分子生物學(xué)研究方法課件

分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理

1．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)

將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳(A分子生物學(xué)研究方法課件2．核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）2．核酸的分子雜交技術(shù)核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱(chēng)為核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線(xiàn)印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；

2.將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱(chēng)這類(lèi)核酸雜交為印跡雜交。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移分子生物學(xué)研究方法課件分子生物學(xué)研究方法課件3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱(chēng)做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。

3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化4．DNA序列分析a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；DNA聚合酶常用Klenow大片段，無(wú)5'→3'外切酶活性。②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP。4．DNA序列分析分子生物學(xué)研究方法課件雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖分子生物學(xué)研究方法課件b．DNA序列分析自動(dòng)化(分析反應(yīng)\讀片過(guò)程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后,用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。b．DNA序列分析自動(dòng)化(分析反應(yīng)\讀片過(guò)程)DNA測(cè)序的全過(guò)程(實(shí)際)DNA測(cè)序的全過(guò)程(實(shí)際)5．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過(guò)程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。如：盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。5．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutag6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(Gelretardationassay)，又稱(chēng)DNA遷移率變化試驗(yàn)(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯b．DNaseI印跡試驗(yàn)（DNaseIfootprinting）主要步驟：

①用32P標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；

②加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；

③加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。

這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證每一條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯斷裂！

④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；

⑤進(jìn)行DNA凝膠分析。

如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶,而是出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域,形象地稱(chēng)為足跡。b．DNaseI印跡試驗(yàn)（DNaseIfootp7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1983年由美國(guó)科學(xué)家KaryMullis提出，1993年因此而獲諾貝爾獎(jiǎng)。PCR技術(shù)是指通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開(kāi)車(chē)去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis開(kāi)車(chē)的時(shí)候,瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車(chē)和對(duì)面開(kāi)來(lái)的車(chē)象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成.DNA，……Mullis開(kāi)車(chē)的時(shí)候,瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒(méi)有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來(lái)解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐熱DNA聚合酶模板DNA

變性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃?；疽?cái)U(kuò)增步驟PCR的基本原理引物變性（denaturation）：9分子生物學(xué)研究方法課件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR擴(kuò)增特異性DNA片段全過(guò)程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物學(xué)研究方法課件PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通過(guò)PCR過(guò)程聚合成互補(bǔ)鏈DNA。貯存濃度：2.5mM使用濃度：200μM使用濃度不當(dāng)會(huì)影響擴(kuò)增的產(chǎn)量、特異性和保真度。PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、緩沖液（buffer）標(biāo)準(zhǔn)10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、緩沖液（buffer）標(biāo)準(zhǔn)10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用濃度為0.1μM~1.0μM之間。引物濃度太低，擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。一般貯存濃度：10μM

使用濃度：0.4μM引物設(shè)計(jì)要求:

設(shè)計(jì)的引物的核苷酸序列必須與模板鏈3’端的一段核苷酸序列互補(bǔ),且3’端必須有游離的-OH基團(tuán)；引物一般由20~30個(gè)核苷酸組成，4種核苷酸盡可能隨機(jī)分布，GC含量應(yīng)達(dá)40~60%；引物中應(yīng)盡量避免回紋序列出現(xiàn)；引物中最好含有進(jìn)一步操作中可利用的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列。3、引物（primer）最佳引物使用濃度為0.Tm（解鏈溫度）值的計(jì)算公式：引物長(zhǎng)度＜20nt時(shí)：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物長(zhǎng)度＞20nt時(shí)：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR過(guò)程中選擇退火溫度時(shí)，一般為（Tm－5）℃Tm（解鏈溫度）值的計(jì)算公式：引物長(zhǎng)度＜20nt時(shí)：Tm=44、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個(gè)待擴(kuò)增的特定雙鏈DNA片段，應(yīng)知道其兩端20~30bp的核苷酸序列，供設(shè)計(jì)一對(duì)引物之用。PCR的模板是一條單鏈DNA片段，其3’端具有與引物雜交的序列。4、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個(gè)待擴(kuò)增的特定雙5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

來(lái)自嗜熱古細(xì)菌Thermusaquaticus。該菌1967年從溫泉中分離，最適生長(zhǎng)溫度70℃。現(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為94×103，為單分子酶，具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性和較弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。合成出錯(cuò)幾率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

