色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件

第四節(jié)含量測定生物堿類藥物由于品種多，結構多變，性質各異，可利用的含量測定方法也較多。原料藥物的含量測定，主要是利用整個分子的堿性，根據其堿性強弱以及存在形式的溶解行為，多采用非水溶液滴定法；制劑的含量測定方法主要有紫外分光光度法(包括酸性染料比色法)、色譜法、提取酸堿滴定法、熒光分光光度法等。ChP2015中收載的常見生物堿及其制劑的含量測定方法見表12-2。第四節(jié)含量測定生物堿類藥物由于品種多，結構色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件含量測定

(Assay)

非水溶液滴定法

非水溶液滴定法是在非水溶劑中進行的酸堿滴定測定法。主要用來測定有機堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽以及有機酸堿金屬鹽類藥物的含量。也用于測定某些有機弱酸的含量。含量測定(Assay)非水溶液滴定法一、非水溶液滴定法(弱堿性)溶劑種類（1）酸性溶劑：有機弱堿在酸性溶劑中可顯著地增強其相對堿度，最常用的酸性溶劑是冰醋酸。（2）堿性溶劑：有機弱酸在堿性溶劑中可顯著地增強其相對酸度，最常用的堿性溶劑是二甲基甲酰胺。（3）兩性溶劑：兼有酸堿兩種性能，最常用的是甲醇。（4）惰性溶劑：溶劑沒有酸堿性，如甲苯、三氯甲烷、丙酮。一、非水溶液滴定法(弱堿性)溶劑種類一、非水溶液酸堿滴定法

(一)原理與方法原理生物堿類藥物一般具有弱堿性，在水溶液中用酸滴定液進行直接滴定時沒有明顯的滴定突躍，難于掌握終點，不能順利的滴定。而在酸性非水介質(冰醋酸、醋酐)中，生物堿的堿性顯著增強，滴定突躍增大，滴定可順利進行。一、非水溶液酸堿滴定法(一)原理與方法

生物堿類藥物絕大多數都以鹽的形式供臨床使用，即供分析用的多為生物堿鹽類。其鹽的滴定，實際上是一個置換反應，即用強酸滴定液置換出與生物堿結合的較弱的酸。式中BH+·A-表示生物堿鹽類，HA表示被置換出的弱酸。由于被置換出的HA酸性強弱不同，對滴定反應的影響也不同，若置換出的HA酸性較強，則反應不能定量的完成。因此在實際滴定中，必需根據具體情況，采取相應的測定條件，設法將HA除去或減少其產生，使反應順利完成。生物堿類藥物絕大多數都以鹽的形式供臨床使用，即供方法除另有規(guī)定外，精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L)8ml]，加冰醋酸10～30ml使溶解。加各品種項下規(guī)定的指示液1～2滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。終點顏色以電位滴定時的突躍點為準，并將滴定的結果用空自試驗校正。方法除另有規(guī)定外，精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴(二)測定條件的選擇適用的范圍及溶劑的選擇

主要應用于pKb

>8的有機堿性藥物及其鹽的含量測定。條件選用適當的pKb為8~13的弱堿均可采用。對于堿性較弱的藥物pKb為8~10時，宜選用冰醋酸，pKb為10~12時，宜選用冰醋酸與醋酐混合溶劑，

pKb大于12時，就以醋酐為溶劑。(二)測定條件的選擇適用的范圍及溶劑的選擇酸根的影響在生物堿鹽的滴定中，與之成鹽的酸在冰醋酸中的酸性強弱對滴定能否順利進行有關。各種酸在冰醋酸中的酸性強弱順序為:高氯酸>氫溴酸>硫酸>鹽酸>硝酸>磷酸>有機酸由此可見，如被置換出的是氫鹵酸，其在冰醋酸中的酸性較強，對滴定終點有影響，需要進行處理。一般處理方法為在滴定反應開始前，預先在冰醋酸中加入醋酸汞的冰醋酸溶液，使氫鹵酸生成在冰醋酸中難解離的鹵化汞而排除干擾，然后再用高氯酸滴定液滴定。酸根的影響在生物堿鹽的滴定中，與之成鹽的酸在冰醋酸中的酸當醋酸汞的量加入不足時，滴定終點仍不準確，會使測定結果偏低，一般加入量以其理論量的1～3倍為宜。然而醋酸汞是劇毒的化學物質，且嚴重污染環(huán)境，近年來生物堿類藥物氫鹵酸鹽的非水溶液滴定法逐漸改用醋酐代替冰醋酸作溶劑，并以電位法指示終點，以避免使用醋酸汞。當醋酸汞的量加入不足時，滴定終點仍不準確，會使測定結果偏低終點指示方法一般指示終點的方法有電位法和指示劑法。結晶紫由堿性區(qū)域到酸性區(qū)域的顏色變化為紫、藍紫、藍綠、綠、黃。滴定液的穩(wěn)定性本法的溶劑冰醋酸具有揮發(fā)性，且膨脹系數較大，因此溫度和貯存條件等都影響滴定液的濃度。需校正注意事項①水分②高濃度的高氯酸與醋酐混合時容易引起爆炸，配制時應先將高氯酸用冰醋酸稀釋后再加入醋酐。終點指示方法一般指示終點的方法有電位法和指示劑法。結晶紫(三)應用實例(三)應用實例色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件二、紫外-可見分光光度法二、紫外-可見分光光度法基本原理UV

