方法驗證-課件

分析方法驗證季向飛分析方法驗證1涉及以下問題：哪些檢驗項目需要方法驗證？方法驗證內容有哪些？如何進行驗證？什么時候需要方法確認？什么時候需要再驗證？驗證文件怎樣保存？涉及以下問題：哪些檢驗項目需要方法驗證？2

2010版GMP正文：第十二條質量控制的基本要求：（四）檢驗方法應經(jīng)過驗證或確認；第二百二十三條檢驗應有物料和不同生產階段產品的書面檢驗操作規(guī)程，闡述所用方法、儀器和設備。檢驗結果應有記錄。1.企業(yè)應確保藥品按照注冊批準的方法進行全項檢驗。2.符合下列情形之一的，應對檢驗方法進行驗證：(1)采用新的檢驗方法；(2)檢驗方法需變更的；(3)采用《中華人民共和國藥典》及其它法定標準未收載的檢驗方法；(4)法規(guī)規(guī)定的其它需要驗證的檢驗方法。3.對不需要進行驗證的檢驗方法，企業(yè)應對檢驗方法進行確認，以確保檢驗數(shù)據(jù)準確、可靠。2010版GMP正文：3

下表中列出了國內外針對分析方法驗證的相關指南：機構或組織文件名稱美國藥典(USP)<1225>VALIDATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法驗證<1226>VERIFICATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法確認人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）ValidationOfAnalyticalProcedures:TextAndMethodologyQ2(R1)分析方法驗證：文本以及方法Q2(R1)中國藥典(Ch.P2010)附錄XIXA藥品質量標準分析方法驗證指導原則下表中列出了國內外針對分析方法驗證的相關指南：4

11.1分析方法分析方法是為完成檢驗項目而設定和建立的測試方法，它詳細描述了完成分析檢驗的每一步驟。一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數(shù)、試劑、供試品溶液與對照品溶液的制備，測定，計算公式及檢測限度等。分析方法可采用化學分析方法和儀器分析方法。這些分析方法各有特點，同一分析方法可用于不同的檢驗項目，但驗證內容會有不同。例如采用高效液相色譜法用于藥品的鑒別和雜質定量檢驗應進行不同要求的方法驗證。前者重點要求驗證專屬性，而后者則需要重點驗證專屬性、準確度和定量限。11.1分析方法5

方法驗證在建立藥品質量標準時，分析方法需經(jīng)驗證。定義：方法驗證就是根據(jù)檢驗項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的實驗來驗證所采用的分析方法是否符合檢驗項目的要求。目的：證明采用的分析方法科學、合理，符合檢驗要求并能有效控制藥品的內在質量。作用：方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用。只有經(jīng)過驗證的分析方法才可以可靠有效地用于控制藥品質量，因此方法驗證是制訂質量標準的基礎。方法驗證6

11.3方法確認在應用已驗證的藥典方法和其他法定方法前，應在當前的實驗室條件下進行方法確認來證明方法在該實驗室的適用性。11.3方法確認7

11.4適用范圍適用于：化學藥品的物料，中間產品，中間過程控制和產品的理化分析方法的驗證和確認.清潔驗證方法的驗證不適用于：化學藥品的微生物方法（微生物方法的驗證參見第17章）生物制品分析方法驗證11.4適用范圍8

11.5方法驗證的一般原則通常情況下，分析方法需進行方法驗證。外觀、崩解時限、密度、重量、pH值、硫酸鹽、灰分、裝量不需進行方法驗證。方法驗證的內容應根據(jù)檢驗項目的要求，結合所采用分析方法的特點確定。同一分析方法用于不同的檢驗項目會有不同的驗證要求。11.5方法驗證的一般原則9

11.6需要驗證的檢驗項目檢驗項目是為控制藥品質量，保證藥品安全有效而設定的測試項目。根據(jù)檢驗項目的設定目的和驗證內容的不同要求，本指導原則將需驗證的檢驗項目分為四類：鑒別試驗雜質的限度檢查雜質的定量測定含量測定，包括原料藥或制劑中有效成分的含量，制劑中其他成分（如防腐劑等）的含量，溶出度與釋放度等檢查中的溶出量、和含量均勻度。除此之外還有一些物理項目的檢測如粒徑分布、旋光度、熔點和硬度，其要求與其它檢驗項目有所不同，通常在進行分析方法驗證應有不同的要求。鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質。用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性和耐用性。11.6需要驗證的檢驗項目10

雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如無機雜質，有機雜質等。雜質檢查分為限度檢查和定量測定兩部分。用于限度檢查的分析方法驗證側重專屬性、檢測限和耐用性。用于定量測定的分析方法驗證強調專屬性、準確度、精密度、線性、范圍、定量限和耐用性。含量測定對準確度要求較高，因此所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性等要求。中國藥典2010版中規(guī)定了不同的檢驗項目需要驗證不同的內容，詳見表1。雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如無機雜質，有機雜質11

11.7方法驗證內容本章節(jié)內容除特殊標注外，主要依據(jù)中國藥典2010附錄XIXA藥品質量標準分析方法驗證指導原則。11.7.1準確度準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度。一般用回收率表示。準確度應在規(guī)定的范圍內測試。A.驗證方法準確度應在規(guī)定的范圍內建立，至少用9個測定結果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。應報告已知加入量的回收率（％）或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。準確度是定量測定的必要條件，因此含量測定、雜質定量測定均需驗證準確度。原料藥與制劑所用的具體方法詳見下表。11.7方法驗證內容12

例如：測定含量的準確度,按標示量的80%,100%和120%配制三個濃度的溶液，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。根據(jù)測定結果與配制濃度計算出平均回收率以及相對標準偏差。B.數(shù)據(jù)要求需報告已知加入量的回收率（％），或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。例如：測定含量的準確度,按標示量的80%,100%13

11.7.2精密度精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。精密度與準確度不同，下圖形象地描繪了精密度和準確度之間的差別（A=準確度，P=精密度）。精密度測定了一系列重復性的被分析物之間的接近程度，但它不能表達與已建立的真值之間的符合程度，后者由準確度來測定。通過一系列的測定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定與真實值（請看圖中左下角的較低的打靶環(huán)數(shù)）相符，在這種狀況下，需要修改方法以消除偏差。11.7.2精密度14

精密度可從重復性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察。詳見下表重復性定義:在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性。驗證方法:在規(guī)定范圍內，至少用9次測定結果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定3次，或將相當于100％的濃度水平的供試品溶液，用至少測定6次的結果進行評價。精密度可從重復性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察。詳見下表15

中間精密度定義:在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度。驗證方法:為考察隨機變動因素對精密度的影響，應設計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備。中間精密度16

重現(xiàn)性定義:在不同實驗室之間由不同分析人員測定結果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。驗證方法:法定標準采用的分析方法或在不同實驗室之間進行方法轉移時應進行重現(xiàn)性試驗。例如建立藥典分析方法時，通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結果。協(xié)同檢驗的目的、過程和重現(xiàn)性結果均應記載在起草說明中，應注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結果。重現(xiàn)性17

B.數(shù)據(jù)要求均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限。11.7.3專屬性專屬性系指在其他成分(如：雜質、降解產物、輔料等)可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。通常,鑒別反應、雜質檢查、含量測定均應考察其專屬性。如一種方法不夠專屬，可由其它分析方法予以補充。例如檢測具有旋光特性的活性物質,除采用非手性薄層色譜法或高效液相色譜法外,還應增加旋光度的檢查。B.數(shù)據(jù)要求18

專屬性方法驗證鑒別試驗驗證方法:專屬性要求證明其能與可能共存的物質或結構相似化合物區(qū)分。含被測成分的供試品呈正反應，而不含被測成分的供試品以及結構相似或組分中的有關化合物，應均呈負反應。專屬性方法驗證19雜質測定（包括限度檢查和定量測定)驗證方法方法1：在雜質可獲得的情況下，可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質與共存物質能得到分離和檢出，并具有適當?shù)臏蚀_度與精密度。方法2：在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質或降解產物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結果。或對試樣用強光照射，高溫，高濕，酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產物和降解途徑，并比對破壞前后檢出的雜質個數(shù)。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。雜質測定（包括限度檢查和定量測定)20

