胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評估的培訓培訓課件

胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評估的培訓胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評估的培訓1胚胎體外培養(yǎng)胚胎評估胚胎體外培養(yǎng)2空氣、振動、光照…培養(yǎng)箱外環(huán)境人員/操作培養(yǎng)流程℃alarmiauto-start

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％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體、

濕度、培養(yǎng)皿、油…培養(yǎng)液胚胎體外培養(yǎng)體系空氣、振動、光照…培養(yǎng)箱外環(huán)境人員/操作℃alarmiaut3培養(yǎng)箱外環(huán)境空氣及污染物振動、噪音光照室內(nèi)濕度培養(yǎng)箱外環(huán)境空氣及污染物4揮發(fā)性有機化合物VOC總揮發(fā)性有機化合物（TVOC）：熔點低于室溫沸點50～260℃揮發(fā)性有機化合物的總稱世界衛(wèi)生組織(WHO,1989)

揮發(fā)性有機化合物VOC總揮發(fā)性有機化合物（TVOC）：世界衛(wèi)5VOC分類苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二異氰酸酯（TDI）二異氰甲苯酯有機氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂類石油烴類有機酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等VOC分類苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）6測定VOC先俘獲、后測定各種VOC的俘獲方法不同測定總VOC？目前測定的“TVOC”：6~13個碳原子的苯系有機物其他VOC有各自的俘獲測定方法未知VOC很難測定測定VOC先俘獲、后測定未知VOC很難測定7塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子十萬級：3500000/m3萬級：350000/m3千級：35000/m3塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子8光照來源：室內(nèi)照明燈、顯微鏡光源危害：損害線粒體培養(yǎng)液成分分解紫外線產(chǎn)生活性氧，對所有細胞有害光照來源：室內(nèi)照明燈、顯微鏡光源9光照豚鼠卵，超過一小時，影響后續(xù)受精和有絲分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的結論——兔卵進行光照20～30分鐘后，隨后的受精率和著床率并未受到明顯影響光照豚鼠卵，超過一小時，影響后續(xù)受精和有絲分裂10相對濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣RH=絕對濕度/飽和濕度30℃30g水蒸氣RH=43.5%RH=33.3%相對濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣R11理想的室內(nèi)相對濕度？設備抑制霉菌人員減少液體蒸發(fā)010030~60%理想的室內(nèi)相對濕度？設備抑制霉菌人員減少液體蒸發(fā)01003012培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體溫度培養(yǎng)皿液滴培養(yǎng)方式油培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體13氣體二氧化碳培養(yǎng)箱CO2℃alarmiauto-start

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％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三氣培養(yǎng)箱桌面式培養(yǎng)箱N2氣體二氧化碳培養(yǎng)箱CO2℃alarmiauto-％O2％14氣體純度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2氣體純度99.99%?剩余的0.001%是什么？CO215高濃度氧，胚胎基因表達異常？低氧培養(yǎng)改善體外胚胎發(fā)育低氧培養(yǎng)，人囊胚細胞數(shù)增加低氧培養(yǎng)高濃度氧，胚胎基因表達異常？低氧培養(yǎng)16低氧培養(yǎng)部分文獻——不必要低氧?培養(yǎng)液內(nèi)，添加了抗氧化物質(zhì)（?；撬?、丙酮酸）可能消除高氧的不利影響37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIO低氧培養(yǎng)部分文獻——不必要低氧?37.05.095.0max17ASRM，2013年支持低氧環(huán)境利于囊胚形成！