第五章高效液相色譜法課件

2023/1/4第五章

高效色譜分析法一、高效液相色譜法概述二、高效液相色譜的類型及選擇三、高效液相色譜儀四、液相色譜固定相五、液相色譜流動相六、液相色譜分析方法2022/12/11第五章

高效色譜分析法一、高效液相色譜法2023/1/4一、高效液相色譜法的特點液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用2022/12/11一、高效液相色譜法的特點液相色譜：以液體2023/1/4石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱

液相色譜是如何完成混合物的分離？

混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離2022/12/11石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱液相色譜是2023/1/4

分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，占有機物的20%流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機物的80%流動相為液體或各種液體的混合。它除了起運載作用外，還可通過溶劑來控制和改進分離。室溫、高壓下進行2022/12/11

分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC2023/1/4二、高效液相色譜的類型及選擇1.分配色譜（液-液分配色譜）液液分配色譜法固定相將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類型極性固定相：正相色譜（適合于分析極性化合物）以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜（適合于分析非極性化合物）反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。2022/12/11二、高效液相色譜的類型及選擇1.分2023/1/4反相液相色譜

流動相極性大于固定相極性

正相液相色譜

流動相極性小于固定相極性

2022/12/11反相液相色譜2023/1/4正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出液液分配色譜2022/12/11正相色譜法反相色譜法1.極性固定相2023/1/42.吸附色譜（液-固吸附色譜）

液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸2022/12/112.吸附色譜（液-固吸附色譜）2023/1/4吸附脫附再吸附再脫附

…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程。液固吸附色譜法分離機理2022/12/11吸附液固吸附色譜法分離機理2023/1/4離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液2.離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－2022/12/11離子交換色譜法2.離子交換色譜法ＳＯ４2023/1/4離子交換色譜法分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應(yīng)用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。分析物質(zhì)有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機理2022/12/11離子交換色譜法離子交換色譜法分離機理2023/1/44.凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。2022/12/114.凝膠色譜（空間排阻色譜）2023/1/4正確地選擇色譜類型盡可能多的了解樣品性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)極性和穩(wěn)定程度水中和有機溶劑中溶解度相對分子質(zhì)量的大小熟悉各種色譜類型主要特點應(yīng)用范圍色譜類型選擇2022/12/11正確地選擇色譜類型色譜類型選擇2023/1/4色譜類型選擇2022/12/11色譜類型選擇2023/1/4問題討論按固定相與流動相相對極性的不同，液液分配色譜可分為哪兩類方法？現(xiàn)在有A、B兩物質(zhì)，極性A＞B，問在兩種液液分配色譜上的出峰順序如何？宜用何種HPLC方法分離下列物質(zhì)？(1)乙醇和丁醇；(2)Ba2+和Sr2+；(3)高摩爾質(zhì)量的葡糖苷2022/12/11問題討論按固定相與流動相相對極性的不同，2023/1/4三、高效液相色譜儀1.流程2022/12/11三、高效液相色譜儀1.流程2023/1/4液相色譜法分析流程2022/12/11液相色譜法分析流程2023/1/42.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性高壓輸液泵將貯液器中的流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導(dǎo)入，流動相將樣品依次帶入預(yù)柱、色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至工作站記錄、處理和保存。

2022/12/112.主要部件(1)高壓輸液泵高壓輸液2023/1/4(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/12/11(2)梯度淋洗裝置外梯度:2023/1/4(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/11(3)進樣裝置流路中為高壓力工2023/1/4液相色譜進樣針：類似于氣相色譜進樣針，只是其針頭為平頭，以免扎破六通閥管路。用于可變體積進樣自動進樣器2022/12/11液相色譜進樣針：類似于氣相色自動2023/1/4(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長10～30cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/12/11(4)高效分離柱柱2023/1/4色譜柱分離系統(tǒng)的主要部件是色譜柱，柱效高、選擇性好、分析速度快是對色譜柱的一般要求。安裝和更換色譜柱時一定要使流動相能按箭頭所指方向流動。一般在色譜柱前要求安裝保護柱，起到保護延長分析柱壽命的作用。有些物質(zhì)的分離條件要求有一定的溫度，因此，給色譜柱配一個柱溫箱是非常有必要的。2022/12/11色譜柱2023/1/4(5)高效液相色譜檢測器紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）熒光檢測器示差折光檢測器電導(dǎo)檢測器蒸發(fā)激光散射檢測器常用檢測器2022/12/11(5)高效液相色譜檢測器紫外檢測器（包2023/1/4紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，A＝KCL優(yōu)點：1）靈敏度高