含量測定驗證方法:方法1：在雜質可獲得的情況下，可向試樣中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果。方法2：在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質或降解產物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結果?；驅υ嚇佑脧姽庹丈洌邷?，高濕，酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，用兩種方法進行含量測定，比較測定結果。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測進行峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。含量測定21

11.7.4檢測限（LOD）檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測出的最低量。藥品的雜質測定，應通過測試確定方法的檢測限。定量限（LOQ）定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。雜質和降解產物用定量測定方法研究時，應確定方法的定量限。11.7.4檢測限（LOD）22

用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1或2：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。信噪比法：一般以信噪比為10：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號23

11.7.6線性線性系指在設計的測定范圍內，檢測結果與試樣中被測物的濃度直接呈正比關系的程度。線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量測定和含量測定均需驗證線性。A.驗證方法應在設計的測定范圍內測定線性關系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進行測定，至少制備5個濃度的供試樣品。每一個濃度的樣品3份，以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經(jīng)數(shù)學轉換，再進行線性回歸計算。不同分析方法的線性驗證和準確度驗證需涵蓋的最低濃度范圍,見表11-8。11.7.6線性24

含量測定:至少標示量的80-120%(ICH),推薦包含50%-150%的濃度雜質的定量測定:范圍應根據(jù)初步實測，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果含量測定與雜質檢查同時進行，用百分歸一化法，則范圍應為雜質規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推薦包含LOQ－規(guī)定限度的＋20%。B.數(shù)據(jù)要求應列出回歸方程、相關系數(shù)和線性圖。含量測定:至少標示量的80-120%(ICH),25

11.7.7范圍范圍系指能夠達到一定的精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應根據(jù)分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定，要求見線性內容章節(jié)。11.7.7范圍26

11.7.8耐用性耐用性系指測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度,為使方法可用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。經(jīng)試驗，應說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。如果通過耐用性研究發(fā)現(xiàn)分析方法對某個或某些測試條件敏感或要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。11.7.8耐用性27

液相色譜法(HPLC)中的典型影響耐用性的變動因素:1.流動相的組成2.流動相的pH值3.不同品牌或不同批號的同類型色譜柱4.柱溫5.流速6．其他氣相色譜法(GC)中的典型影響耐用性的變動因素1.不同品牌或不同批號的同類型色譜柱2.固定相3.不同類型的載體4.柱溫5.進樣口和檢測器溫度6．其他液相色譜法(HPLC)中的典型影響耐用性的變動因素:28

溶液的穩(wěn)定性研究溶液的穩(wěn)定性研究用來證明根據(jù)相應方法制備的樣品溶液和標準品溶液在規(guī)定的儲存條件下在一定時間內保持穩(wěn)定。如果方法中沒有規(guī)定有效期，樣品溶液和標準品溶液需進行穩(wěn)定性研究。樣品溶液和標準品溶液依據(jù)方法進行配制和分析。在室溫或其他條件下（如冰箱2-8°C）條件下儲存適當?shù)臅r間。每個間隔點，用新鮮配制的標準品溶液做對照，測定儲存的樣品溶液和標準品溶液。測定結果與初始結果進行比較，符合接受標準便可確認樣品溶液和標準品溶液在規(guī)定的儲存條件下在規(guī)定儲存時間是穩(wěn)定的。溶液的穩(wěn)定性研究29

分析方法驗證接收標準下表為某制藥公司分析方法驗證的接受標準，僅供參考。分析方法驗證接收標準30

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11.8方法確認適用于藥典方法和其他已驗證的法定標準。因為藥典方法和其他法定標準被認為是驗證過的分析方法，不需要驗證，但需要通過方法確認來證明方法在該實驗室條件下的適應性。不適用于：實驗室日常測試操作步驟不需要進行方法確認，例如（包括但不限于）干燥失重，熾灼殘渣，各種濕法化學步驟如酸值和簡單的儀器方法如PH計，除非有特殊要求。11.8方法確認32

11.9方法再驗證在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行部分或完整的再驗證，以保證分析方法可靠。當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質，雜質檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質檢查方法能夠檢測新引入的雜質，且新引入的雜質對主成份的含量測定應無干擾。當制劑的處方組成改變、輔料變更時，可能會影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，因此需要對鑒別、含量測定方法再驗證。當原料藥產地來源發(fā)生變更時，可能會影響雜質檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此需要對雜質檢查方法和含量測定方法進行再驗證。11.9方法再驗證33