ASRM，2013年支持低氧環(huán)境利于囊胚形成！18低氧同樣利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2薈萃分析，隨機對照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活產(chǎn)率從32%提高到43%低氧同樣利于卵裂期胚胎Lowoxygenconcentr19溫度鼠胚室溫5分鐘——降低卵裂率15分鐘——囊胚形成率減半人卵母細胞——低溫損害紡錘體溫度鼠胚20溫度——紡錘體解聚與恢復33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消失37℃后,10分鐘內(nèi)恢復28℃，解聚加快，恢復時間長，20分鐘不能完全恢復溫度——紡錘體解聚與恢復33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消21液滴/培養(yǎng)方式單獨培養(yǎng)液滴/培養(yǎng)方式單獨培養(yǎng)22集合培養(yǎng)胚胎自分泌、旁分泌作用減小體積適當增加胚胎數(shù)目液滴自分泌旁分泌集合培養(yǎng)胚胎自分泌、旁分泌作用液滴自分泌旁分泌23集合培養(yǎng)——依據(jù)鼠、羊、牛胚胎培養(yǎng)證據(jù)具體旁分泌因子未確定集合培養(yǎng)——依據(jù)鼠、羊、牛胚胎培養(yǎng)證據(jù)24集合培養(yǎng)——方法20～50ul2～5個胚胎/液滴蓋油（石蠟油、礦物油）液滴礦物油液滴液滴集合培養(yǎng)——方法20～50ul液滴礦物油液滴液滴25集合培養(yǎng)缺點：不利于單個胚胎的連續(xù)觀察解決1：按Day3形態(tài)學評分分組培養(yǎng)8細胞碎片0～10％8細胞碎片20～40％6細胞碎片20～50％集合培養(yǎng)缺點：不利于單個胚胎的連續(xù)觀察解決1：按Day3形態(tài)26解決2：特殊培養(yǎng)皿液滴解決2：液滴27培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類水、離子碳水化合物氨基酸pH值及緩沖物質(zhì)維生素，抗生素螯合劑抗氧化物質(zhì)蛋白質(zhì)，大分子激素，生長因子培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類28培養(yǎng)液種類序貫培養(yǎng)液單一培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類序貫培養(yǎng)液29序貫培養(yǎng)mmol/LGardner,1998序貫培養(yǎng)mmol/LGardner,199830序貫培養(yǎng)葡萄糖不利于分裂期胚胎發(fā)育囊胚主要能量來源EDTA利于分裂期胚胎發(fā)育抑制囊胚內(nèi)細胞團發(fā)育氨基酸序貫培養(yǎng)葡萄糖31序貫培養(yǎng)系統(tǒng)Day1~Day3:卵裂期培養(yǎng)液Day3~Day6：囊胚培養(yǎng)液序貫培養(yǎng)系統(tǒng)Day1~Day3:卵裂期培養(yǎng)液32單一培養(yǎng)液？單一培養(yǎng)：簡化流程，形成率類似Day3換液Day3不換液！單一培養(yǎng)液？單一培養(yǎng)：簡化流程，形成率類似33pH值與緩沖物質(zhì)pH：代表氫離子濃度pH與細胞各種生理功能關系極密切pH指示劑：酚紅緩沖物質(zhì)：維持pH穩(wěn)定，成對或一種：碳酸鹽緩沖對、MOPS、HEPES1pH值147pH值與緩沖物質(zhì)pH：代表氫離子濃度1pH值14734pH值與CO2濃度最重要的緩沖對碳酸鹽緩沖對：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕pH值與CO2濃度最重要的緩沖對pH=pKa+lg（————35培養(yǎng)系統(tǒng)的pH值7.2-7.4碳酸鹽體系不穩(wěn)定！暴露空氣會使PH迅速升高蓋油減少培養(yǎng)基氣體交換培養(yǎng)系統(tǒng)的pH值7.2-7.436CO2濃度影響因素設定值：5%？6%傳感器類型培養(yǎng)箱開門方式溫度、濕度CO2濃度影響因素設定值：5%？6%37無機離子參與滲透壓形成高濃度氯化鈉不利于鼠囊胚形成胞外鎂和鈣的水平與早期胚胎細胞對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力有關磷在含有葡萄糖的簡單培養(yǎng)基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的發(fā)育無機離子無機離子參與滲透壓形成無機離子38銨氨基酸代謝及自然分解產(chǎn)生的氨會導致胚胎毒性物質(zhì)-銨離子的積累銨離子可以改變胚胎分化、代謝及基因表達會嚴重降低移植后種植率及胎兒發(fā)育率銨氨基酸代謝及自然分解產(chǎn)生的氨會導致胚胎毒性物質(zhì)-銨離子的積39抗生素培養(yǎng)基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