2）對溫度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)2022/12/11紫外光度檢測器（UV）：2023/1/4光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/11光電二極管陣列檢測器光電

樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處得到一吸光度值二極管陣列檢測器樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處2023/1/41）采集三維譜圖2）峰純度檢驗3）光譜庫檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰二極管陣列檢測器的優(yōu)點2022/12/111）采集三維譜圖二極管陣列檢測器的優(yōu)點2023/1/4原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測優(yōu)點：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器之一

2）選擇性好

3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）熒光檢測器2022/12/11原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢2023/1/4打開工作站，選擇工作通道編輯方法文件，設(shè)置方法名稱、運行時間及定量方法輸入路徑名、樣品名、操作者等樣品分離完成后，記錄譜圖文件名和色譜峰峰高、峰面積和保留值等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2022/12/11打開工作站，選擇工作通道數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2023/1/4

1.液-固色譜固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

四.液相色譜固定相2022/12/111.液-固色譜固定相種類：2023/1/4

2.液-液色譜固定相

（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2022/12/112.液-液色譜固定相（2）2023/1/4（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相。

采用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合相。優(yōu)點是使用過程不流失，化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好。2022/12/11（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵2023/1/4化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2022/12/11化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無2023/1/43.離子交換色譜固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）2022/12/113.離子交換色譜固定相結(jié)構(gòu)類2023/1/44.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2022/12/114.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠2023/1/4氣相色譜中的固定相原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。2022/12/11氣相色譜中的固定相原則上2023/1/4五.液相色譜流動相1流動相特性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2022/12/11五.液相色譜流動相1流動相特性2023/1/42流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2022/12/112流動相類別按流動相2023/1/43流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2022/12/113流動相選擇在選擇溶劑2023/1/4流動相的選擇原則：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配2022/12/11流動相的選擇原則：2023/1/4溶劑等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子水的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率2022/12/11溶劑等級水的等級波長(nm2023/1/4甲醇乙睛正己烷分析純級(實線）和HPLC級溶劑（虛線）的吸光度比較溶劑等級2022/12/11甲醇2023/1/4緩沖液的使用

使用前必須過濾使用后一定要對柱子進行清洗，以免造成腐蝕、磨損及阻塞:首先用純水沖洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用甲醇沖洗30min(0.1-0.5ml/min)

易受到細菌和霉菌的影響溶劑等級注意沖洗次序，不能直接用有機溶劑沖洗2022/12/11緩沖液的使用使用前必須過濾溶劑2023/1/4過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小物理顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是在使用無機鹽配制的緩沖液的時候必須過濾脫氣：除去在流動相中溶解或彼此混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