當質量標準中某一項目分析方法發(fā)生部分改變時，如采用高效液相色譜法測定含量時，檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內容的驗證，證明修訂后分析方法的合理性、可行性。再驗證原則：根據(jù)改變的程度進行相應的再驗證。當這種改變到達一定程度時，則需要完整的驗證。如分析方法完全改變時，則應視為新方法并需要完整的驗證。方法再驗證是對分析方法的完善過程，應根據(jù)實際改變情況進行再驗證，從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內在質量。當質量標準中某一項目分析方法發(fā)生部分改變時，如采用高效液相34

11.10文件管理必須制訂方法驗證和確認的標準操作規(guī)程。在開始驗證分析方法之前，必須依據(jù)操作規(guī)程起草一個驗證方案。對于方案存在的需求，有兩個重要的原因：其一是要被執(zhí)行的程序在方案中能夠詳細地描述，其二是每個被測參數(shù)的接受標準能被具體地規(guī)定。進行方法驗證或確認前，應確認如下條件已符合從事分析方法驗證或確認的分析師是合格的分析師。所用分析儀器已通過驗證和校驗。實驗必須依據(jù)批準的方案進行。實驗過程中任何失敗的測試，過程中的偏差或異常均需復核和評估并查出原因。過程中的偏差或異常需通過正式的體系（如調查報告，驗證或確認報告中偏差的鑒定和批準）進行記錄和批準.驗證的結果應以報告的方式給出，它包括了某一產品所有方法的驗證，這與方法描述的要求一致。作為一種可供選擇的方法，可以將測試規(guī)程與分析方法驗證部分附在一起，這樣做的優(yōu)點是相關的文件總是和分析方法在一起。11.10文件管理35

1）分析方法驗證或確認的方案對于分析方法的驗證或確認，應制訂方案并由相關人員批準后方可進行。驗證或確認方案通常含有以下信息唯一的方案號.分析方法的版本號以及物料/產品的名稱:驗證或確認的實驗項目驗證或確認的原則和目的驗證或確認的參數(shù)以及接受標準驗證或確認實驗中所用標準品，檢驗樣品信息分析儀器的相關信息所用儀器的信息，如已確認的情況下方案起草者，復核人和批準者需簽字確認1）分析方法驗證或確認的方案36

（2）方法驗證或確認的執(zhí)行進行方法驗證或確認前，應確認如下條件已符合從事分析方法驗證或確認的分析師是合格的分析師。所用分析儀器已通過驗證和校驗。實驗必須依據(jù)批準的方案進行。實驗過程中任何失敗的測試，過程中的偏差或異常均需復核和評估并查出原因。過程中的偏差或異常需通過正式的體系（如調查報告，驗證或確認報告中偏差的鑒定和批準）進行記錄和批準.（3）報告的起草與批準分析方法驗證或確認結束后，需起草報告相關人員批準。報告中通常含有如下信息：唯一的報告號.相關方案號（2）方法驗證或確認的執(zhí)行37

分析方法的版本號以及物料/產品的名稱:驗證或確認的實驗項目驗證或確認實驗中所用標準品，檢驗樣品以及分析儀器的相關信息結果匯總，并與方案中規(guī)定的接收標準進行評估偏離方案的偏差匯總及處理結論結論，需對方法驗證或確認是否成功進行正式描述。報告起草者，復核人和批準者需簽字確認（4）分析方法驗證或確認的方案與報告的存檔方案與報告均集中存檔，并長期保存

分析方法的版本號以及物料/產品的名稱:38

謝謝謝謝39分析方法驗證季向飛分析方法驗證40涉及以下問題：哪些檢驗項目需要方法驗證？方法驗證內容有哪些？如何進行驗證？什么時候需要方法確認？什么時候需要再驗證？驗證文件怎樣保存？涉及以下問題：哪些檢驗項目需要方法驗證？41