素主要作用時防止培養(yǎng)基的細菌污染抗生素培養(yǎng)基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素40蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效應如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血漿蛋白粉、5%血漿蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其41阻止培養(yǎng)液的蒸發(fā)及培養(yǎng)基pH的變化種類：礦物油石蠟油油阻止培養(yǎng)液的蒸發(fā)及培養(yǎng)基pH的變化油42培養(yǎng)液儲運冷鏈運輸，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器導致培養(yǎng)液堿化，鎂離子沉淀減少細菌污染風險培養(yǎng)液儲運冷鏈運輸，2~8℃43分裝目的：減少開瓶次數(shù)分裝量：根據(jù)使用情況，一次一支分裝容器，與量匹配標記分裝日期分裝目的：減少開瓶次數(shù)44胚胎移植－移植時期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植在體內(nèi)此時的胚胎是在輸卵管內(nèi)，而不是在子宮內(nèi)卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植胚胎移植－移植時期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植45囊胚培養(yǎng)進一步篩選胚胎靈活的移植時間便于PGD/PGS減少異位妊娠囊胚培養(yǎng)進一步篩選胚胎46囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta2012年齡囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta20147人員及操作人員數(shù)量適當每項關鍵技術均至少2人能熟練實施確保足夠人力實現(xiàn)雙人復核衛(wèi)生部（衛(wèi)科教[2003]176號文件）規(guī)定，實驗室專業(yè)技術人員不得少于3人。年周期超過1000個周期的中心需要適當增加技術人員每名全職胚胎學家完成250~400周期/年人員及操作人員數(shù)量適當衛(wèi)生部（衛(wèi)科教[2003]176號文件48人員及操作操作時間對卵、胚胎的應激核對人員及操作操作時間49胚胎體外培養(yǎng)胚胎評估胚胎體外培養(yǎng)50卵巢刺激后獲得的胚胎發(fā)育潛能不一致減少移植胚胎數(shù)，挑選正確的胚胎！胚胎評估、胚胎選擇是IVF實驗室技術中的核心卵巢刺激后獲得的胚胎發(fā)育潛能不一致51常規(guī)胚胎形態(tài)學評估始于第一例IVF-ET1981年Edwards闡述了形態(tài)學評估的方法常規(guī)胚胎形態(tài)學評估始于第一例IVF-ET52胚胎形態(tài)學評估多種評分體系可進行胚胎形態(tài)學評估缺點依賴操作者主觀能力優(yōu)勢快速而有效胚胎形態(tài)學評估多種評分體系可進行胚胎形態(tài)學評估53Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由資深胚胎學家組成的國際組織Alpha“Toadvancetheartand54Alpha共識embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistAlpha共識embryomorphology55Istanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010Istanbulconsensusworkshopon56胚胎的形態(tài)學指標透明帶極體卵周隙胚胎形狀裂球數(shù)量裂球形狀裂球排列原核碎片多核顆?？张葜旅芑遗咔淮笮CM形狀TE細胞數(shù)早卵裂胚胎的形態(tài)學指標透明帶胚胎形狀原核碎片致密化囊胚腔大小早卵裂57Righttime，rightembryo！Righttime，58評估時間觀察內(nèi)容受精后時間Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst評估時間觀察內(nèi)容受精后時間Expectedstageof59原核期評分1998年前后提出原核核仁的數(shù)量，排列原核大小及排列胞漿狀態(tài)2001年,原核期評分能夠預測囊胚形成，與妊娠率相關近10余年一直存在爭議，研究多為回顧性2011年time-lapse：對評分方法提出質(zhì)疑原核期評分1998年前后提出2001年,原核期評分能夠預測囊60原核期評分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB原核期評分GradeRatingDescription1Sy61早卵裂24～27小時的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是發(fā)育能力的重要標志后多人研究證實早卵裂24～27小時的第一次分裂62分裂對稱性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評分分裂對稱性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評分63Day3細胞數(shù)Edwards提出人早期胚胎有相對固定的發(fā)育速度超出或低于此速度，均影響后續(xù)發(fā)育大量文獻：細胞數(shù)——種植率、囊胚形成率！Day3細胞數(shù)Edwards提出人早期胚胎有相對固定的發(fā)育64[i]

