分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件

RNA干擾及其它小RNA

(RNAinterference

andothersmallRNAs)RNA干擾及其它小RNA

(RNAinterferenc1BreakthroughoftheYearmiRNA----2002RNAi(siRNA)----2001BreakthroughoftheYearmiRNA-2

2006年10月2日瑞典皇家科學院諾貝爾獎委員會宣布，將2006年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予兩名美國科學安德魯·法爾和克雷格·梅洛，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。

法爾和梅洛將分享一千萬瑞典克朗的獎金(137萬美元、107萬歐元)。

RNA干擾獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎2006年10月2日瑞典皇家科學院諾貝爾獎委3諾貝爾獎評審委員會發(fā)布的公報說：法爾和梅洛獲獎是因為他們“發(fā)現(xiàn)了控制遺傳信息流動的基本機制”，這一機制為控制基因信息提供了基礎性的依據。公報指出，RNA干擾已被廣泛用作研究基因功能的一種手段，并有望在未來幫助科學家開發(fā)出治療疾病的新療法。RNA干擾機制的發(fā)現(xiàn)使得科學家可以對侵入細胞的病毒RNA進行控制。諾貝爾獎評審委員會指出，RNA干擾機制將來有望應用于臨床醫(yī)學和農業(yè)等眾多領域，用來開發(fā)針對病毒感染、心血管疾病和癌癥等的新療法。諾貝爾獎評審委員會發(fā)布的公報說：4“我隱約覺得是有可能獲獎的。但我只有45歲，所以我想或許在一二十年內才會發(fā)生?！痹诮邮苈吠干绮稍L時，馬薩諸塞大學教授克雷格·梅洛(CraigMello)如是說。

斯坦福大學教授安德魯·法爾(AndrewFire)今年也只有47歲。“我隱約覺得是有可能獲獎的。但我只有45歲，所5安德魯?菲爾(AndrewZ.Fire)克雷格?梅洛(CraigC.Mello)安德魯?菲爾(AndrewZ.Fire)克雷格?梅洛(Cr6RNA干擾的發(fā)現(xiàn)安德魯?菲爾(AndrewZ.Fire)、克雷格?梅洛(CraigC.Mello)1998年發(fā)現(xiàn)了RNA干擾和基因沉默現(xiàn)象。其論文發(fā)表在1998年Feb19的NATRUE雜志上。FireA,XuS,MontgomeryMK,KostasSA,DriverSE,MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.

Nature,1998,391(6669):806-811.RNA干擾的發(fā)現(xiàn)安德魯?菲爾(AndrewZ.7分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件81998年2月發(fā)表于英國《自然》雜志的一篇RNA干擾論文。不少同行迅速意識到這篇論文的非凡價值。梅洛實驗室的博士后劉棘當時在佐治亞大學攻讀博士。她清楚地記得，其導師基普里奧斯(EdwardKipreos)讀到那篇論文時就嘀咕，“這家伙大概會獲諾貝爾獎”。

通常，從研究成果發(fā)表到獲得諾貝爾獎，需要一二十年甚至更多時間，因為成果的準確性和重要性都需要科學界的反復驗證。但法爾和梅洛僅僅等待了8年，其獲獎速度之快實屬罕見。1998年2月發(fā)表于英國《自然》雜志的一篇RNA9生理醫(yī)學獎的評選程序大致為：卡羅琳醫(yī)學院的諾貝爾大會任命一個工作委員會——諾貝爾委員會(Nobel

Committee)負責前期工作。

邀請生理醫(yī)學領域的代表提名候選人，提名截至日期為每年2月1日。

諾貝爾委員會對提名進行初步篩選，然后候選人提交給諾貝爾大會。

諾貝爾大會最終決定得主，并對外公布(一般在每年10月份)。

每年12月10日在斯德哥爾摩音樂廳舉行頒獎儀式。生理醫(yī)學獎的評選程序大致為：卡羅琳醫(yī)學院的諾貝10RNA干擾的傳奇故事中心法則雙鏈DNA——單鏈RNA蛋白質轉錄逆轉錄翻譯反義RNARNA干擾的傳奇故事中心法則轉錄逆轉錄翻譯反義RNA11分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件12RNA干擾的傳奇故事

很早以前，就有科學家在植物中觀察到了基因“沉默”的現(xiàn)象。RNA干擾的傳奇故事很早以前，就有科學家在13RNAi發(fā)現(xiàn)歷程：1990年，來自于美國和荷蘭的兩個轉基因植物實驗組給矮牽?；ú迦胍环N催生紅色素的基因，希望能夠讓花朵更鮮艷。但意想不到的事發(fā)生了：矮牽?；ㄍ耆噬?，花瓣變成了白色！??RNAi發(fā)現(xiàn)歷程：14事實上，不但導入的基因沒有表達，而且植物本身的色素合成基因也受到某種程度的抑制，這種現(xiàn)象當時稱為共抑制(cosuppression)。事實上，不但導入的基因沒有表達，而且植物本身1594年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為基因壓制(quelling)。

94年Cogoni等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為基16

法爾和梅洛則首次在線蟲身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干擾。實際上，法爾在接受諾貝爾獎網站采訪時提到，第一個在線蟲中觀察到(RNA干擾)這種特別現(xiàn)象的是康奈爾大學研究生郭蘇。法爾和梅洛則首次在線蟲身上揭示，基因“沉默”的17分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件18分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件19

但可惜的是，她和坎菲斯一直沒能解釋這個奇怪現(xiàn)象。直到3年后，當時在卡內基研究所供職的法爾和梅洛才揭開了謎底：在郭蘇的實驗中，體外轉錄所得RNA污染了微量的雙鏈RNA，而經過純化的雙鏈RNA能夠高效率地阻斷相應基因的表達。這就是RNA干擾。

郭蘇目前在舊金山加州大學任職。她說：“他們在我們工作的基礎上，解釋了我們那個讓人迷惑的現(xiàn)象，是一個飛躍……我和坎菲斯通過話，我們的工作在這個獎項中有所貢獻，我們?yōu)榇烁械阶院?，也都認為安德魯·法爾和克雷格理應獲獎?！钡上У氖牵涂卜扑挂恢睕]能解釋這個奇怪現(xiàn)象20在實驗時，要認真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證明，不要被誤導。在實驗時，要認真觀察每個現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)懷疑并給予證21RNAi現(xiàn)象的普遍性

隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi也存在于水稻、煙草、果蠅、小鼠及人等幾乎所有的真核生物中。

RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內，RNAi能達到基因敲除的效果。RNAi現(xiàn)象的普遍性22PlantsC.elegansDrosophilaRNA-inducedsilencingcomplexRISCDoublestrandedRNAFungiCaplenetal.,PNAS(2001)989742Elbashiretal.,Nature(2001)411494MammalsS.pombeFireetal.,Nature(1998)391806sdsRNAprocessingRNAinterferenceNapolietal.,PlantCell(1990)2289VanderKroletal.,PlantCell(1990)2291SmallinterferingRNAs(SiRNAs)Romano&MacinoMol.Microbiol(1992)63343Volpeetal.,Science(2003)2921833Misquitta&PatersonPNAS(1999)961451Kennerdell&CarthewCell(1998)951017PlantsC.elegansDrosophilaRNA-23RNA干擾（RNAinterference，RNAi）

是指內源性或外源性雙鏈RNA（dsRNA）介導的細胞內mRNA發(fā)生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型缺失。這一現(xiàn)象屬于轉錄后的基因沉默機制(Posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。2006年世界科技十大新聞，2006年度諾貝爾化學與生理獎RNA干擾（RNAinterference，RNAi）24RNA干擾（RNAinterference，RNAi）

利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內同源mRNA,從而阻斷體內靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失表型的方法。（課本）RNA干擾（RNAinterference，RNAi）25RNAi作用機制RonaldPlasterk.Science2002RNAi作用機制RonaldPlasterk.Scien26基因沉默

轉錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)兩種：

TGS是指轉基因在細胞核內RNA合成受到了阻止而導致基因沉默；

PTGS則是指轉基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉錄，但在細胞質里卻無相應的mRNA存在這一現(xiàn)象?；虺聊?7

1998年Fire等在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來，陸續(xù)有報導在植物和果蠅等其他各種生物中也發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象但在哺乳動物細胞中，較長的dsRNA因能誘導IFN（干擾素）生成，mRNA能夠發(fā)生非特異性降解，不存在特異性的RNAi現(xiàn)象。但在2001年，Tuschl等報導說在哺乳動物中也存在RNAi現(xiàn)象，介導RNAi的中間物質是雙鏈小RNA（SmallinterferingRNA，siRNA)，只要dsRNA短于30bp，就不會促發(fā)干擾素效應，能夠特異性地降解靶mRNA，導致基因沉默，這一結果開辟了RNAi現(xiàn)象研究與應用的新領域。1998年Fire等在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以28RNAi的作用途徑大致可分為兩種：一種是以線蟲、真菌和植物為代表的RdRp（RNA-dependentRNApolymerase）途徑。

RNAi現(xiàn)象有一個靶RNA的大量產生過程，產生的靶RNA在Dicer的進一步作用下，產生大量的siRNA，達到有效濃度的siRNA能夠啟動RNAi機制，降解目標mRNA；RNAi的作用途徑大致可分為兩種：29“Transitive”RNAi.BindingofsiRNAsorshortantisenseRNAstoatargetmRNAmayprimeRNAsynthesisbyRdRPs.TheoriginalmRNAthatservedastemplateplusthecomplementaryRNAtogetherformdsRNAthatisrecognizedbyDicerandcleavedtoformsecondarysiRNAs.RdRPsinsomeorganismsmaybeabletosynthesizeRNAintheabsenceofpriming.“Transitive”RNAi.Bindingof30另一種途徑以果蠅和哺乳動物細胞為代表，外源或內源的雙鏈RNA在Dicer的切割下生成siRNA，這些siRNA與其他蛋白質形成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex）結構，能夠識別切割靶mRNA分子。

RNAi現(xiàn)象除了使生物體擁有抗病毒、穩(wěn)定轉座子和參與胚胎發(fā)育的生物學功能外，還可作為未知基因功能的逆向遺傳學的研究手段。另一種途徑以果蠅和哺乳動物細胞為代表，外源或內源的雙31MechanisticmodelforRNAi.dsRNA,whetherendogenouslyproducedorexogenouslyprovided,iscleavedbytheATP-dependentRNaseIII-likeenzymeDicer,producing21-to25-bpsiRNAswith2-nt3′overhangs.EachsiRNArecruitsaRISC(RNA-inducedsilencingcomplex）,whichunwindsthesiRNA,exposingeachstrandforpotentialbindingtocomplementarytargetsequences.Whenthenow-activatedRISC(RISC*)bindstoatargetmRNA,itcleavesitatasiteapprox10bpfromthe5′endofthesiRNA.Thisresultsintwocleavageproducts,onemissingitspolyAtailandtheotherits5′7-methylguanosinecap,makingeachvulnerabletoadditionaldegradationbymRNAsurveillancemachinery.Meanwhile,theactivatedRISCisfreetotargetadditionalmessages.MechanisticmodelforRNAi.ds32dsRNA介導的同源性靶mRNA降解過程分為兩步:

第一步（起始階段）是較長dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21-23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。

第二步（效應階段）是siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。

dsRNA介導的同源性靶mRNA降解過程分為兩步:

