2大腸菌群課件

食品中大腸菌群的測(cè)定食品中大腸菌群的測(cè)定一大腸菌群的概念及組成大腸菌群的概念大腸菌群系指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。?大腸菌群的組成大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。?一大腸菌群的概念及組成大腸菌群的概念大腸菌群系指一群需氧及兼二、大腸菌群的測(cè)定意義1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿菌2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因（1）在糞便中數(shù)量最大；（2）在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；（3）檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。?二、大腸菌群的測(cè)定意義1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿二、大腸菌群的測(cè)定意義3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）判斷食品中否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過(guò)程中的衛(wèi)生狀況。?二、大腸菌群的測(cè)定意義3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）判斷食品中三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣3.培養(yǎng)特性：在ＥＭＢ瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)。?三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征麥康凱瓊脂平板照片麥康凱瓊脂平板照片中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)2010-03-26發(fā)布2010-06-01實(shí)施中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3—2010食品安全國(guó)前言????????本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.3-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.3-2008相比，主要修改如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——“第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15CFU～150CFU”；——?jiǎng)h除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法”。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-2003、GB/T4789.3-2008。前言????????本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.3-200食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)????????1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2術(shù)語(yǔ)和定義2.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。2.2最可能數(shù)mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)????????3設(shè)備和材料????????????除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。3.9無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計(jì)數(shù)器。3設(shè)備和材料????????????除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌4培養(yǎng)基和試劑???????4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。4.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。4.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。4.5無(wú)菌生理鹽水：見附錄A中A.5。4.6無(wú)菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。4.7無(wú)菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。4培養(yǎng)基和試劑???????4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法??5檢驗(yàn)程序大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見下圖1。第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法??5檢驗(yàn)程序大腸菌群MPN計(jì)2大腸菌群課件6操作步驟????6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。6.1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。6操作步驟????6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固??6.1.4用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min。??6.1.4用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:106.2初發(fā)酵試驗(yàn)?每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。6.2初發(fā)酵試驗(yàn)?每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品6.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)?用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。6.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)?用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告?按6.3確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告?按6.3確證的大腸第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法??7檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法??7檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的8操作步驟??????8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.2平板計(jì)數(shù)8.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。8.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。8操作步驟??????8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.??????8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。8.4證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。??????8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU8.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告??經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）5=6.0×10CFU/g（mL）。8.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告??經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑?????????????A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑?????????????AA.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯????????????A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯????????????A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）?????????????A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過(guò)3h。A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）??????????A.4磷酸鹽緩沖液????????A.4.1成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2A.4.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。A.4磷酸鹽緩沖液????????A.4.1成分磷酸二氫附錄B（規(guī)范性附錄）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表??B.1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表每g（mL）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的檢索見表B.1。附錄B（規(guī)范性附錄）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表??B.2大腸菌群課件結(jié)束！結(jié)束！食品中大腸菌群的測(cè)定食品中大腸菌群的測(cè)定一大腸菌群的概念及組成大腸菌群的概念大腸菌群系指一群需氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。?大腸菌群的組成大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和陰溝腸桿菌。?一大腸菌群的概念及組成大腸菌群的概念大腸菌群系指一群需氧及兼二、大腸菌群的測(cè)定意義1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿菌2、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因（1）在糞便中數(shù)量最大；（2）在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；（3）檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。?二、大腸菌群的測(cè)定意義1、糞便污染的指標(biāo)菌：大腸菌群或大腸桿二、大腸菌群的測(cè)定意義3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）判斷食品中否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過(guò)程中的衛(wèi)生狀況。?二、大腸菌群的測(cè)定意義3、大腸菌群的測(cè)定意義（1）判斷食品中三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣3.培養(yǎng)特性：在ＥＭＢ瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)。?三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌革蘭氏染色鏡下照片糖發(fā)酵試驗(yàn)大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的特征麥康凱瓊脂平板照片麥康凱瓊脂平板照片中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)2010-03-26發(fā)布2010-06-01實(shí)施中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3—2010食品安全國(guó)前言????????本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.3-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.3-2008相比，主要修改如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——“第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15CFU～150CFU”；——?jiǎng)h除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法”。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-2003、GB/T4789.3-2008。前言????????本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.3-200食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)????????1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2術(shù)語(yǔ)和定義2.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。2.2最可能數(shù)mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)????????3設(shè)備和材料????????????除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。3.9無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計(jì)數(shù)器。3設(shè)備和材料????????????除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌4培養(yǎng)基和試劑???????4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。4.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。4.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。4.5無(wú)菌生理鹽水：見附錄A中A.5。4.6無(wú)菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。4.7無(wú)菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。4培養(yǎng)基和試劑???????4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法??5檢驗(yàn)程序大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見下圖1。第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法??5檢驗(yàn)程序大腸菌群MPN計(jì)2大腸菌群課件6操作步驟????6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。6.1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。6操作步驟????6.1樣品的稀釋6.1.1固體和半固??6.1.4用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min。??6.1.4用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:106.2初發(fā)酵試驗(yàn)?每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。6.2初發(fā)酵試驗(yàn)?每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品6.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)?用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。6.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)?用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告?按6.3確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。6.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告?按6.3確證的大腸第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法??7檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法??7檢驗(yàn)程序大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的8操作步驟??????8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.2平板計(jì)數(shù)8.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。8.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。8操作步驟??????8.1樣品的稀釋按6.1進(jìn)行。8.??????8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。8.4證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。??????8.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU8.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告??經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）5=6.0×10CFU/g（mL）。8.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告??經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑?????????????A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121