無在線脫氣應(yīng)注意：

1）每天脫氣

2）如使用氦脫氣，對混合溶劑脫氣時間不能過長溶劑前處理2022/12/11過濾：0.45um或更小孔徑濾膜溶劑2023/1/4配制流動相把二次蒸餾水和色譜純級甲醇以一定比例混合取混合均勻的溶液，經(jīng)0.45μm的有機膜過濾，再脫氣15分鐘即可2022/12/11配制流動相取混合均勻的溶液，2023/1/4選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022/12/11選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量2023/1/4六、液相色譜分析方法色譜分析的目的對未知組分進行定性分析對已知組分進行定量分析根據(jù)色譜圖上某個色譜峰的保留時間和該色譜峰在檢測器上的響應(yīng)強度，對該譜峰初步定性和定量分析。2022/12/11六、液相色譜分析方法色譜分析的目的2023/1/4鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性 即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份2022/12/11鑒別每個色譜峰2023/1/41已知物保留值直接對照法定性未知峰保留值(t’R)與某標準物完全相同，可初步確定為同一物質(zhì)改變色譜柱或流動相組成，二者保留值仍完全相同，則可認定為同一物質(zhì)優(yōu)點：簡單缺點：適用范圍窄；必須有標準物質(zhì)2022/12/111已知物保留值直接對照法定性2023/1/4用“標樣”的保留值定出被測組份的位置2022/12/11用“標樣”的保留值定出被測組份的位置2023/1/42利用文獻保留值數(shù)據(jù)進行比對定性文獻報道的保留值數(shù)據(jù)只能作為定性參考，液相色譜柱填柱技術(shù)復(fù)雜，重現(xiàn)性差；條件不允許，難以得到相同色譜條件（儀器色譜柱、試劑等）可根據(jù)文獻數(shù)據(jù)和對照品選用已知標準物，再用已知標準物進行定性3利用已知物增加峰高法定性將已知標準物質(zhì)加到待測樣品，若某一峰增高，且改變色譜柱或流動相組成后仍能使該峰增高，則可基本認定該峰與已知標準物為同一物質(zhì)。2022/12/112利用文獻保留值數(shù)據(jù)進行比對定性3利2023/1/4如果標準物質(zhì)缺乏或難以獲得；或由于結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)相似，很多物質(zhì)具有十分接近，甚至相同的保留值，則保留值定性準確度存在疑問紅外光譜、紫外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜對有機化合物有很強的定性能力，可用于定性HPLC-紫外光譜已作為液相色譜的常規(guī)檢測器使用；HPLC-MS和HPLC-NMR也十分成熟。2022/12/11如果標準物質(zhì)缺乏或難以獲得；或由于結(jié)構(gòu)、2023/1/4在定性的基礎(chǔ)上定量,需有純物質(zhì)作為標準物液相色譜定量是相對定量的方法:即由已知量的純標樣推算混合物中被測物的量液相色譜法定量的依據(jù)是:被測組分的量與響應(yīng)值(峰高或峰面積)成正比由已知量的標樣可求得定量校正因子定量校正因子:是定量計算公式中的比例常數(shù),其物理意義是單位響應(yīng)值(峰面積)所代表的被測組分的量測定未知組分的響應(yīng)值,通過定量校正因子即可求得其含量2022/12/11在定性的基礎(chǔ)上定量,需有純物質(zhì)作為標準物2023/1/4常用定量分析方法歸一化法標準曲線法內(nèi)標法按測量參數(shù)分為峰面積法和峰高法2022/12/11常用定量分析方法2023/1/4項目內(nèi)容定量方法歸一化法要求1、樣品中各組分均出峰，完全分離，且均有響應(yīng)；2、進樣量無須準確。計算公式方法特點優(yōu)點：簡便、精確，進樣量的多少與測定結(jié)果無關(guān)，操作條件（如流速，柱溫）的變化對定量結(jié)果的影響較小。但由于液相色譜所用檢測器為選擇性檢測器，對很多組分沒有響應(yīng)，因此液相色譜法較少使用歸一化法。1.歸一化法2022/12/11項目內(nèi)容定量方法歸一化法要求1、樣品中各2023/1/4用高效液相色譜法測定吲哚二羧酸中主成分的含量，已知在分析條件下所有組分都出峰，且分離完全，根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算吲哚羧酸中主成分（出峰時間在5.7min左右）的含量。序號12345保留時間/min3.543.964.825.727.15峰面積/mV?min762011694460553251064372解：2022/12/11用高效液相色譜法測定吲哚二羧酸中主成2023/1/42.外標法工作曲線法外標一點法2022/12/112.外標法工作曲線法2023/1/4配制一系列已知濃度的標樣2022/12/11配制一系列已知濃度的標樣2023/1/4實際色譜圖標準曲線2022/12/11實際色譜圖標準曲線計算公式特點無需各組份都被檢出、洗脫需要標樣標樣及樣品測定的條件要一致進樣體積要準確計算公式內(nèi)標法定量配制一系列濃度的標樣，其中加有內(nèi)標樣內(nèi)標法定量配制一系列濃度的標樣，其中加有內(nèi)標樣實際色譜圖標準曲線實際色譜圖標準曲線計算公式：特點：無需各組份都被檢出、洗脫需要標樣，需要內(nèi)標樣結(jié)果與進樣體積無關(guān)計算公式：對內(nèi)標物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好對內(nèi)標物的要求2023/1/4第五章