33RNAi作用機制RonaldPlasterk.Science2002RNAi作用機制RonaldPlasterk.Scien34

不同的生物中Dicer的種類、數量也不同至今在哺乳動物中僅發(fā)現(xiàn)了一種Dicer還未找到調節(jié)Dicer功能的蛋白質DicerRNaseIII樣酶不同的生物中Dicer的種類、數量也不同Dicer35RdRP(RNA-dependentRNApolymerase)最早是在一些非逆轉錄RNA病毒中發(fā)現(xiàn)以單鏈RNA為模板，按堿基配對原則合成其互補鏈，形成雙鏈RNA在西紅柿、擬南芥、線蟲等均發(fā)現(xiàn)其同源物，均參與了RNAi在真核生物中未發(fā)現(xiàn)有特別的功能在果蠅、人未發(fā)現(xiàn)其同源物，但存在有發(fā)揮其作用的替代物具有識別不同RNA的能力，起到“sensor”的作用RdRP(RNA-dependentRNApolymer36The“core”RNA-silencingresponseinvolvesprocessingofthetriggerdsRNAintosmaller21-to25-bpfragmentswithdinucleotide3′overhangsbyanadenosinetriphosphate(ATP)-dependentenzymenamedDicer.DicerencodesamultidomainproteincontaininganATP-dependentRNAhelicase,PAZdomain,twotandemRNaseIIIdomains,andadsRNA-bindingdomain.The21-to25-bpproductsofDiceractivityarereferredtoasshortinterferingRNAs(siRNAs),whicharethoughttoserveas“guides”tobringnucleasemachinerytothetargetmRNA:eachsiRNAassociateswithaproteincomplexcalledRNA-inducedsilencingcomplex(RISC),andpresumablythesiRNAisunwoundbyahelicasecomponentofRISCtoallowbasepairingbetweentheantisensestrandandthetargetmRNA.SuchbasepairingleadstoendonucleolyticcleavageofthetargetmRNA,producingonefragmentmissingitspolyAtailandtheothermissingits5′7-methylguanosinecap,leavingeachsegmentvulnerabletofurtherdegradationbyRNAsurveillancemachinery.Followingcleavage,itisthoughtthatthesiRNA/RISCcomplexbecomesavailabletotargetanothermessengermolecule。The“core”RNA-silencingrespo37RISC(RNA-inducedSilencingComplex)mRNA解旋酶核酸內切酶ArgonauteproteinsiRNA？？？250KD(inactive)100KD(active)ATPRISC包含siRNA中的一條鏈RISC(RNA-inducedSilencingCom38RISC(RNA-inducedSilencingComplex)mRNA解旋酶核酸內切酶ArgonauteproteinsiRNA？？？250KD(inactive)100KD(active)ATPRISC包含siRNA中的一條鏈RISC(RNA-inducedSilencingCom39RNAi途徑主要存在于細胞漿中，但是siRNA產生、靶mRNA降解的亞細胞位置尚未明確。外源性（注射或喂養(yǎng)）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接進入細胞漿中的RNAi途徑，僅在細胞漿中復制的RNA病毒可被dsRNA介導的沉默機制所抑制外源性dsRNA則還可導致細胞核中的同源早期RNA轉錄產物減少。

RNAi途徑主要存在于細胞漿中，但是siRNA產生、40BrendaBass.Nature2001長dsRNA在哺乳動物細胞會引起非特異性反應BrendaBass.Nature2001長dsRN41長dsRNA引起非特異性反應的途徑PhillipSharpetal.NatureReviews2002長dsRNA引起非特異性反應的途徑PhillipShar42

siRNA(smallinterferingRNA)P-AGUCCGUAACUGACUACGCUU-OHOH-UUUCAGGCAUUGACUGAUGCG-P5‘5‘3‘3‘21-23ntsiRNAThomasTuschletal，Nature2001可以在哺乳動物細胞中直接引發(fā)RNAisiRNA(smallinterferingRNA)43-----GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACUUCGAAAUGUC-----

5’CGUACGCGGAAUACUUCGAUUUUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU5’切割位點siRNA雙鏈靶mRNAThomasTuschletc.Cell2002-----GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACU44

在許多機體中反向重復轉基因序列在細胞核內轉錄成發(fā)夾dsRNA，進而可介導RNAi，這種dsRNA可能需要轉移至胞漿中才可有效地沉默同源靶mRNA。

如在果蠅中，轉錄含有內含子和多聚腺苷酸信號的發(fā)夾dsRNA的反向重復轉基因序列比轉錄不含內含子、不含多聚腺苷酸信號dsRNA的轉基因序列更能有效地沉默同源靶mRNA（因為內含子和多聚腺苷酸信號有利于dsRNA轉移入胞漿）。在許多機體中反向重復轉基因序列在細胞核內轉錄成發(fā)45

另外，內源性的小的短暫RNA（smalltemporalRNA，stRNA，為一種修飾后的miRNA）也可作為siRNA發(fā)揮基因沉默作用。

stRNA（miRNA）是約70nt發(fā)夾RNA（發(fā)夾miRNA前體，miRNAhairprecursor）被RNaseⅢ樣核酸酶切割加工成的單鏈~22ntRNA。由于stRNA與靶基因不完全互補，它從翻譯水平阻抑基因表達。另外，內源性的小的短暫RNA（smalltemp46

除上述RNAi機制外，轉基因真核生物中的dsRNA尚可引起相應基因的甲基化和染色質重構、凝集、異染色質化，基因甲基化和異染色質化還可能促使異常RNA（aberrantRNA）產生，最終導致基因沉默。除上述RNAi機制外，轉基因真核生物中的dsRNA47RNAi的放大效應機制

siRNA不僅可引導RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。

新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進入合成-切割的循環(huán)過程，進一步放大RNAi作用。這種合成-切割的循環(huán)過程稱為隨機降解性PCR（randomdegradativePCR）。RNAi的放大效應機制siRNA不僅可引導RIS48分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件49RNAi的特點☆轉錄后水平的基因沉默☆較高特異性：能夠非常特異地降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA。☆高效性：相對少量的dsRNA就可以使相應的基因表達受抑制☆可遺傳性及遠距離效應：RNAi基因表達的效應可以突破細胞的界限，可傳遞給子一代。RNAi的特點☆轉錄后水平的基因沉默50其它小RNAs及其作用其它小RNAs及其作用51MicroRNAs(miRNAs):