AlikaniM.HumReprod2000[i]AlikaniM.HumReprod20065碎片碎片：無細胞核，細胞膜包裹的細胞外胞漿結構（Alikani，1999）細胞代謝或分裂過程異常造成的凋亡過程染色體異常造成碎片？僅僅是目前我們對碎片的認識碎片碎片：無細胞核，細胞膜包裹的細胞外胞漿結構（Alikan66“細胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um“細胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um45u67碎片對胚胎發(fā)育的后續(xù)影響——局部融合Day4可能發(fā)生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外碎片對胚胎發(fā)育的后續(xù)影響——局部融合Day4可能發(fā)生局部融合68局部融合——囊胚質(zhì)量下降局部融合——囊胚質(zhì)量下降69卵裂球?qū)ΨQ性文獻非常少卵裂球嚴重不均勻的胚胎種植率下降Hardarson，2001卵裂球?qū)ΨQ性文獻非常少70多核現(xiàn)象可能與染色體異常有關囊胚形成率下降種植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007多核現(xiàn)象可能與染色體異常有關71Day3胚胎形態(tài)學評價細胞數(shù)與碎片含量，哪個指標更重要？在所有形態(tài)學指標中，細胞數(shù)是最重要的獨立的預測胚胎活性的指標！RonitMachtinger，2013Day3胚胎形態(tài)學評價細胞數(shù)與碎片含量，哪個指標更重要？在72細胞數(shù)與囊胚形成率北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN細胞數(shù)與囊胚形成率北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PU73碎片、細胞數(shù)與day6囊胚形成北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN碎片、細胞數(shù)與day6囊胚形成北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)74卵裂期胚胎評估細胞數(shù)少于8個＝種植能力下降多于8個＝種植率可能下降碎片:定義:d2<45μm;d3<40μm分級：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要記錄碎片位置多核現(xiàn)象:一個卵裂球內(nèi)超過一個細胞核;d2評估細胞大小:2-,4-,和8-cell階段應均勻卵裂期胚胎評估細胞數(shù)75卵裂期胚胎分級GradeRatingDescription1Good<10%fragmentationstage-specificcellsizenomultinucleation2Fairupto25%fragmentationstage-specificcellsizeformajorityofcellsnoevidenceofmultinucleation3Poorseverefragmentation(>25%)cellsizenotstage-specificevidenceofmultinucleation卵裂期胚胎分級GradeRatingDescription176day4胚胎形態(tài)（桑葚胚）相關文獻很少GradeA~F(2011)致密化與滋養(yǎng)層的形成有重要關系致密化非常重要day4胚胎形態(tài)（桑葚胚）相關文獻很少致密化非常重要77Day4胚胎分級GradeRatingDescription1GoodEnteredintoa4throundofcleavageEvidenceofcompactionthatinvolvesvirtuallyalltheembryovolume2FairEnteredintoa4throundofcleavageCompactioninvolvesthemajorityofthevolumeoftheembryo3PoorDisproportionatecompactionof<?embryo,withsomecellsremainingasdiscreteblastomeresDay4胚胎分級GradeRatingDescriptio78囊胚質(zhì)量評價Gardner評分方法1～6期6期5期4期3期2期囊胚質(zhì)量評價Gardner評分方法6期5期4期3期2期79AA80BB81CC82AA83BB84CC85囊胚形態(tài)學評估滋養(yǎng)細胞層重要？