高效色譜分析法一、高效液相色譜法概述二、高效液相色譜的類型及選擇三、高效液相色譜儀四、液相色譜固定相五、液相色譜流動相六、液相色譜分析方法2022/12/11第五章

高效色譜分析法一、高效液相色譜法2023/1/4一、高效液相色譜法的特點液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用2022/12/11一、高效液相色譜法的特點液相色譜：以液體2023/1/4石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱

液相色譜是如何完成混合物的分離？

混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離2022/12/11石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱液相色譜是2023/1/4

分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，占有機物的20%流動相為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小加溫常壓操作HPLC溶解后能制成溶液的樣品，高沸點、高分子量、難氣化、離子型的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機物的80%流動相為液體或各種液體的混合。它除了起運載作用外，還可通過溶劑來控制和改進分離。室溫、高壓下進行2022/12/11

分析對象及范圍流動相的選擇操作條件GC2023/1/4二、高效液相色譜的類型及選擇1.分配色譜（液-液分配色譜）液液分配色譜法固定相將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類型極性固定相：正相色譜（適合于分析極性化合物）以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜（適合于分析非極性化合物）反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。2022/12/11二、高效液相色譜的類型及選擇1.分2023/1/4反相液相色譜

流動相極性大于固定相極性

正相液相色譜

流動相極性小于固定相極性

2022/12/11反相液相色譜2023/1/4正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出液液分配色譜2022/12/11正相色譜法反相色譜法1.極性固定相2023/1/42.吸附色譜（液-固吸附色譜）

液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸2022/12/112.吸附色譜（液-固吸附色譜）2023/1/4吸附脫附再吸附再脫附

…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程。液固吸附色譜法分離機理2022/12/11吸附液固吸附色譜法分離機理2023/1/4離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液2.離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－2022/12/11離子交換色譜法2.離子交換色譜法ＳＯ４2023/1/4離子交換色譜法分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應(yīng)用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。分析物質(zhì)有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機理2022/12/11離子交換色譜法離子交換色譜法分離機理2023/1/44.凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。2022/12/114.凝膠色譜（空間排阻色譜）2023/1/4正確地選擇色譜類型盡可能多的了解樣品性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)極性和穩(wěn)定程度水中和有機溶劑中溶解度相對分子質(zhì)量的大小熟悉各種色譜類型主要特點應(yīng)用范圍色譜類型選擇2022/12/11正確地選擇色譜類型色譜類型選擇2023/1/4色譜類型選擇2022/12/11色譜類型選擇2023/1/4問題討論按固定相與流動相相對極性的不同，液液分配色譜可分為哪兩類方法？現(xiàn)在有A、B兩物質(zhì)，極性A＞B，問在兩種液液分配色譜上的出峰順序如何？宜用何種HPLC方法分離下列物質(zhì)？(1)乙醇和丁醇；(2)Ba2+和Sr2+；(3)高摩爾質(zhì)量的葡糖苷2022/12/11問題討論按固定相與流動相相對極性的不同，2023/1/4三、高效液相色譜儀1.流程2022/12/11三、高效液相色譜儀1.流程2023/1/4液相色譜法分析流程2022/12/11液相色譜法分析流程2023/1/42.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性高壓輸液泵將貯液器中的流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導(dǎo)入，流動相將樣品依次帶入預(yù)柱、色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至工作站記錄、處理和保存。