是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。據推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調控基因表達，但其機制區(qū)別于siRNA介導的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRNAs。MicroRNAs(miRNAs):52MicroRNAsPasquinellietal.,Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature(2000)40886Hutvágneretal.,ACellularFunctionfortheRNA-InterferenceEnzymeDicerintheMaturationofthelet-7SmallTemporalRNA.Science(2001)293834MicroRNAsoriginallyidentifiedinC.elegansasnon-codingRNAsof~22ntsprocessedfromaprecursorRNAof~80ntswithadefinedhairpinstructure.The22ntRNAspecies(Let7)wasrequiredfordevelopmentaltimingthroughinteractionwithanothertranscriptSubsequentlytherewasevidenceforaroleforDicerproteininpre-let-7processinginvitroandinvivo.MicroRNAsPasquinellietal.,53miRNA的特征:

大都是由具有發(fā)夾結構、約70個堿基大小形成發(fā)夾結構的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21-25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。miRNA的特征:54miRNAs的表達方式各不相同:部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據某種更為嚴謹的位相和時相的表達模式（amorerestrictedspatialandtemporalexpressionpattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。miRNAs的表達方式各不相同:55miRNA的功能

對microRNAs(miRNAs)的研究正在不斷增加，原因是科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經發(fā)現(xiàn)的數百個miRNAs中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性（differentialspatialandtemporalexpressionpatterns），提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。miRNA的功能

對microRNAs(miR56

第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，通過調控一組關鍵mRNAs的翻譯從而調控線蟲發(fā)育進程。第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的57

bantammiRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細胞分化和組織發(fā)育過程中起重要作用的基因的轉錄后調控，例如mir-14、mir-23等。bantammiRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)有原癌58在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過程。一是在carpelfactory(car)突變株中3個miRNAs的表達水平顯著下降。

CARPELFACTORY是一個類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs59

對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育(Reinhart2000)，細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡(Brennecke2003），脂肪代謝（Xu2003)和細胞分化(Kawasaki2003)。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關系(Calin2002)。對一部分miRNAs的研究分析提示：60

由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據推測miRNAs在高級真核生物體內對基因表達的調控作用可能和轉錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調控方式。

然而，大多數miRNAs的功能仍然是個謎。由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRN61miRNA和siRNA的關系

miRNA和siRNA之間的關系從表面上說，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩(wěn)定性；另一個是針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個轉錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調控基因表達。由于每個mRNA模版可能產生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進化進程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。miRNA和siRNA的關系

miRNA和siRNA62

然而，據推測miRNAs通常是由較大的（70-90nt）的莖環(huán)結構（發(fā)夾結構）前體經Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負責將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調控基因表達功能。因而這兩類小分子RNA之間的關系格外令人關注。

然而，據推測miRNAs通常是由較大的（70-9063

在哺乳動物細胞中還沒有找到內源的siRNA，外源的siRNA介導的RNAi作用正是一種抵御機制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關系的本質就顯得更加撲朔迷離。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關注的問題。在哺乳動物細胞中還沒有找到內源的siRNA，外源64未來要解決的問題

miRNAs在多個物種中廣泛被發(fā)現(xiàn)，而且在進化上高度保守。留給我們一大堆謎團：miRNA的確切功能是什么？它的目標靶是什么？作用機制是什么？未來要解決的問題

miRNAs在多個物種中廣泛65正如PhillipZamore說的：“如果miRNAs在進化的進程中如此高度保守而沒有任何實際功能，那真是大自然拿科研人員開涮——而且是一個殘酷的玩笑”。研究miRNA的新工具

隨著小分子RNA日益收受到研究人員的重視，很多研究小分子RNA的新方法不斷推出。正如PhillipZamore說的：“如果miR66siRNA與miRNA作用位置不同：對于siRNA（smallinterferingRNAs）而言，mRNA就是target,而且一般推薦設計siRNA時不能包含UTR區(qū)。其他的地方就可以籠統(tǒng)地叫off-target,靶之外.

對于miRNA（microRNAs）而言，3‘UTR區(qū)就叫target，而mRNA的CODINGREGION就是off-target。

MicroRNAsandsmallinterferingRNAscaninhibitmRNAexpressionbysimilarmechanisms--Zengetal_100(17)9779--ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences

SaxenaS,JonssonZO,DuttaA.SmallRNAswithimperfectmatchtoendogenousmRNArepresstranslation.Implicationsforoff-targetactivityofsmallinhibitoryRNAinmammaliancells.JBiolChem.2003Nov7;278(45):44312-9.Epub2003Sep2.siRNA與miRNA作用位置不同：對于siRNA（67分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件68piRNAs簡介piRNAs簡介69如果piRNAs研究趨勢與microRNAs相似的話，那么生物界將會由這些從事piRNA未知領域研究的科學家們帶來一股研究新浪潮。——洛克菲勒大學的ThomasTuschl（piRNAs的發(fā)現(xiàn)為2006年世界生物10大發(fā)現(xiàn)之一）如果piRNAs研究趨勢與microRNAs相似的70piRNA簡介

來自冷泉港實驗室的GregoryHannon研究小組和紐約洛克菲勒大學的ThomasTuschl研究小組的研究人員發(fā)現(xiàn)了數千種不同的哺乳動物小分子RNA的一個新成員——piRNAs（Piwi-interacting），該種小RNA在小鼠精子發(fā)育中普遍存在，并起到了重要作用。這一研究成果公布在2006/6月4日的《Nature》網絡版。piRNA簡介71

自2000年RNA研究進展被Science雜志評為年度重大科技突破之后，2001年的RNAi，2002年的“SmallRNA&RNAi”，以及2003年的小核糖核酸都相繼在重大科技成就上榜上有名。RNA研究風聲水起，就連在DNA的傳遞遺傳物質和蛋白的執(zhí)行功能這些“專長”方面也發(fā)現(xiàn)是由RNA最初具有的。

自2000年RNA研究進展被Science雜志評72

piRNA，即Piwi-interactingnucleotides在之前的發(fā)育精子研究中就發(fā)現(xiàn)其對于合子的形成的復雜過程中勢必可少的，但是它們的功能和起源仍然是不清楚的;piRNA，即Piwi-interacting73

研究人員主要的研究對象是來自無脊椎動物和小鼠中研究精子細胞發(fā)育過程中起重要作用的Piwi蛋白——這些蛋白分子組成了Argonaute家族蛋白的一個結構域，microRNA靶向Argonaute蛋白標志來使基因沉默。研究人員主要的研究對象是來自無脊椎動物和小鼠中74