內(nèi)細胞團重要？囊胚形態(tài)學評估滋養(yǎng)細胞層重要？86第5天新鮮SET的回顧性研究形態(tài)學指標（擴張程度、ICM和TE）對于持續(xù)妊娠/活產(chǎn)的預測價值2006年1月至2010年6月的回顧性分析每ET的持續(xù)妊娠或活產(chǎn)率Ahlstrom2011第5天新鮮SET的回顧性研究形態(tài)學指標（擴張程度、ICM和T87結果形態(tài)指標分級妊娠率（％）P擴張程度338.1448.40.021內(nèi)細胞團A46.8B34.00.024C14.3滋養(yǎng)細胞層A52.0B32.4<0.0001C8.0滋養(yǎng)層形態(tài)比ICM的預測價值更高結果形態(tài)指標分級妊娠率（％）P擴張程度338.1448.4088囊胚分級GradeRatingDescriptionStageofdevelopment1早期2囊胚3擴張囊胚4部分或完全孵出囊胚InnerCellMass1GoodProminent,easilydiscernible,withmanycellsthatarecompactedandtightlyadhered2FairEasilydiscerniblewithmanycellslooselygroupedtogether3PoorDifficulttodiscern,withfewcellsTrophecto-derm1GoodManycellsformingacohesiveepithelium2FairFewcellsformingalooseepithelium3PoorVeryfewcells囊胚分級GradeRatingDescriptionStag89小結胚胎培養(yǎng)體系是培養(yǎng)室環(huán)境、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液和人員操作的綜合體胚胎形態(tài)學評估是胚胎選擇的重要方法多種胚胎形態(tài)學指標有不同的意義，但已經(jīng)逐漸達成共識小結胚胎培養(yǎng)體系是培養(yǎng)室環(huán)境、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液和人員操作的綜合90謝謝!謝謝!91胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評估的培訓胚胎體外培養(yǎng)和胚胎評估的培訓92胚胎體外培養(yǎng)胚胎評估胚胎體外培養(yǎng)93空氣、振動、光照…培養(yǎng)箱外環(huán)境人員/操作培養(yǎng)流程℃alarmiauto-start

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％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體、

濕度、培養(yǎng)皿、油…培養(yǎng)液胚胎體外培養(yǎng)體系空氣、振動、光照…培養(yǎng)箱外環(huán)境人員/操作℃alarmiaut94培養(yǎng)箱外環(huán)境空氣及污染物振動、噪音光照室內(nèi)濕度培養(yǎng)箱外環(huán)境空氣及污染物95揮發(fā)性有機化合物VOC總揮發(fā)性有機化合物（TVOC）：熔點低于室溫沸點50～260℃揮發(fā)性有機化合物的總稱世界衛(wèi)生組織(WHO,1989)

揮發(fā)性有機化合物VOC總揮發(fā)性有機化合物（TVOC）：世界衛(wèi)96VOC分類苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二異氰酸酯（TDI）二異氰甲苯酯有機氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂類石油烴類有機酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等VOC分類苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）97測定VOC先俘獲、后測定各種VOC的俘獲方法不同測定總VOC？目前測定的“TVOC”：6~13個碳原子的苯系有機物其他VOC有各自的俘獲測定方法未知VOC很難測定測定VOC先俘獲、后測定未知VOC很難測定98塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子十萬級：3500000/m3萬級：350000/m3千級：35000/m3塵埃粒子直徑>0.5um的懸浮粒子99光照來源：室內(nèi)照明燈、顯微鏡光源危害：損害線粒體培養(yǎng)液成分分解紫外線產(chǎn)生活性氧，對所有細胞有害光照來源：室內(nèi)照明燈、顯微鏡光源100光照豚鼠卵，超過一小時，影響后續(xù)受精和有絲分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的結論——兔卵進行光照20～30分鐘后，隨后的受精率和著床率并未受到明顯影響光照豚鼠卵，超過一小時，影響后續(xù)受精和有絲分裂101相對濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣RH=絕對濕度/飽和濕度30℃30g水蒸氣RH=43.5%RH=33.3%相對濕度（RH）1m3空氣25℃23g水蒸氣10g水蒸氣R102理想的室內(nèi)相對濕度？