2022/12/112.主要部件(1)高壓輸液泵高壓輸液2023/1/4(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/12/11(2)梯度淋洗裝置外梯度:2023/1/4(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/11(3)進樣裝置流路中為高壓力工2023/1/4液相色譜進樣針：類似于氣相色譜進樣針，只是其針頭為平頭，以免扎破六通閥管路。用于可變體積進樣自動進樣器2022/12/11液相色譜進樣針：類似于氣相色自動2023/1/4(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長10～30cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/12/11(4)高效分離柱柱2023/1/4色譜柱分離系統(tǒng)的主要部件是色譜柱，柱效高、選擇性好、分析速度快是對色譜柱的一般要求。安裝和更換色譜柱時一定要使流動相能按箭頭所指方向流動。一般在色譜柱前要求安裝保護柱，起到保護延長分析柱壽命的作用。有些物質(zhì)的分離條件要求有一定的溫度，因此，給色譜柱配一個柱溫箱是非常有必要的。2022/12/11色譜柱2023/1/4(5)高效液相色譜檢測器紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）熒光檢測器示差折光檢測器電導(dǎo)檢測器蒸發(fā)激光散射檢測器常用檢測器2022/12/11(5)高效液相色譜檢測器紫外檢測器（包2023/1/4紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，A＝KCL優(yōu)點：1）靈敏度高

2）對溫度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)2022/12/11紫外光度檢測器（UV）：2023/1/4光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/11光電二極管陣列檢測器光電

樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處得到一吸光度值二極管陣列檢測器樣品池二極管陣列光柵D2/W燈每一組分可在每一波長處2023/1/41）采集三維譜圖2）峰純度檢驗3）光譜庫檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰二極管陣列檢測器的優(yōu)點2022/12/111）采集三維譜圖二極管陣列檢測器的優(yōu)點2023/1/4原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測優(yōu)點：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器之一

2）選擇性好

3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）熒光檢測器2022/12/11原理：基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢2023/1/4打開工作站，選擇工作通道編輯方法文件，設(shè)置方法名稱、運行時間及定量方法輸入路徑名、樣品名、操作者等樣品分離完成后，記錄譜圖文件名和色譜峰峰高、峰面積和保留值等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2022/12/11打開工作站，選擇工作通道數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2023/1/4

1.液-固色譜固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

四.液相色譜固定相2022/12/111.液-固色譜固定相種類：2023/1/4

2.液-液色譜固定相

（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2022/12/112.液-液色譜固定相（2）2023/1/4（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相。

采用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合相。優(yōu)點是使用過程不流失，化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好。2022/12/11（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵2023/1/4化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2022/12/11化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無2023/1/43.離子交換色譜固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）2022/12/113.離子交換色譜固定相結(jié)構(gòu)類2023/1/44.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2022/12/114.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠2023/1/4氣相色譜中的固定相原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。2022/12/11氣相色譜中的固定相原則上2023/1/4五.液相色譜流動相1流動相特性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2022/12/11五.液相色譜流動相1流動相特性2023/1/42流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2022/12/112流動相類別按流動相2023/1/43流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2022/12/113流動相選擇在選擇溶劑2023/1/4流動相的選擇原則：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配2022/12/11流動相的選擇原則：2023/1/4溶劑等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子水的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率2022/12/11溶劑等級水的等級波長(nm2023/1/4甲醇乙睛正己烷分析純級(實線）和HPLC級溶劑（虛線）的吸光度比較溶劑等級2022/12/11甲醇2023/1/4緩沖液的使用

使用前必須過濾使用后一定要對柱子進行清洗，以免造成腐蝕、磨損及阻塞:首先用純水沖洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用甲醇沖洗30min(0.1-0.5ml/min)

易受到細菌和霉菌的影響溶劑等級注意沖洗次序，不能直接用有機溶劑沖洗2022/12/11緩沖液的使用使用前必須過濾溶劑2023/1/4過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小物理顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是在使用無機鹽配制的緩沖液的時候必須過濾脫氣：除去在流動相中溶解或彼此混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

無在線脫氣應(yīng)注意：

1）每天脫氣

2）如使用氦脫氣，對混合溶劑脫氣時間不能過長溶劑前處理2022/12/11過濾：0.45um或更小孔徑濾膜溶劑2023/1/4配制流動相把二次蒸餾水和色譜純級甲醇以一定比例混合取混合均勻的溶液，經(jīng)0.45μm的有機膜過濾，再脫氣15分鐘即可2022/12/11配制流動相取混合均勻的溶液，2023/1/4選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