來(lái)自喜溫性古細(xì)菌Pyrococcuswoesei?，F(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為90×103，具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐熱性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶來(lái)自喜溫性真細(xì)菌ThermusthermophilusHB8。具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。Mg2+存在時(shí)，以DNA為模板合成DNA，Mn2+存在時(shí)，可以RNA為模板合成cDNA，用于RT-PCR系統(tǒng)。VentDNA聚合酶來(lái)自嗜熱高溫球菌Thermococcuslitoralis

。相對(duì)分子質(zhì)量85×103。100℃時(shí)該酶半衰期為1.8hr，具有3’→5’外切酶校對(duì)活性。合成的準(zhǔn)確度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶來(lái)自激烈熱球菌Pyrococcusfariosus。保真度較高。TthDNA聚合酶來(lái)自喜溫性真細(xì)菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有強(qiáng)力的3’→5’核酸外切酶活性，與TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐熱性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小時(shí)的熱處理后仍可保持約70％的活性，故根據(jù)需要可以將熱變性步驟的溫度設(shè)定值提得更高，這對(duì)處理GC含量高的模板等具有特異性高級(jí)結(jié)構(gòu)的樣品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有強(qiáng)力的3’→5’核酸外PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5min；90～98℃變性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循環(huán)PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期出現(xiàn)的時(shí)間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進(jìn)行20次擴(kuò)增后進(jìn)入平臺(tái)期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當(dāng)采用TaqDNA聚合酶時(shí)，擴(kuò)增25次后才進(jìn)入平臺(tái)期，拷貝數(shù)可達(dá)4×106。出現(xiàn)平臺(tái)期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指將外源基因經(jīng)過(guò)剪切加工，再插入到一個(gè)具有自我復(fù)制能力的載體DNA中，就得到重組DNA，再將重組DNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)寄主細(xì)胞中，外源基因就可以隨著寄主細(xì)胞的分裂進(jìn)行繁殖，寄主細(xì)胞也借此獲得外源基因所攜帶的新特性。

第二節(jié)基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點(diǎn)：

①基本程序：

分—切—接—轉(zhuǎn)—篩

2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點(diǎn)：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物學(xué)研究方法課件②技術(shù)特點(diǎn)：

1.可在體外根據(jù)需要進(jìn)行人工的、有目的的基因重組、表達(dá)、測(cè)序、誘變、修復(fù)；

2.方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異，能保證研究與開(kāi)發(fā)的需要。②技術(shù)特點(diǎn)：

1.可在體外根據(jù)需要進(jìn)行人工3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)DNA合成技術(shù)DNA重組微生物的培養(yǎng)、保存酶切鑒定

DNA測(cè)序分子雜交3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，是指由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。⑵在細(xì)胞水平上，是指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂而來(lái)的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。⑶在分子生物學(xué)上，是指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之永久保存和復(fù)制的過(guò)程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水亞克隆的概念

是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。亞克隆的概念是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目

基因克隆是指應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝?；蚩寺?.2基因克隆示意圖4.2基因克隆示意圖二.基因工程的要素及實(shí)施二.基因工程的要素及實(shí)施（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切割DNADNA連接酶通過(guò)生成3′,5′-磷酸二酯鍵,把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、從3′-OH端補(bǔ)平雙鏈ＤＮＡ中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶以RNA鏈為模板，進(jìn)行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚單核苷酸堿性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶類(lèi)名稱(chēng)功能（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切割DNADN

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).2.一把特殊的剪刀

——限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的分類(lèi)、作用及命名作用：識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（舉例）EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的識(shí)別和切割識(shí)別和切割位點(diǎn)：回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端：粘性末端（粘端）

平頭末端（平端）

產(chǎn)生了平頭末端產(chǎn)生了粘性末端3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端4.修飾與限制作用4.修飾與限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個(gè)片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA連接酶6.DNA連接酶分子生物學(xué)研究方法課件7.同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)。8.同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。7.同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)。（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)2.克隆載體的種類(lèi)：原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN等（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(diǎn)(多個(gè)單克隆位點(diǎn));

③.篩選標(biāo)記;

④.分子量盡可能小;

⑤.外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制能力.

沒(méi)有一個(gè)天然的DNA完全符合載體條件,故使用時(shí)需進(jìn)行改造.