設備抑制霉菌人員減少液體蒸發(fā)010030~60%理想的室內(nèi)相對濕度？設備抑制霉菌人員減少液體蒸發(fā)010030103培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體溫度培養(yǎng)皿液滴培養(yǎng)方式油培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境氣體104氣體二氧化碳培養(yǎng)箱CO2℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三氣培養(yǎng)箱桌面式培養(yǎng)箱N2氣體二氧化碳培養(yǎng)箱CO2℃alarmiauto-％O2％105氣體純度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2氣體純度99.99%?剩余的0.001%是什么？CO2106高濃度氧，胚胎基因表達異常？低氧培養(yǎng)改善體外胚胎發(fā)育低氧培養(yǎng)，人囊胚細胞數(shù)增加低氧培養(yǎng)高濃度氧，胚胎基因表達異常？低氧培養(yǎng)107低氧培養(yǎng)部分文獻——不必要低氧?培養(yǎng)液內(nèi)，添加了抗氧化物質(zhì)（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影響37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIO低氧培養(yǎng)部分文獻——不必要低氧?37.05.095.0max108ASRM，2013年支持低氧環(huán)境利于囊胚形成！ASRM，2013年支持低氧環(huán)境利于囊胚形成！109低氧同樣利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2薈萃分析，隨機對照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活產(chǎn)率從32%提高到43%低氧同樣利于卵裂期胚胎Lowoxygenconcentr110溫度鼠胚室溫5分鐘——降低卵裂率15分鐘——囊胚形成率減半人卵母細胞——低溫損害紡錘體溫度鼠胚111溫度——紡錘體解聚與恢復33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消失37℃后,10分鐘內(nèi)恢復28℃，解聚加快，恢復時間長，20分鐘不能完全恢復溫度——紡錘體解聚與恢復33℃下，5分鐘解聚，10分鐘完全消112液滴/培養(yǎng)方式單獨培養(yǎng)液滴/培養(yǎng)方式單獨培養(yǎng)113集合培養(yǎng)胚胎自分泌、旁分泌作用減小體積適當增加胚胎數(shù)目液滴自分泌旁分泌集合培養(yǎng)胚胎自分泌、旁分泌作用液滴自分泌旁分泌114集合培養(yǎng)——依據(jù)鼠、羊、牛胚胎培養(yǎng)證據(jù)具體旁分泌因子未確定集合培養(yǎng)——依據(jù)鼠、羊、牛胚胎培養(yǎng)證據(jù)115集合培養(yǎng)——方法20～50ul2～5個胚胎/液滴蓋油（石蠟油、礦物油）液滴礦物油液滴液滴集合培養(yǎng)——方法20～50ul液滴礦物油液滴液滴116集合培養(yǎng)缺點：不利于單個胚胎的連續(xù)觀察解決1：按Day3形態(tài)學評分分組培養(yǎng)8細胞碎片0～10％8細胞碎片20～40％6細胞碎片20～50％集合培養(yǎng)缺點：不利于單個胚胎的連續(xù)觀察解決1：按Day3形態(tài)117解決2：特殊培養(yǎng)皿液滴解決2：液滴118培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類水、離子碳水化合物氨基酸pH值及緩沖物質(zhì)維生素，抗生素螯合劑抗氧化物質(zhì)蛋白質(zhì)，大分子激素，生長因子培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類119培養(yǎng)液種類序貫培養(yǎng)液單一培養(yǎng)液培養(yǎng)液種類序貫培養(yǎng)液120序貫培養(yǎng)mmol/LGardner,1998序貫培養(yǎng)mmol/LGardner,1998121序貫培養(yǎng)葡萄糖不利于分裂期胚胎發(fā)育囊胚主要能量來源EDTA利于分裂期胚胎發(fā)育抑制囊胚內(nèi)細胞團發(fā)育氨基酸序貫培養(yǎng)葡萄糖122序貫培養(yǎng)系統(tǒng)Day1~Day3:卵裂期培養(yǎng)液Day3~Day6：囊胚培養(yǎng)液序貫培養(yǎng)系統(tǒng)Day1~Day3:卵裂期培養(yǎng)液123單一培養(yǎng)液？單一培養(yǎng)：簡化流程，形成率類似Day3換液Day3不換液！