兩個研究小組都分別對能與小鼠睪丸組織包含Piwi蛋白的核蛋白復合體免疫共沉的RNA進行了純化、克隆和測序。其中Tuschl和他的同事們的實驗利用了Piwi蛋白的同源蛋白MILI蛋白，而冷泉港實驗室的GregoryHannon則利用MIWI進行實驗。結果兩個研究小組都在他們的免疫共沉淀試驗中發(fā)現(xiàn)了21-23核苷酸長度的RNA分子。Hannon小組的Northern印跡分析顯示這些單鏈RNA與Piwi相連，而不是與其它Argonaute蛋白相連。兩個研究小組將這些RNA稱作Piwi-interactingnucleotides或者piRNA，并且發(fā)現(xiàn)與MIWI相比，MILI與稍微小一點的piRNA相結合。兩個研究小組都分別對能與小鼠睪丸組織包含Pi75

兩個小組發(fā)現(xiàn)大概90%的piRNA序列以尿嘧啶開始，與其它的小RNA分子的特點一樣。Hannon和他的同事們在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)了52,934種候選piRNAs，在人類中發(fā)現(xiàn)了52,099種，而在老鼠中發(fā)現(xiàn)了47,024種。在這些物種中，大部分piRNAs成簇形成相對少量的基因座（loci），小鼠中大約形成100個主要的基因簇。這種成簇現(xiàn)象表明大量的piRNA由長距離轉錄加工而成。兩個小組發(fā)現(xiàn)大概90%的piRNA序列以尿嘧啶76與microRNAs和siRNAs不一樣，piRNAs來源于單鏈RNA前體（precursor）而不是雙鏈RNA前體。Tuschl和他的同事們認為，與近親老鼠的基因組比較，小鼠的piRNA序列保守性良好，但是與遺傳距離較遠的物種相比，保守性較差。盡管如此，大部分小鼠的piRNA簇能在人和老鼠染色體上相同的位置找到。“它們就好象是染色體上某類基因的劃分地界線。這強有力的說明它們可能與染色體生物學有關?！盚annon說。與microRNAs和siRNAs不一樣，piRNA77PiRNAs在人內出現(xiàn)的豐度比小鼠小，假設piRNAs的功能是識別互補的信使RNA，也許人的RNA結合蛋白則代替了一些piRNAs的功能。RNA結合蛋白是人類基因組中最大種類的蛋白之一。兩個研究小組利用northernblotting分析發(fā)現(xiàn)piRNAs出現(xiàn)在小鼠的精子細胞中，尤其是在減數分離開始時大量積聚，在成熟的精子產物中消失?！拔覀儍H能在人類和小鼠的睪丸中發(fā)現(xiàn)piRNAs，它們也許在卵子的發(fā)育過程中也有表達，”Tuschl說。PiRNAs在人內出現(xiàn)的豐度比小鼠小，假設piRNA78“在精子細胞的減數分裂結束前，我們發(fā)現(xiàn)了基因轉錄的爆發(fā)，而在基因轉錄爆發(fā)前有巨大的、迅速的piRNAs最終爆發(fā)?！眮碜缘滋芈身f恩州立大學的StephenKrawetz說?！坝腥さ氖菚吹絧iRNAs是否參與轉錄的調節(jié)或者RNA的存儲?！?/p>

“在精子細胞的減數分裂結束前，我們發(fā)現(xiàn)了基因轉錄的爆79來自杜克大學綜合癌癥中心干細胞與生殖發(fā)育實驗室（LaboratoryofStemCellsandGermlineDevelopment）主任林海帆教授領導的研究小組在之前研究的基礎上，發(fā)現(xiàn)了在精子形成過程中大量表達的非編碼小RNA——PIWI-interactingRNAs(piRNAs)，這說明在胞質核蛋白（cytosolicribonucleoprotein）和多核糖體片段（polysomalfractions）中MIWI與piRNAs，以及mRNA有關聯(lián)。這一研究成果公布在8月24日美國國家科學院院刊PNAS雜志上。

之前冷泉港實驗室及洛克菲勒大學的研究人員發(fā)表在6月4日的《Nature》網絡版上提出了piRNAs的概念，他們發(fā)現(xiàn)了數千種不同的哺乳動物小分子RNA的一個新成員——piRNAs（Piwi-interacting），該種小RNA在小鼠精子發(fā)育中普遍存在，并起到了重要作用。來自杜克大學綜合癌癥中心干細胞與生殖發(fā)育實驗室（L80Lin實驗室在之前的文章中報道過MIWI這種鼠科PIWI家族成員在精子最初形成時是必須的——精子形成是一個roundspermatids發(fā)育成成熟精子的過程。進一步他們發(fā)現(xiàn)在早期精子形成的過程中，隨著ploysome的增加，MIWI也越來越多出現(xiàn)在polysomefractions中。而且MIWI也與mRNA帽子結合復合物（mRNAcap-bindingcomplex）相關。有趣的是，MIWI不僅對piRNAs的表達過程，而且對于一些miRNAs“子集”（subset）的轉錄都是必須的——無論是否有Dicer的存在。這些研究成果說明了MIWI對兩種不同類型的小RNA的形成和/或存在過程中扮演著一種復合的角色。Lin實驗室在之前的文章中報道過MIWI這種鼠科P81分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件82分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件83ImplicationsfortheidentificationandapplicationofRNAiBasicScience(基礎）RNA在基因表達調節(jié)中的中心作用RNAi在細胞對外界刺激的反應中的作用RNA和RNAi在宿主-病菌（外源核酸）的反應中的作用RoleofRNAiindiseaseinitiation,progressionandresponsetotherapyApplicationsAbiologicaltoolthatcanbeusedtotesthypothesesdrawnfromthelargeamountofgenetic,expressionandfunctionaldatanowavailable -Gene:proteinfunctiondiscoveryandanalysis -Pathway/networkanalysis -Moleculartargetidentification,validationandsynergisticinteractions -DrugDevelopment:mechanismofaction,drug/proteinrelationshipsEnableslargescalegene-phenotypeanalysisDevelopmentofnovelmodelsystemsDevelopmentofnovelRNAitherapeuticapproachesImplicationsfortheidentific84P-bodysequestration/RNAdegradationRNAiassociatedmechanismsNucleusCytoplasmExportin5DroshaDGCR8PashaDNAPrimarymiRNAPri-miRNAAAAATranscriptionPrecursormiRNAPre-miRNAProcessingIExportPre-miRNAProcessingII+ATPTranslationalblockadeTBRF:

TARRNAbindingproteinmiRNAAAAAEndogenousdsRNA

MicroRNAsAAAACleavagesiRNADICERRISCComplexFormationArgonauteProteinsdsRNAExogenousdsRNAs(invertebrates)TranscriptionalGeneSilencingandhetrochromatinmodificationP-bodysequestration/RNAiasso85RNAi在基因功能研究中的應用RNAi在基因功能研究中的應用86利用RNAi對進行單個特定基因進行功能缺失研究(knockdown)與基因敲除、反義核酸的比較

簡便特異高效用量少可同時抑制多個基因是反向遺傳學研究手段的革命性進展利用RNAi對進行單個特定基因進行功能缺失研究(knock87利用RNAi對模式生物進行全基因組功能缺失分析KimYong-Qu等分析了>5800個基因（約為估計的果蠅基因數目的40%）,發(fā)現(xiàn)了許多與果蠅心臟發(fā)育相關的基因Fraser等人用表達dsRNA文庫的大腸桿菌喂食線蟲，利用dsRNA引發(fā)的RNAi對基因表達的抑制作用，全面研究了線蟲I號染色體上約90%的基因，通過觀察RNAi后線蟲表型的改變獲得了大量基因功能的信息，使I號染色體上已知功能表型的基因的數目由原來的70個增加到378個利用RNAi對模式生物進行全基因組功能缺失分析KimYo88screeningstrategyinC.elegansJulieAhringeretal.methods2003useofRNAitoinhibitthefunctionof

86%ofthe19,427predictedgenesofC.elegans.identifiedmutantphenotypesfor1,722genes,abouttwo-thirdsofwhichwerenotpreviouslyassociatedwithaphenotype.screeningstrategyinC.elega89RNAi在疾病治療中的應用RNAi在疾病治療中的應用90抗腫瘤策略：針對腫瘤相關基因的siRNA可抑制腫瘤生長針對multidrugresistance(MDR)基因的siRNA可增加腫瘤細胞對藥物的敏感性針對腫瘤血管增生、細胞粘附分子、腫瘤轉移相關基因抗腫瘤策略：91分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件92分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件93分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件94通過降解特定的靶mRNA，阻斷特定的信號轉導通路FassiRNA用于降低肝炎的自身免疫反應引起的肝細胞損傷及纖維化直接針對病毒RNA的siRNA針對乙肝病毒mRNA的siRNA可抑制病毒復制、減少核抗原、表面抗原的產生目前僅限于培養(yǎng)細胞和小鼠實驗針對HIV病毒基因組的siRNA可抑制病毒復制病毒性疾病針對病毒蛋白的siRNA抑制病毒對宿主細胞的感染(HIV-1coreceptorCCR5,CXCR4,gag)針對病毒受體的siRNA，抑制病毒對宿主細胞的感染(CD4)針對丙肝病毒、流感病毒mRNA的siRNA可抑制病毒復制通過降解特定的靶mRNA，阻斷特定的信號轉導通路Fassi95RNAi與肝炎病毒

Shlomai和Shaul設計了各針對HBV基因19nt的兩種pSUPER載體：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已轉染含1.3XwtHBV基因質粒載體的Huh7細胞再被X-siRNA或core-siRNA轉染后，core蛋白水平分別降低了89%、63%，轉染X-siRNA的細胞中HBsAg降低60%，但轉染core-siRNA對HBsAg表達無明顯影響（X-siRNA干擾沉默了所有的病毒轉錄物，而core-siRNA僅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。RNAi與肝炎病毒Shlomai和Shaul設計了各96

另外，Randall等證明了針對HCVRNA的siRNA轉染細胞4天后可使細胞質中復制的HCVRNA降低80倍；將siRNA轉染至已有HCV感染、復制的細胞，siRNA對98%以上可檢測到HCV抗原、HCV復制活躍的細胞有抑制作用；siRNA干擾沉默HCVRNA具有劑量依賴性和序列特異性。Kapadia等也證明了siRNA特異抑制HCVRNA復制、阻止相關蛋白表達的作用。另外，Randall等證明了針對HCVRNA的si97RNAi與其它病毒HuWY等證明了siRNA能阻抑逆轉錄Rous肉瘤病毒（RSV）感染脊椎動物；

Leonid等發(fā)現(xiàn)針對脊髓灰質炎病毒中編碼衣殼蛋白或編碼病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒復制，加速清除受染細胞中的脊髓灰質炎病毒；

Jia等發(fā)現(xiàn)Rta-siRNA(Rta是皰疹病毒基因表達的一種起始轉錄因子)和ORF45-siRNA能特異阻止皰疹病毒復制。RNAi與其它病毒HuWY等證明了siRNA能阻抑98肝臟caspase-8siRNA在小鼠中可提高急性肝功能衰竭的生存率血管增生疾病VEGFsiRNA可抑制age-relatedmaculardegeneration(AMD)小鼠模型的視網膜血管增生肝臟血管增生疾病99神經系統(tǒng)疾病

常染色體神經系統(tǒng)顯性遺傳疾?。篐untington’sdisease(HD)、脊柱小腦共濟失調

神經退行性疾?。篜arkinson’sdisease2004年FDA批準了第一個RNAi治療性實驗代謝性疾病利用RNAi文庫進行全基因組掃描，篩選藥物靶標神經系統(tǒng)疾病2004年FDA批準了第一個RNAi治療性實驗代100分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件101RNA干擾技術應用于哺乳動物