3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(diǎn)(多

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plas從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體*大小2~10kb；*優(yōu)點(diǎn)：易于操作、保存；*缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低；*轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)法電轉(zhuǎn)移法*應(yīng)用：a.小基因組的克隆

b.單一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）質(zhì)粒載體的一般特點(diǎn)：*大小2~10kb；（1）質(zhì)粒載體的一般特點(diǎn)：（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點(diǎn)：

①拷貝數(shù)多;②兩三個(gè)遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——篩選標(biāo)志③多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點(diǎn)：①pBR系列

來(lái)源于Psc101、colE1和RSF2124三個(gè)天然質(zhì)粒改造重組而成。pBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，用氯霉素?cái)U(kuò)增法可使質(zhì)粒DNA占細(xì)胞DNA總量的50%，這對(duì)制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。（3）質(zhì)粒載體舉例①pBR系列

來(lái)源于Psc101、colE1和R分子生物學(xué)研究方法課件分子生物學(xué)研究方法課件②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的許多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9分子生物學(xué)研究方法課件5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體（1）λ噬菌體(λphage)的特點(diǎn)：①.一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型含有雙鏈線(xiàn)狀DNA分子（λDNA），長(zhǎng)度48.5kb,分子兩端各有一個(gè)12bp組成的粘性末端,感染大腸桿菌后,線(xiàn)狀DNA通過(guò)粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán),連接處稱(chēng)COS位點(diǎn)。②.本身有復(fù)制體系;③.感染大腸桿菌后要進(jìn)行環(huán)化（1）λ噬菌體(λphage)的特點(diǎn)：λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過(guò)程λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過(guò)程④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染效率高;⑤.載體容量大,可裝入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位點(diǎn);⑦.篩選容易——噬菌斑篩選;⑧.主要用于DNA文庫(kù)的構(gòu)建.④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染（2）M13噬菌體

特點(diǎn)：一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長(zhǎng)6.5kb,感染大腸桿菌后,ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體。

最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針。

（2）M13噬菌體

特點(diǎn)：一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)構(gòu)特征:是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀DNA

組成:λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒+控制包裝作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆載體Ⅲ——柯斯質(zhì)粒

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosmid重組體可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配,形成噬菌體顆粒,感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多,進(jìn)入宿主細(xì)胞后,只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增,并依賴(lài)抗藥性被篩選.1.具有λ-DNA的COS位點(diǎn);

2.具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記(Ampr);

3.具有多種單一的酶切位點(diǎn).

柯斯質(zhì)粒(cosmid)的特點(diǎn):

4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosm柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點(diǎn):

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒DNA的方式擴(kuò)增;

3.可克隆較大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因組文庫(kù)構(gòu)建

4.缺點(diǎn):產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。

柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點(diǎn):

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒YAC載體

酵母人工染色體，可容納外源基因片段長(zhǎng)達(dá)200kb-1000kb，含有酵母第4號(hào)染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列CEN4、ARS1，作為端粒的Tel序列，選擇性標(biāo)志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，常用于大的染色體基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建。其他克隆載體：YAC載體其他克隆載體：

插入型載體——含單一的限制性酶切位點(diǎn)，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建；

取代型載體——含某一限制性酶的兩個(gè)切點(diǎn)，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建。經(jīng)人工改造生成的基因克隆載體類(lèi)型

插入型載體——含單一的限制性酶切位點(diǎn)，可接受1目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）制備基因組DNA基因文庫(kù)(genomiclibrary)—存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌中、克隆載體攜帶的所有基因組DNA的集合制備cDNAcDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)制備用于表達(dá)的基因片段：PCR技術(shù)、化學(xué)合成目的基因(targetDNA)的制備目的基因（外源基因）文庫(kù)構(gòu)建

基因組文庫(kù)\cDNA文庫(kù)

區(qū)別：材料

基因結(jié)構(gòu)不同

文庫(kù)內(nèi)容

載體

使用范圍文庫(kù)構(gòu)建

基因組文庫(kù)\cDNA文庫(kù)

區(qū)別：材料

構(gòu)建基因文庫(kù)的克隆載體粘粒(Cosmid)細(xì)菌人工染色體(BAC)酵母人工染色體(YAC)P1噬菌體人工染色體(PAC)構(gòu)建基因文庫(kù)的克隆載體粘粒(Cosmid)基因文庫(kù)的構(gòu)建的步驟:①載體DNA的分離②真核生物DNA的分離③部分酶解④片段回收(9-23kb)⑤載體與插入片段的連接⑥包裝⑦文庫(kù)的效價(jià)測(cè)定⑧文庫(kù)的擴(kuò)增⑨文庫(kù)的保存⑩重組克隆鑒定基因文庫(kù)的構(gòu)建的步驟:①載體DNA的分離cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA高豐度中豐度低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA高豐度中