單一培養(yǎng)液？單一培養(yǎng)：簡化流程，形成率類似124pH值與緩沖物質(zhì)pH：代表氫離子濃度pH與細胞各種生理功能關系極密切pH指示劑：酚紅緩沖物質(zhì)：維持pH穩(wěn)定，成對或一種：碳酸鹽緩沖對、MOPS、HEPES1pH值147pH值與緩沖物質(zhì)pH：代表氫離子濃度1pH值147125pH值與CO2濃度最重要的緩沖對碳酸鹽緩沖對：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕pH值與CO2濃度最重要的緩沖對pH=pKa+lg（————126培養(yǎng)系統(tǒng)的pH值7.2-7.4碳酸鹽體系不穩(wěn)定！暴露空氣會使PH迅速升高蓋油減少培養(yǎng)基氣體交換培養(yǎng)系統(tǒng)的pH值7.2-7.4127CO2濃度影響因素設定值：5%？6%傳感器類型培養(yǎng)箱開門方式溫度、濕度CO2濃度影響因素設定值：5%？6%128無機離子參與滲透壓形成高濃度氯化鈉不利于鼠囊胚形成胞外鎂和鈣的水平與早期胚胎細胞對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)能力有關磷在含有葡萄糖的簡單培養(yǎng)基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的發(fā)育無機離子無機離子參與滲透壓形成無機離子129銨氨基酸代謝及自然分解產(chǎn)生的氨會導致胚胎毒性物質(zhì)-銨離子的積累銨離子可以改變胚胎分化、代謝及基因表達會嚴重降低移植后種植率及胎兒發(fā)育率銨氨基酸代謝及自然分解產(chǎn)生的氨會導致胚胎毒性物質(zhì)-銨離子的積130抗生素培養(yǎng)基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素主要作用時防止培養(yǎng)基的細菌污染抗生素培養(yǎng)基中一般均含抗生素例如青霉素、鏈霉素和慶大霉素131蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效應如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血漿蛋白粉、5%血漿蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)白蛋白可以降低配子和胚胎表面電荷，避免其132阻止培養(yǎng)液的蒸發(fā)及培養(yǎng)基pH的變化種類：礦物油石蠟油油阻止培養(yǎng)液的蒸發(fā)及培養(yǎng)基pH的變化油133培養(yǎng)液儲運冷鏈運輸，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器導致培養(yǎng)液堿化，鎂離子沉淀減少細菌污染風險培養(yǎng)液儲運冷鏈運輸，2~8℃134分裝目的：減少開瓶次數(shù)分裝量：根據(jù)使用情況，一次一支分裝容器，與量匹配標記分裝日期分裝目的：減少開瓶次數(shù)135胚胎移植－移植時期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植在體內(nèi)此時的胚胎是在輸卵管內(nèi)，而不是在子宮內(nèi)卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植胚胎移植－移植時期廣泛采用D3（約8-cell）胚胎移植136囊胚培養(yǎng)進一步篩選胚胎靈活的移植時間便于PGD/PGS減少異位妊娠囊胚培養(yǎng)進一步篩選胚胎137囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta2012年齡囊胚的整倍體率年齡與囊胚的整倍體率BarisAta201138人員及操作人員數(shù)量適當每項關鍵技術均至少2人能熟練實施確保足夠人力實現(xiàn)雙人復核衛(wèi)生部（衛(wèi)科教[2003]176號文件）規(guī)定，實驗室專業(yè)技術人員不得少于3人。年周期超過1000個周期的中心需要適當增加技術人員每名全職胚胎學家完成250~400周期/年人員及操作人員數(shù)量適當衛(wèi)生部（衛(wèi)科教[2003]176號文件139人員及操作操作時間對卵、胚胎的應激核對人員及操作操作時間140胚胎體外培養(yǎng)胚胎評估胚胎體外培養(yǎng)141卵巢刺激后獲得的胚胎發(fā)育潛能不一致減少移植胚胎數(shù)，挑選正確的胚胎！胚胎評估、胚胎選擇是IVF實驗室技術中的核心卵巢刺激后獲得的胚胎發(fā)育潛能不一致142常規(guī)胚胎形態(tài)學評估始于第一例IVF-ET1981年Edwards闡述了形態(tài)學評估的方法常規(guī)胚胎形態(tài)學評估始于第一例IVF-ET143胚胎形態(tài)學評估多種評分體系可進行胚胎形態(tài)學評估缺點依賴操作者主觀能力優(yōu)勢快速而有效胚胎形態(tài)學評估多種評分體系可進行胚胎形態(tài)學評估144Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由資深胚胎學家組成的國際組織Alpha“Toadvancetheartand145Alpha共識embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistAlpha共識embryomorphology146Istanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010Istanbulconsensusworkshopon147胚胎的形態(tài)學指標透明帶極體卵周隙胚胎形狀裂球數(shù)量裂球形狀裂球排列原核碎片多核顆?？