2010版GMP正文：第十二條質量控制的基本要求：（四）檢驗方法應經(jīng)過驗證或確認；第二百二十三條檢驗應有物料和不同生產階段產品的書面檢驗操作規(guī)程，闡述所用方法、儀器和設備。檢驗結果應有記錄。1.企業(yè)應確保藥品按照注冊批準的方法進行全項檢驗。2.符合下列情形之一的，應對檢驗方法進行驗證：(1)采用新的檢驗方法；(2)檢驗方法需變更的；(3)采用《中華人民共和國藥典》及其它法定標準未收載的檢驗方法；(4)法規(guī)規(guī)定的其它需要驗證的檢驗方法。3.對不需要進行驗證的檢驗方法，企業(yè)應對檢驗方法進行確認，以確保檢驗數(shù)據(jù)準確、可靠。2010版GMP正文：42

下表中列出了國內外針對分析方法驗證的相關指南：機構或組織文件名稱美國藥典(USP)<1225>VALIDATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法驗證<1226>VERIFICATIONOFCOMPENDIALPROCEDURES方法確認人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）ValidationOfAnalyticalProcedures:TextAndMethodologyQ2(R1)分析方法驗證：文本以及方法Q2(R1)中國藥典(Ch.P2010)附錄XIXA藥品質量標準分析方法驗證指導原則下表中列出了國內外針對分析方法驗證的相關指南：43

11.1分析方法分析方法是為完成檢驗項目而設定和建立的測試方法，它詳細描述了完成分析檢驗的每一步驟。一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數(shù)、試劑、供試品溶液與對照品溶液的制備，測定，計算公式及檢測限度等。分析方法可采用化學分析方法和儀器分析方法。這些分析方法各有特點，同一分析方法可用于不同的檢驗項目，但驗證內容會有不同。例如采用高效液相色譜法用于藥品的鑒別和雜質定量檢驗應進行不同要求的方法驗證。前者重點要求驗證專屬性，而后者則需要重點驗證專屬性、準確度和定量限。11.1分析方法44

方法驗證在建立藥品質量標準時，分析方法需經(jīng)驗證。定義：方法驗證就是根據(jù)檢驗項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的實驗來驗證所采用的分析方法是否符合檢驗項目的要求。目的：證明采用的分析方法科學、合理，符合檢驗要求并能有效控制藥品的內在質量。作用：方法驗證在分析方法建立過程中具有重要的作用。只有經(jīng)過驗證的分析方法才可以可靠有效地用于控制藥品質量，因此方法驗證是制訂質量標準的基礎。方法驗證45

11.3方法確認在應用已驗證的藥典方法和其他法定方法前，應在當前的實驗室條件下進行方法確認來證明方法在該實驗室的適用性。11.3方法確認46

11.4適用范圍適用于：化學藥品的物料，中間產品，中間過程控制和產品的理化分析方法的驗證和確認.清潔驗證方法的驗證不適用于：化學藥品的微生物方法（微生物方法的驗證參見第17章）生物制品分析方法驗證11.4適用范圍47

11.5方法驗證的一般原則通常情況下，分析方法需進行方法驗證。外觀、崩解時限、密度、重量、pH值、硫酸鹽、灰分、裝量不需進行方法驗證。方法驗證的內容應根據(jù)檢驗項目的要求，結合所采用分析方法的特點確定。同一分析方法用于不同的檢驗項目會有不同的驗證要求。11.5方法驗證的一般原則48

11.6需要驗證的檢驗項目檢驗項目是為控制藥品質量，保證藥品安全有效而設定的測試項目。根據(jù)檢驗項目的設定目的和驗證內容的不同要求，本指導原則將需驗證的檢驗項目分為四類：鑒別試驗雜質的限度檢查雜質的定量測定含量測定，包括原料藥或制劑中有效成分的含量，制劑中其他成分（如防腐劑等）的含量，溶出度與釋放度等檢查中的溶出量、和含量均勻度。除此之外還有一些物理項目的檢測如粒徑分布、旋光度、熔點和硬度，其要求與其它檢驗項目有所不同，通常在進行分析方法驗證應有不同的要求。鑒別的目的在于判定被分析物是目標化合物，而非其它物質。用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性和耐用性。11.6需要驗證的檢驗項目49

雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如無機雜質，有機雜質等。雜質檢查分為限度檢查和定量測定兩部分。用于限度檢查的分析方法驗證側重專屬性、檢測限和耐用性。用于定量測定的分析方法驗證強調專屬性、準確度、精密度、線性、范圍、定量限和耐用性。含量測定對準確度要求較高，因此所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性等要求。中國藥典2010版中規(guī)定了不同的檢驗項目需要驗證不同的內容，詳見表1。雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質，如無機雜質，有機雜質50

11.7方法驗證內容本章節(jié)內容除特殊標注外，主要依據(jù)中國藥典2010附錄XIXA藥品質量標準分析方法驗證指導原則。11.7.1準確度準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度。一般用回收率表示。準確度應在規(guī)定的范圍內測試。A.驗證方法準確度應在規(guī)定的范圍內建立，至少用9個測定結果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。應報告已知加入量的回收率（％）或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。準確度是定量測定的必要條件，因此含量測定、雜質定量測定均需驗證準確度。原料藥與制劑所用的具體方法詳見下表。11.7方法驗證內容51

例如：測定含量的準確度,按標示量的80%,100%和120%配制三個濃度的溶液，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定。根據(jù)測定結果與配制濃度計算出平均回收率以及相對標準偏差。B.數(shù)據(jù)要求需報告已知加入量的回收率（％），或測定結果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。例如：測定含量的準確度,按標示量的80%,100%52

11.7.2精密度精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。精密度與準確度不同，下圖形象地描繪了精密度和準確度之間的差別（A=準確度，P=精密度）。精密度測定了一系列重復性的被分析物之間的接近程度，但它不能表達與已建立的真值之間的符合程度，后者由準確度來測定。通過一系列的測定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定與真實值（請看圖中左下角的較低的打靶環(huán)數(shù)）相符，在這種狀況下，需要修改方法以消除偏差。11.7.2精密度53

精密度可從重復性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察。詳見下表重復性定義:在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性。驗證方法:在規(guī)定范圍內，至少用9次測定結果進行評價。例如，設計3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試品溶液，進行測定3次，或將相當于100％的濃度水平的供試品溶液，用至少測定6次的結果進行評價。精密度可從重復性、中間精密度、重現(xiàn)性三個層次考察。詳見下表54

中間精密度定義:在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度。驗證方法:為考察隨機變動因素對精密度的影響，應設計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設備。中間精密度55

重現(xiàn)性定義:在不同實驗室之間由不同分析人員測定結果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。驗證方法:法定標準采用的分析方法或在不同實驗室之間進行方法轉移時應進行重現(xiàn)性試驗。例如建立藥典分析方法時，通過協(xié)同檢驗得出重現(xiàn)性結果。協(xié)同檢驗的目的、過程和重現(xiàn)性結果均應記載在起草說明中，應注意重現(xiàn)性試驗用的樣品本身的質量均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結果。重現(xiàn)性56

B.數(shù)據(jù)要求均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限。11.7.3專屬性專屬性系指在其他成分(如：雜質、降解產物、輔料等)可能存在下，采用的方法能正確測定出被測物的特性。通常,鑒別反應、雜質檢查、含量測定均應考察其專屬性。如一種方法不夠專屬，可由其它分析方法予以補充。例如檢測具有旋光特性的活性物質,除采用非手性薄層色譜法或高效液相色譜法外,還應增加旋光度的檢查。B.數(shù)據(jù)要求57

專屬性方法驗證鑒別試驗驗證方法:專屬性要求證明其能與可能共存的物質或結構相似化合物區(qū)分。含被測成分的供試品呈正反應，而不含被測成分的供試品以及結構相似或組分中的有關化合物，應均呈負反應。專屬性方法驗證58雜質測定（包括限度檢查和定量測定)驗證方法方法1：在雜質可獲得的情況下，可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質與共存物質能得到分離和檢出，并具有適當?shù)臏蚀_度與精密度。方法2：在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質或降解產物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結果。或對試樣用強光照射，高溫，高濕，酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產物和降解途徑，并比對破壞前后檢出的雜質個數(shù)。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測，進行峰純度檢查。雜質測定（包括限度檢查和定量測定)59