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)能否構(gòu)建成功的關(guān)鍵是:

高質(zhì)量的mRNA的獲得一個(gè)好的cDNA文庫(kù)的特征:①包含有足夠大量的獨(dú)立克隆，代表最初的mRNA樣品中的所有轉(zhuǎn)錄本②克隆中包含接近全長(zhǎng)的mRNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)能cDNAlibraryconstructionAAAAA5’3’mRNA(allmRNAsincell)annealoligo(dT)primersof12-18basesinlengthAAAAATTTTT5’3’5’addreversetranscriptaseanddNTPsAAAAATTTTT5’3’3’5’cDNAaddRNaseH(specificfortheRNAstrandofanRNA-DNAhybrid)andcarryoutapartialdigestionAATTTTT5’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseI3’3’cDNAlibraryconstructionAAAAAAAAATTTTT5’3’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseIAAATTTTT5’3’DNApolymeraseIremovestheremainingRNAwithits5’to3’exonucleaseactivityandcontinuessynthesisDNAligasesealsthegapsAAATTTTT5’3’AAAAATTTTT5’3’double-strandedcDNAAAAAA5’shortRNAfragmentsserAAAAATTTTT5’3’NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRIlinkersareligatedtobothends usingDNAligaseAAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAAdouble-strandedcDNAcopiesofmRNAwithEcoRIcohesiveendsarenowreadytoligateintoabacteriophagelambdavectorcutwithEcoRI5’3’AATTCNNNNNNNNGNNNNNNNNAAAAA5’NNNNNNNNGEcoRIlinkers分子生物學(xué)研究方法課件CIP:牛小腸堿性磷酸酶粘性末端連接法（連接效率高）和去５’磷酸連接法載體與目的基因的連接方法CIP:牛小腸堿性磷酸酶粘性末端連接法（連接效率高）載體與目人工接頭法：人工接頭法：同聚物接尾法同聚物接尾法重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程小結(jié)目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程小結(jié)目的基因的制備基因工程的基本操作步驟及其應(yīng)用意義基因工程的基本操作步驟：①獲取外源目的基因；②尋找基因載體(通常為質(zhì)粒、噬菌體等)使用限制性?xún)?nèi)切酶，使目的基因與載體產(chǎn)生相同粘性末端，兩個(gè)末端互補(bǔ)連接，形成重組DNA；③通過(guò)轉(zhuǎn)化(或感染)將重組DNA引入寄主細(xì)胞；④從大量的寄主細(xì)胞中篩選出帶有重組DNA的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E及其應(yīng)用意義基因工程的基本操作步驟：意義：①利用基因工程技術(shù)，可以大量生產(chǎn)在一些正常細(xì)胞中產(chǎn)量很低的多肽物質(zhì)，用于醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)中；②定向改造生物基因結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)抗病強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)的各種農(nóng)副產(chǎn)品，以提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值；③用于生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究；④值得注意的是，基因工程技術(shù)若使用不當(dāng)、管理不善，也會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)災(zāi)難。意義：分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理

1．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)

將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。第一節(jié)基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳(A分子生物學(xué)研究方法課件2．核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）2．核酸的分子雜交技術(shù)核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱(chēng)為核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線(xiàn)印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；

2.將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱(chēng)這類(lèi)核酸雜交為印跡雜交。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：

1.將核酸樣品轉(zhuǎn)移分子生物學(xué)研究方法課件分子生物學(xué)研究方法課件3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化

所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱(chēng)做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。

3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化4．DNA序列分析a.Sanger的雙脫氧鏈終止法

Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；DNA聚合酶常用Klenow大片段，無(wú)5'→3'外切酶活性。②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP。4．DNA序列分析分子生物學(xué)研究方法課件雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖分子生物學(xué)研究方法課件b．DNA序列分析自動(dòng)化(分析反應(yīng)\讀片過(guò)程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后,用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。b．DNA序列分析自動(dòng)化(分析反應(yīng)\讀片過(guò)程)DNA測(cè)序的全過(guò)程(實(shí)際)DNA測(cè)序的全過(guò)程(實(shí)際)5．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過(guò)程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。如：盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。5．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutag6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(Gelretardationassay)，又稱(chēng)DNA遷移率變化試驗(yàn)(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.a.凝膠滯b．DNaseI印跡試驗(yàn)（DNaseIfootprinting）主要步驟：