张葜旅芑遗咔淮笮CM形狀TE細胞數(shù)早卵裂胚胎的形態(tài)學指標透明帶胚胎形狀原核碎片致密化囊胚腔大小早卵裂148Righttime，rightembryo！Righttime，149評估時間觀察內(nèi)容受精后時間Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst評估時間觀察內(nèi)容受精后時間Expectedstageof150原核期評分1998年前后提出原核核仁的數(shù)量，排列原核大小及排列胞漿狀態(tài)2001年,原核期評分能夠預測囊胚形成，與妊娠率相關近10余年一直存在爭議，研究多為回顧性2011年time-lapse：對評分方法提出質(zhì)疑原核期評分1998年前后提出2001年,原核期評分能夠預測囊151原核期評分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB原核期評分GradeRatingDescription1Sy152早卵裂24～27小時的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是發(fā)育能力的重要標志后多人研究證實早卵裂24～27小時的第一次分裂153分裂對稱性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評分分裂對稱性卵裂球均等性012012Day2卵裂期評分154Day3細胞數(shù)Edwards提出人早期胚胎有相對固定的發(fā)育速度超出或低于此速度，均影響后續(xù)發(fā)育大量文獻：細胞數(shù)——種植率、囊胚形成率！Day3細胞數(shù)Edwards提出人早期胚胎有相對固定的發(fā)育155[i]

AlikaniM.HumReprod2000[i]AlikaniM.HumReprod200156碎片碎片：無細胞核，細胞膜包裹的細胞外胞漿結構（Alikani，1999）細胞代謝或分裂過程異常造成的凋亡過程染色體異常造成碎片？僅僅是目前我們對碎片的認識碎片碎片：無細胞核，細胞膜包裹的細胞外胞漿結構（Alikan157“細胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um“細胞”大小與DNADay2胚胎，卵裂球65-70um45u158碎片對胚胎發(fā)育的后續(xù)影響——局部融合Day4可能發(fā)生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外碎片對胚胎發(fā)育的后續(xù)影響——局部融合Day4可能發(fā)生局部融合159局部融合——囊胚質(zhì)量下降局部融合——囊胚質(zhì)量下降160卵裂球?qū)ΨQ性文獻非常少卵裂球嚴重不均勻的胚胎種植率下降Hardarson，2001卵裂球?qū)ΨQ性文獻非常少161多核現(xiàn)象可能與染色體異常有關囊胚形成率下降種植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007多核現(xiàn)象可能與染色體異常有關162Day3胚胎形態(tài)學評價細胞數(shù)與碎片含量，哪個指標更重要？在所有形態(tài)學指標中，細胞數(shù)是最重要的獨立的預測胚胎活性的指標！RonitMachtinger，2013Day3胚胎形態(tài)學評價細胞數(shù)與碎片含量，哪個指標更重要？在163細胞數(shù)與囊胚形成率北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN細胞數(shù)與囊胚形成率北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PU164碎片、細胞數(shù)與day6囊胚形成北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科PUMCH－OBGYN碎片、細胞數(shù)與day6囊胚形成北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)165卵裂期胚胎評估細胞數(shù)少于8個＝種植能力下降多于8個＝種植率可能下降碎片:定義:d2<45μm;d3<40μm分級：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要記錄碎片位置多核現(xiàn)象:一個卵裂球內(nèi)超過一個細胞核;d2評估細胞大小:2-,4-,和8-cell階段應均勻卵裂期胚胎評估細胞數(shù)166卵裂期胚胎分級GradeRatingDescription1Good