ELISA的原理與應(yīng)用-很詳細(xì)課件

ELISA知識(shí)簡(jiǎn)介03/11/15ELISA知識(shí)簡(jiǎn)介03/11/1511.

ELISA的原理2.

ELISA的類(lèi)型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑結(jié)合物酶底物的準(zhǔn)備4.對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷

1.ELISA的原理ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA）?；A(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.

ELISA的原理ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA酶免疫測(cè)定類(lèi)型

這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定類(lèi)型這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)1.1抗原抗體反應(yīng)

1.1.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。1.1抗原抗體反應(yīng)1.1.1可逆性抗原與抗體結(jié)1.1.2特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

1.1.2特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與1.1.3最適比例

1.1.3最適比例1.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。1.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平1.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。1.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用2ELISA的類(lèi)型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。2ELISA的類(lèi)型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和2.2.3間接法測(cè)抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。2.2.3間接法測(cè)抗體傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。

2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心2.2.6捕獲包被法測(cè)抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。2.2.6捕獲包被法測(cè)抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。2.2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；2.2.7ABS-ELISA法①：固相支持物；3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。ELISA的試劑準(zhǔn)備A固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白3.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。3.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。包被用抗原：3.1.4包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。3.1.4包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)3.1.5包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液 pH7.2的磷酸鹽緩沖液 pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。3.1.5包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃3.4洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。3.4洗滌液

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性2抗體（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游離的抗體（或抗原）4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。ELISA的試劑準(zhǔn)備B3.2結(jié)合物即酶標(biāo)記3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用純度較3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)3.2.4結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。3.2.4結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失3.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)?-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。3.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工試劑準(zhǔn)備C酶的底物試劑準(zhǔn)備C酶的底物3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(ureaperoxide)。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為3.5酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。3.5酶反應(yīng)終止液4對(duì)照設(shè)定

陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。4對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中. 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有5標(biāo)本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。5標(biāo)本的采取和保存體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马?xiàng)加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液顯色顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。顯色顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。6結(jié)果判斷

6.1定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。6結(jié)果判斷6.1定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有A.陽(yáng)性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。B.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。間接法和夾心法A.陽(yáng)性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對(duì)（2）競(jìng)爭(zhēng)法因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。a.陽(yáng)性判定值法陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX陽(yáng)性A≤陽(yáng)性判定值陰性A＞陽(yáng)性判定值

b.抑制率法抑制率（%）=（陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對(duì)照陽(yáng)性抑制率≥50%為陰性＜50%（2）競(jìng)爭(zhēng)法因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異4.7.2定量測(cè)定ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。4.7.2定量測(cè)定ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較4.ELISA的操作要點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.ELISA的操作要點(diǎn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的ELISA的原理與應(yīng)用--很詳細(xì)課件ELISA知識(shí)簡(jiǎn)介03/11/15ELISA知識(shí)簡(jiǎn)介03/11/15561.

ELISA的原理2.

ELISA的類(lèi)型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑結(jié)合物酶底物的準(zhǔn)備4.對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷

1.ELISA的原理ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA）。基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.

ELISA的原理ELISA是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA酶免疫測(cè)定類(lèi)型

這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定類(lèi)型這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)1.1抗原抗體反應(yīng)

1.1.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。1.1抗原抗體反應(yīng)1.1.1可逆性抗原與抗體結(jié)1.1.2特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

1.1.2特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與1.1.3最適比例

1.1.3最適比例1.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。1.1.4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平1.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。1.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用2ELISA的類(lèi)型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。2ELISA的類(lèi)型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和2.2.3間接法測(cè)抗體

傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。2.2.3間接法測(cè)抗體傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。

2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心2.2.6捕獲包被法測(cè)抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。2.2.6捕獲包被法測(cè)抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。2.2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；2.2.7ABS-ELISA法①：固相支持物；3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液3.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。ELISA的試劑準(zhǔn)備A固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白3.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。3.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。包被用抗原：3.1.4包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。3.1.4包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)3.1.5包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液 pH7.2的磷酸鹽緩沖液 pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。3.1.5包被的條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃3.4洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。3.4洗滌液

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性2抗體（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游離的抗體（或抗原）4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。ELISA的試劑準(zhǔn)備B3.2結(jié)合物即酶標(biāo)記3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用純度較3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)3.2.4結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。3.2.4結(jié)合物的保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失3.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)?-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。3.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工試劑準(zhǔn)備C酶的底物試劑準(zhǔn)備C酶的底物3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。DH2+H2O2

D+2H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(ureaperoxide)。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為3.5酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。3.5酶反應(yīng)終止液4對(duì)照設(shè)定

陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。4對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中. 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有5標(biāo)本的采取和保存

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。5標(biāo)本的采取和保存體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马?xiàng)加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也