①用32P標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；

②加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；

③加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。

這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證每一條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯斷裂！

④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；

⑤進(jìn)行DNA凝膠分析。

如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶,而是出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域,形象地稱(chēng)為足跡。b．DNaseI印跡試驗(yàn)（DNaseIfootp7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1983年由美國(guó)科學(xué)家KaryMullis提出，1993年因此而獲諾貝爾獎(jiǎng)。PCR技術(shù)是指通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)的技術(shù)，它包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開(kāi)車(chē)去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis開(kāi)車(chē)的時(shí)候,瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車(chē)和對(duì)面開(kāi)來(lái)的車(chē)象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成.DNA，……Mullis開(kāi)車(chē)的時(shí)候,瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒(méi)有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來(lái)解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐熱DNA聚合酶模板DNA

變性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃?；疽?cái)U(kuò)增步驟PCR的基本原理引物變性（denaturation）：9分子生物學(xué)研究方法課件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR擴(kuò)增特異性DNA片段全過(guò)程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物學(xué)研究方法課件PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通過(guò)PCR過(guò)程聚合成互補(bǔ)鏈DNA。貯存濃度：2.5mM使用濃度：200μM使用濃度不當(dāng)會(huì)影響擴(kuò)增的產(chǎn)量、特異性和保真度。PCR反應(yīng)體系1、脫氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、緩沖液（buffer）標(biāo)準(zhǔn)10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、緩沖液（buffer）標(biāo)準(zhǔn)10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用濃度為0.1μM~1.0μM之間。引物濃度太低，擴(kuò)增產(chǎn)物太少；引物濃度太高，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增反應(yīng)。一般貯存濃度：10μM

使用濃度：0.4μM引物設(shè)計(jì)要求:

設(shè)計(jì)的引物的核苷酸序列必須與模板鏈3’端的一段核苷酸序列互補(bǔ),且3’端必須有游離的-OH基團(tuán)；引物一般由20~30個(gè)核苷酸組成，4種核苷酸盡可能隨機(jī)分布，GC含量應(yīng)達(dá)40~60%；引物中應(yīng)盡量避免回紋序列出現(xiàn)；引物中最好含有進(jìn)一步操作中可利用的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列。3、引物（primer）最佳引物使用濃度為0.Tm（解鏈溫度）值的計(jì)算公式：引物長(zhǎng)度＜20nt時(shí)：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物長(zhǎng)度＞20nt時(shí)：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR過(guò)程中選擇退火溫度時(shí)，一般為（Tm－5）℃Tm（解鏈溫度）值的計(jì)算公式：引物長(zhǎng)度＜20nt時(shí)：Tm=44、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個(gè)待擴(kuò)增的特定雙鏈DNA片段，應(yīng)知道其兩端20~30bp的核苷酸序列，供設(shè)計(jì)一對(duì)引物之用。PCR的模板是一條單鏈DNA片段，其3’端具有與引物雜交的序列。4、模板DNA作為PCR的靶DNA一般是一個(gè)待擴(kuò)增的特定雙5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

來(lái)自嗜熱古細(xì)菌Thermusaquaticus。該菌1967年從溫泉中分離，最適生長(zhǎng)溫度70℃?，F(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為94×103，為單分子酶，具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性和較弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。合成出錯(cuò)幾率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

來(lái)自喜溫性古細(xì)菌Pyrococcuswoesei?，F(xiàn)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的是該基因在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。特征：相對(duì)分子質(zhì)量為90×103，具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐熱性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高溫DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶來(lái)自喜溫性真細(xì)菌ThermusthermophilusHB8。具較強(qiáng)的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度75℃。Mg2+存在時(shí)，以DNA為模板合成DNA，Mn2+存在時(shí)，可以RNA為模板合成cDNA，用于RT-PCR系統(tǒng)。VentDNA聚合酶來(lái)自嗜熱高溫球菌Thermococcuslitoralis