含量測定驗證方法:方法1：在雜質可獲得的情況下，可向試樣中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質和輔料的試樣比較測定結果。方法2：在雜質或降解產物不能獲得的情況下，專屬性可通過測定含有雜質或降解產物的試樣，與另一個已驗證的方法或藥典方法比較結果。或對試樣用強光照射，高溫，高濕，酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，用兩種方法進行含量測定，比較測定結果。必要時可采用二極管陣列檢測和質譜檢測進行峰純度檢查，證明含量測定成分的色譜峰中不包含其他成分。含量測定60

11.7.4檢測限（LOD）檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測出的最低量。藥品的雜質測定，應通過測試確定方法的檢測限。定量限（LOQ）定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。雜質和降解產物用定量測定方法研究時，應確定方法的定量限。11.7.4檢測限（LOD）61

用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3：1或2：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。信噪比法：一般以信噪比為10：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限用于能顯示基線噪音的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號62

11.7.6線性線性系指在設計的測定范圍內，檢測結果與試樣中被測物的濃度直接呈正比關系的程度。線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量測定和含量測定均需驗證線性。A.驗證方法應在設計的測定范圍內測定線性關系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列供試樣品的方法進行測定，至少制備5個濃度的供試樣品。每一個濃度的樣品3份，以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經(jīng)數(shù)學轉換，再進行線性回歸計算。不同分析方法的線性驗證和準確度驗證需涵蓋的最低濃度范圍,見表11-8。11.7.6線性63

含量測定:至少標示量的80-120%(ICH),推薦包含50%-150%的濃度雜質的定量測定:范圍應根據(jù)初步實測，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果含量測定與雜質檢查同時進行，用百分歸一化法，則范圍應為雜質規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推薦包含LOQ－規(guī)定限度的＋20%。B.數(shù)據(jù)要求應列出回歸方程、相關系數(shù)和線性圖。含量測定:至少標示量的80-120%(ICH),64

11.7.7范圍范圍系指能夠達到一定的精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應根據(jù)分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定，要求見線性內容章節(jié)。11.7.7范圍65

11.7.8耐用性耐用性系指測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度,為使方法可用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。經(jīng)試驗，應說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。如果通過耐用性研究發(fā)現(xiàn)分析方法對某個或某些測試條件敏感或要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。11.7.8耐用性66

液相色譜法(HPLC)中的典型影響耐用性的變動因素:1.流動相的組成2.流動相的pH值3.不同品牌或不同批號的同類型色譜柱4.柱溫5.流速6．其他氣相色譜法(GC)中的典型影響耐用性的變動因素1.不同品牌或不同批號的同類型色譜柱2.固定相3.不同類型的載體4.柱溫5.進樣口和檢測器溫度6．其他液相色譜法(HPLC)中的典型影響耐用性的變動因素:67

溶液的穩(wěn)定性研究溶液的穩(wěn)定性研究用來證明根據(jù)相應方法制備的樣品溶液和標準品溶液在規(guī)定的儲存條件下在一定時間內保持穩(wěn)定。如果方法中沒有規(guī)定有效期，樣品溶液和標準品溶液需進行穩(wěn)定性研究。樣品溶液和標準品溶液依據(jù)方法進行配制和分析。在室溫或其他條件下（如冰箱2-8°C）條件下儲存適當?shù)臅r間。每個間隔點，用新鮮配制的標準品溶液做對照，測定儲存的樣品溶液和標準品溶液。測定結果與初始結果進行比較，符合接受標準便可確認樣品溶液和標準品溶液在規(guī)定的儲存條件下在規(guī)定儲存時間是穩(wěn)定的。溶液的穩(wěn)定性研究68

分析方法驗證接收標準下表為某制藥公司分析方法驗證的接受標準，僅供參考。分析方法驗證接收標準69

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11.8方法確認適用于藥典方法和其他已驗證的法定標準。因為藥典方法和其他法定標準被認為是驗證過的分析方法，不需要驗證，但需要通過方法確認來證明方法在該實驗室條件下的適應性。不適用于：實驗室日常測試操作步驟不需要進行方法確認，例如（包括但不限于）干燥失重，熾灼殘渣，各種濕法化學步驟如酸值和簡單的儀器方法如PH計，除非有特殊要求。11.8方法確認71

11.9方法再驗證在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行部分或完整的再驗證，以保證分析方法可靠。當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質，雜質檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質檢查方法能夠檢測新引入的雜質，且新引入的雜質對主成份的含量測定應無干擾。