘導(dǎo)啟動子--PL和PRPL和PR表達(dá)系統(tǒng)溫度誘導(dǎo)啟動子--PL和PRPL

和PR

表達(dá)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理由

l噬菌體PE啟動子控制的cI基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏物。cI基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細(xì)胞因子來控制cI

基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。

因此PL、PR表達(dá)系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cI857(ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。

在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落PL和PR表達(dá)系統(tǒng)

T7表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)稱為T7表達(dá)系統(tǒng)。最常用啟動子--T7T7表達(dá)系統(tǒng)最常用啟動子--T7T7表達(dá)系統(tǒng)

T7噬菌體編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。

在細(xì)胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達(dá)到很高的水平。T7表達(dá)系統(tǒng)T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式。

T7RNA聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNAT7啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為

化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶IPTG誘導(dǎo)T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA聚合酶基因lac啟動T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

溫度誘導(dǎo)型

PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達(dá)對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)cI857T7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA聚合酶基因PL啟動子T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

雙質(zhì)粒系統(tǒng)一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記不能相同調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7RNA聚合酶熱誘導(dǎo)T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRT7表達(dá)系統(tǒng)T7RNA熱誘導(dǎo)T7啟動子3.2TheTerminatorStopsRNAsynthesisatspecificpointsalongtheDNAtemplateTheenzymestopspolymerisingnucleotidesintoRNA,releasestheRNAchainandleavestheDNAtoeventuallyreinitiateatanotherpromoter.Features:AdyadsymmetryintheDNA,centered15to20nucleotidesbeforetheendoftheRNAthisleadstoatranscriptthatcanformanhairpinloopRunofaboutsixAsintheDNAtemplatewhicharetranscribedintoUsattheendoftheRNA3.2TheTerminatorStopsRNAHowcouldthesetwostructural

featurescausetermination?Howcouldthesetwostructural強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率終止子強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性終止子強終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子強終止子的選擇與使用終止子核糖體結(jié)合位點外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）

3.3核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點3.3核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列

5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點4.常見原核表達(dá)系統(tǒng)面面俱到Novagen

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