。相對(duì)分子質(zhì)量85×103。100℃時(shí)該酶半衰期為1.8hr，具有3’→5’外切酶校對(duì)活性。合成的準(zhǔn)確度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶來(lái)自激烈熱球菌Pyrococcusfariosus。保真度較高。TthDNA聚合酶來(lái)自喜溫性真細(xì)菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有強(qiáng)力的3’→5’核酸外切酶活性，與TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐熱性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小時(shí)的熱處理后仍可保持約70％的活性，故根據(jù)需要可以將熱變性步驟的溫度設(shè)定值提得更高，這對(duì)處理GC含量高的模板等具有特異性高級(jí)結(jié)構(gòu)的樣品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有強(qiáng)力的3’→5’核酸外PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5min；90～98℃變性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循環(huán)PCR反應(yīng)程序1、常規(guī)程序90～98℃預(yù)熱30sec～5反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期出現(xiàn)的時(shí)間與聚合酶的特性有關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進(jìn)行20次擴(kuò)增后進(jìn)入平臺(tái)期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當(dāng)采用TaqDNA聚合酶時(shí)，擴(kuò)增25次后才進(jìn)入平臺(tái)期，拷貝數(shù)可達(dá)4×106。出現(xiàn)平臺(tái)期的原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不斷發(fā)生變化，最終將會(huì)導(dǎo)致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指將外源基因經(jīng)過(guò)剪切加工，再插入到一個(gè)具有自我復(fù)制能力的載體DNA中，就得到重組DNA，再將重組DNA轉(zhuǎn)移到一個(gè)寄主細(xì)胞中，外源基因就可以隨著寄主細(xì)胞的分裂進(jìn)行繁殖，寄主細(xì)胞也借此獲得外源基因所攜帶的新特性。

第二節(jié)基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點(diǎn)：

①基本程序：

分—切—接—轉(zhuǎn)—篩

2.基因工程的基本程序及技術(shù)特點(diǎn)：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物學(xué)研究方法課件②技術(shù)特點(diǎn)：

1.可在體外根據(jù)需要進(jìn)行人工的、有目的的基因重組、表達(dá)、測(cè)序、誘變、修復(fù)；

2.方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、特異，能保證研究與開(kāi)發(fā)的需要。②技術(shù)特點(diǎn)：

1.可在體外根據(jù)需要進(jìn)行人工3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化凝膠電泳技術(shù)PCR技術(shù)DNA合成技術(shù)DNA重組微生物的培養(yǎng)、保存酶切鑒定

DNA測(cè)序分子雜交3.基因工程的主要技術(shù)DNA、RNA的分離純化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，是指由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。⑵在細(xì)胞水平上，是指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂而來(lái)的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。⑶在分子生物學(xué)上，是指將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之永久保存和復(fù)制的過(guò)程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水亞克隆的概念

是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。亞克隆的概念是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目

基因克隆是指應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝。基因克隆4.2基因克隆示意圖4.2基因克隆示意圖二.基因工程的要素及實(shí)施二.基因工程的要素及實(shí)施（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切割DNADNA連接酶通過(guò)生成3′,5′-磷酸二酯鍵,把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、從3′-OH端補(bǔ)平雙鏈ＤＮＡ中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶以RNA鏈為模板，進(jìn)行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚單核苷酸堿性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶類(lèi)名稱(chēng)功能（一）、工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切割DNADN

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).2.一把特殊的剪刀

——限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的分類(lèi)、作用及命名作用：識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵分類(lèi)：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（舉例）EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)的識(shí)別和切割識(shí)別和切割位點(diǎn)：回文結(jié)構(gòu)4～6bp出現(xiàn)兩種末端：粘性末端（粘端）

平頭末端（平端）

產(chǎn)生了平頭末端產(chǎn)生了粘性末端3.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)粘性末端與平頭末端粘性末端與平頭末端4.修飾與限制作用4.修飾與限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解可得大、小兩個(gè)片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA連接酶6.DNA連接酶分子生物學(xué)研究方法課件7.同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)。8.同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。7.同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)。（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)2.克隆載體的種類(lèi)：原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬菌體（λ，M13）等真核載體：動(dòng)物病毒載體pLXSN等（二）、載體（vector）1.本質(zhì)：DNA，能在宿3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(diǎn)(多個(gè)單克隆位點(diǎn));

③.篩選標(biāo)記;

④.分子量盡可能小;

⑤.外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制能力.