細胞的研究策略在哺乳動物細胞中，長dsRNA(通常大于30bp)導入后，會啟動細胞內的病毒防御機制，細胞內干擾素產生加大，RNA依賴的蛋白激酶被激活，使翻譯起始因子elF2a磷酸化，致使細胞內全部蛋白合成的關閉；同時RNA酶L(RNaseL)被激活，產生非特異性mRNA的降解，最終誘導細胞凋亡。上述因素在一段時間內限制了RNAi在哺乳動物細胞中的應用。2001年Elbashir等首次采用體外合成的21ntsiRNA導入到人胚腎細胞和人宮頸癌細胞(HeLa)，觀測到RNAi現(xiàn)象的發(fā)生。此后RNAi技術在哺乳動物細胞中的探索與應用逐漸成為研究熱點。RNA干擾技術應用于哺乳動物

細胞的研究策略在哺乳102RNA干擾技術應用于哺乳動物細胞的研究策略在哺乳動物細胞中開展RNAi實驗大致包括以下5個步驟：

選取目的基因；設計相應的siRNA序列；制備siRNA；siRNA轉染哺乳動物細胞；RNAi效果分析。RNA干擾技術應用于哺乳動物細胞的研究策略在哺乳動物細胞中開103siRNA設計的原則

siRNA雙鏈設計時，一般在靶mRNA起始密碼下游100～200bp至翻譯終止密碼上游50～100bp的范圍內搜尋AA序列，并記錄每個AA3端相鄰19個核苷酸作為候選siRNA靶位點。siRNA設計的原則

siRNA雙鏈設計時，一般在靶mRNA104建議設計的siRNA不要針對mRNA的5和3端非編碼區(qū)(untranslatedregions，UTRs)，因為這些區(qū)域有豐富的調控蛋白結合位點，而UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP(siRNAproteincomplex，核酸內切酶復合物)結合mRNA，從而影響siRNA干擾的效果。最后還應將候選siRNA序列在GenBank進行BLAST檢索，與非同源基因具有3個或3個以上堿基相異的序列方可選用。建議設計的siRNA不要針對mRNA的5和3端105siRNA制備方法化學合成體外轉錄法合成siRNAsiRNA表達載體siRNA表達框架siRNA制備方法化學合成106化學合成早期RNAi實驗中，dsRNA或siRNA均由化學法所合成?；瘜W合成的siRNA純度高，合成量不受限制，且還可對siRNA進行標記，方便對其跟蹤但該方法價格昂貴，不適用于siRNA序列的篩選和長期基因沉默實驗?；瘜W合成早期RNAi實驗中，dsRNA或siRNA107

體外轉錄法合成siRNA較為經濟。根據siRNA序列合成相應DNAOIigo模板，再利用T7RNA聚合酶進行體外轉錄，分別獲得siRNA的正義鏈和反義鏈，然后將其退火、純化即可得到能直接導入細胞的siRNA。體外轉錄法最大缺點是siRNA合成量受限制，不過其價格較低，毒性小，穩(wěn)定性好，效率高。體外轉錄法合成siRNA

體外轉錄法合成siRNA較為經濟。體外轉錄法合成108ConstructionofsiRNAbyT7RNApolymerase-mediatedinvitrotranscription.ConstructionofsiRNAbyT7RN109siRNA表達載體為體外合成siRNA，不宜進行長期基因沉默研究。借助表達質粒或病毒載體在細胞內產生siRNA，使研究者無需直接操作RNA就可達到長期抑制靶基因表達的目的，且載體上的抗性標記有助于快速篩選出陽性克隆，這將具有更為廣闊的應用前景。siRNA表達載體為體外合成siRNA，不宜進行110RNA干擾的應用前景從理論上講，既然RNA干擾可以使特定的基因“沉默”，就有可能為癌癥和艾滋病等頑疾的防治帶來革命性的變化。2003年，哈佛大學利伯曼(JudyLieberman)副教授與中山大學附屬第二醫(yī)院宋爾衛(wèi)博士等人在《自然醫(yī)學》雜志發(fā)表論文，介紹RNA干擾對小鼠急性肝炎的防護作用，被麻省理工學院教授、諾貝爾獎得主夏普(PhilipSharp)稱為“首次在整體動物疾病模型中顯示RNA干擾的治療作用”。RNA干擾的應用前景從理論上講，既然RNA111在實驗中，未接受RNA干擾治療的實驗鼠40％在3天內死亡。40只接受過治療的實驗鼠有33只活了下來，10天后研究人員檢查實驗鼠的肝部，發(fā)現(xiàn)完全正常。加州大學洛衫磯分校和加州理工學院的研究人員已經開發(fā)出使用RNA阻止艾滋病病毒技術進入人體細胞的技術。在實驗中，未接受RNA干擾治療的實驗鼠40％在112科學家們已經應用RNA干擾技術，在多種不同的動物疾病模型中獲得了良好療效。此外，“6種基于該技術的藥物已經在美國進入II期臨床試驗，這個速度相當快”。據徐思群介紹，如今這項技術不但在科學研究領域得到廣泛應用，可以說“全世界的生物研究所，凡是與基因有關的都在使用這項技術”，而且在制藥業(yè)和農業(yè)等領域也很受關注，“已經有至少50家生化公司和制藥企業(yè)購買了我們這項專利，去研制相關的產品”?？茖W家們已經應用RNA干擾技術，在多種不同的113技術障礙首先，科學家還沒有找到一種方便快捷的方法，使RNA干擾能在患者體內的有效部位進行，怎么將RNA干擾藥物運送到特定的細胞群體，比如腫瘤細胞，就是一大障礙。比如說，在治療黃斑變性時，科學家可以直接對患者眼部進行治療，而對于其他一些疾病就沒有這么簡單。其次，科學家還無法確定這種療法是否會影響目標基因以外的其他基因，引發(fā)副作用。技術障礙首先，科學家還沒有找到一種方便快捷的方114影響siRNA抑制效率的因素靶mRNA的二級結構：識別序列在靶mRNA的位置，是否可以接近（contradictory）與反義核酸的識別序列并不相同siRNA的修飾siRNA的GC含量影響siRNA抑制效率的因素靶mRNA的二級結構：與反義核酸115NucleicAcid-BasedImmuneSystem哺乳動物抗病毒反應病毒引發(fā)RNAiNucleicAcid-BasedImmuneSyst116在一些病毒中發(fā)現(xiàn)有RNAi的抑制物在Beetyellowsvirus中發(fā)現(xiàn)有p21-likeproteins在RNAi識別的靶序列里面或附近出現(xiàn)核苷酸替換或缺失病毒逃避RNAiHIV－1可以通過改變其基因組RNA的結構而逃避RNAi有些病毒可能是逃避而非抑制RNAi，如特殊的復制、病毒基因組的高突變率、對RNAi的抗性在一些病毒中發(fā)現(xiàn)有RNAi的抑制物在Beetyellows117轉錄水平基因沉寂(transcriptionalgenesilence,TGS)siRNA參與DNA和組蛋白的甲基化，參與異染色質的形成和轉錄水平基因表達的抑制，也被認為是一種保護機制能阻止轉位元件的移動RNAi功能缺失的線蟲表現(xiàn)出很高頻率的轉位作用轉錄水平基因沉寂siRNA參與DNA和組蛋白的甲118siRNA的設計有效的比例比較高，平均可達到70-80%尚無有效的原則可循一些應考慮的問題：轉錄終止序列問題GC含量siRNA的設計有效的比例比較高，平均可達到70-80%尚無119問題siRNA表達載體引起interferonresponsesiRNA序列引起interferonresponseoff-target(脫靶效應)microRNA樣作用非特異性IFN反應非完全匹配靶基因問題siRNA表達載體引起interferonresp120分子生物學第十章-RNA干擾及其它小RNA的作用-課件121siRNA用于臨床治療仍亟待解決的問題siRNA用于臨床治療仍亟待解決的問題122siRNA導入體內的方法靜脈快速注射siRNA（已開始對肢端缺血、外周動脈閉鎖等疾病進入臨床實驗）肌肉注射siRNA病毒介導的轉染：腺病毒、逆轉錄病毒MPG,derivedfromthefusionpeptidedomainofHIV-1gp41proteinandtheNLSofSV40largeTantigen.MPGformsstablenon-covalentcomplexeswithnucleicacidsandimprovestheirdelivery.肽介導PAMAMG5dendrimer(P)wasonjugatedtoTatpeptide(T),acellpenetratingeptide,insearchofanefficientcellulardeliveryvehicleforantisenseandsiRNAoligonucleotides.siRNA導入體內的方法靜脈快速注射siRNA病毒介導的轉染123陽離子型脂質體＋靜脈或腹膜內注射局部（大鼠視網膜、皮膚）電轉化微注射借助抗體導向的脂質體，可穿透血腦屏障siRNA＋不完全膠原質，注射腫瘤陽離子型脂質體＋靜脈或腹膜內注射局部（大鼠視網膜、皮膚）電轉124提高siRNA穩(wěn)定性盡量建少非特異性作用及脫靶效應提高siRNA穩(wěn)定性盡量建少非特異性作用及脫靶效應125問題與展望