沒(méi)有一個(gè)天然的DNA完全符合載體條件,故使用時(shí)需進(jìn)行改造.

3.載體的基本要求：

①.復(fù)制單位;

②.克隆位點(diǎn)(多

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。

4.常用的克隆載體Ⅰ：質(zhì)粒質(zhì)粒(plas從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體從天然質(zhì)粒到質(zhì)粒載體*大小2~10kb；*優(yōu)點(diǎn)：易于操作、保存；*缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較低；*轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)法電轉(zhuǎn)移法*應(yīng)用：a.小基因組的克隆

b.單一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）質(zhì)粒載體的一般特點(diǎn)：*大小2~10kb；（1）質(zhì)粒載體的一般特點(diǎn)：（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點(diǎn)：

①拷貝數(shù)多;②兩三個(gè)遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——篩選標(biāo)志③多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的質(zhì)粒載體具有如下特點(diǎn)：①pBR系列

來(lái)源于Psc101、colE1和RSF2124三個(gè)天然質(zhì)粒改造重組而成。pBR322是應(yīng)用最多的大腸桿菌質(zhì)粒載體，用氯霉素?cái)U(kuò)增法可使質(zhì)粒DNA占細(xì)胞DNA總量的50%，這對(duì)制備大量質(zhì)粒DNA極為有利。（3）質(zhì)粒載體舉例①pBR系列

來(lái)源于Psc101、colE1和R分子生物學(xué)研究方法課件分子生物學(xué)研究方法課件②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的許多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列質(zhì)粒（pUC8、9分子生物學(xué)研究方法課件5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體5.常用的克隆載體Ⅱ——噬菌體載體（1）λ噬菌體(λphage)的特點(diǎn)：①.一種能感染大腸桿菌的病毒，野生型含有雙鏈線(xiàn)狀DNA分子（λDNA），長(zhǎng)度48.5kb,分子兩端各有一個(gè)12bp組成的粘性末端,感染大腸桿菌后,線(xiàn)狀DNA通過(guò)粘性末端互補(bǔ)連接成環(huán),連接處稱(chēng)COS位點(diǎn)。②.本身有復(fù)制體系;③.感染大腸桿菌后要進(jìn)行環(huán)化（1）λ噬菌體(λphage)的特點(diǎn)：λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過(guò)程λDNA感染大腸桿菌后的環(huán)化過(guò)程④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染效率高;⑤.載體容量大,可裝入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位點(diǎn);⑦.篩選容易——噬菌斑篩選;⑧.主要用于DNA文庫(kù)的構(gòu)建.④.λDNA在體外可包裝成病毒顆粒,感染（2）M13噬菌體

特點(diǎn)：一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉環(huán)正鏈ssDNA，全長(zhǎng)6.5kb,感染大腸桿菌后,ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sDNA,可用作克隆載體。

最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA,可制備單鏈DNA探針。

（2）M13噬菌體

特點(diǎn)：一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，閉

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)構(gòu)特征:是一種人工改造的載體,雙鏈環(huán)狀DNA

組成:λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒+控制包裝作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆載體Ⅲ——柯斯質(zhì)粒

柯斯質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒

基本結(jié)4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosmid重組體可象噬菌體一樣進(jìn)行外殼裝配,形成噬菌體顆粒,感染大腸桿菌效率比質(zhì)粒高得多,進(jìn)入宿主細(xì)胞后,只能象質(zhì)粒一樣擴(kuò)增,并依賴(lài)抗藥性被篩選.1.具有λ-DNA的COS位點(diǎn);

2.具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和抗藥性標(biāo)記(Ampr);

3.具有多種單一的酶切位點(diǎn).

柯斯質(zhì)粒(cosmid)的特點(diǎn):

4.cosmid較小,約4–6kb.

5.cosm柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點(diǎn):

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒DNA的方式擴(kuò)增;

3.可克隆較大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因組文庫(kù)構(gòu)建

4.缺點(diǎn):產(chǎn)生串聯(lián)現(xiàn)象。

柯斯質(zhì)粒的優(yōu)缺點(diǎn):

1.克隆效率高;

2.可利用質(zhì)粒YAC載體

酵母人工染色體，可容納外源基因片段長(zhǎng)達(dá)200kb-1000kb，含有酵母第4號(hào)染色體的著絲粒和自主復(fù)制序列CEN4、ARS1，作為端粒的Tel