RNAi是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種古老的、保守的生物途徑，是生物體適應外界環(huán)境、調控基因表達、防止外來遺傳因子入侵的重要機制，具有重大的生物學意義。RNAi現(xiàn)已成為國內外研究的熱點，被《Science》評為2002年最重大科技突破。隨著對RNAi機制研究的深入和RNAi技術的不斷完善，RNAi有望成為治療病毒感染性疾病的新方法。問題與展望

RNAi是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種古老126存在的問題目前siRNA導入胞內的效率低下，如何有效將siRNA轉移入體內成為RNAi應用的最大障礙；

如何在目的基因序列上選擇21-23nt左右的序列作為siRNA的模板，從目前的研究來看，序列的選擇原則尚不清楚；

目前RNAi機制尚未完全闡明，尤其在哺乳動物細胞中的研究報道不多。存在的問題目前siRNA導入胞內的效率低下，如何有127

美國哈佛醫(yī)學院的PritiKumar和同事近日開發(fā)出了一種利用抗體將短鏈RNA（siRNAs）直接送至免疫細胞的方法，并通過RNA干擾極大地幫助抑制HIV病毒對小鼠的感染。相關論文8月7日(2008)在線發(fā)表于《細胞》（Cell）雜志上。

美國哈佛醫(yī)學院的PritiKumar和同事近128

研究中利用抗體綁定T細胞表面的CD7蛋白，而T細胞正是HIV感染的主要細胞類型之一。研究人員將siRNAs附著在抗體上，之后被“專一”地送至T細胞。研究人員使用了三種不同的siRNAs。其中一種阻礙HIV借以進入T細胞的表面受體蛋白產生；另外兩種標靶HIV基因，如果HIV設法進入了T細胞，它們會阻止它的復制。研究中利用抗體綁定T細胞表面的CD7蛋白，而T細129

Kumar說：“預防和治療方案都證明是成功的。很明顯，siRNAs阻礙HIV進入大部分T細胞，而一旦HIV設法溜進去了，它們也會阻止它的復制?！边@種多重攻擊也能夠降低HIV對治療產生抗性的風險。美國希望之城貝克曼研究所的JohnRossi說：“這種策略可能被開發(fā)成對人類的臨床應用。”美國科羅拉多州立大學的RameshAkkina認為：“這種方法可能有助降低對標準高效抗逆轉錄病毒療法（HAART）無反應的病人病毒量?！辈贿^他表示，如果抗體-siRNA聯(lián)合體引發(fā)了免疫系統(tǒng)的意外反應，這一療法就可能變得無效。Kumar說：“預防和治療方案都證明是成功的。130如何看待RNA??

美國《科學》雜志連續(xù)三年（2001-2003）將有關RNA的研究成果列為年度十大科學成就之一。2002年《自然》發(fā)表有關對RNA化學和生物學上的許多方面研究進展做了評述。

RNA研究始于19世紀末，是在DNA研究基礎上發(fā)展起來的。

如何看待RNA??美國《科學》雜志連續(xù)三年（20131大致分為三個階段：