(二)酸性染料比色法基本原理UV(二)酸性染料比色法也可分離出有機相，然后用堿化試劑堿化有機相，將離子對中的酸性染料釋放出來，用水提取In-，測定水中染料的吸光度，間接計算出堿性藥物的含量。本法具有專屬性強、準確度好、靈敏度高、試樣用量少等優(yōu)點，適用于小劑量生物堿類藥物及其制劑以及生物體內生物堿類藥物的定量分析。《中國藥典》對硫酸阿托品、氫溴酸山莨菪堿的片劑和注射劑的含量測定均采用此法。也可分離出有機相，然后用堿化試劑堿化有機相，將離子對BECDA有機試劑的選擇水分的影響水相最佳pH值的選擇酸性染料的選擇及其濃度酸性染料中雜質的影響酸性染料比色法的影響因素測定條件與影響因素BECDA有機試劑的選擇水分的影響水相最佳pH值的選擇酸性染

水性最佳pH值：使得BH+和In-最多

酸性染料及其濃度：定量結合；對離子對的溶解性好；有較高的吸收度；足夠量即可

有機溶劑的選擇：提取效率高，氯仿最理想

水分的影響：影響結果，脫水劑或濾紙除去水分

酸性染料中的有色雜質：有機溶劑萃取除去水性最佳pH值：使得BH+和In-最多應用示例硫酸阿托品片的含量測定精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠溶液4ml，振搖提取后，靜置使分層；分取三氯甲烷液，照紫外-可見分光光度法，在420nm波長處分別測定吸光度，計算，即得。應用示例硫酸阿托品片的含量測定精密量取對照品溶液和供試品溶液測定法精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠2.0ml，振搖提取兩分鐘后，靜止分層，分取澄清的三氯甲烷液，在420nm波長處分別測定吸光度，計算，并將結果與1.027相乘，即得本品（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O相當標示量的百分含量。百分標示量式中Ax、AS分別為供試品和對照品溶液的吸光度；CS為對照品溶液的濃度mg/ml；m為樣品片粉質量；W為平均片重。1.027為（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O與（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O的質量換算系數。測定法精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精Fig.12-2TheUV-spectrumofatropinesulfatewithBTBions1.離子對2.染料空白（對照品平行測定，空白吸收可被扣除）3.阿托品（水溶液在420nm附近無吸收）Fig.12-2TheUV-spectrumofa適用范圍廣

分離模式多樣

檢測手段多樣靈敏

選擇和專屬性強

分離速度快重復性好

HPLC優(yōu)點各國藥典中采用HPLC法對莨菪類生物堿的含量和有關物質進行直接分析測定的比例不斷增加。

三、色譜法適用范圍廣分離模式多樣檢測手段多樣靈敏選擇和專屬性強硅醇基效應的消除流動相方面的改進①在流動相中加入含氮堿性競爭試劑(或稱掃尾劑、改性劑)，可抑制或掩蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使生物堿易出峰，且峰形好，最常用的硅醇基抑制劑有二乙胺、三乙胺等。②在適當的pH下使生物堿解離，再在流動相中加入電荷相反的離子對試劑，生成離子對化合物而掩蔽生物堿的堿性基團，這樣就避免與游離的硅醇基作用，使待測組分在非極性固定相中的分配與溶解度增大，從而改善其色譜保留與分離行為。③在流動相中加入季銨鹽等掩蔽試劑，如在甲醇一水的流動相中加入0.01mol/L的溴化四甲基胺，能在較短的保留時間內獲得良好的分離，色譜峰重現(xiàn)性好，也不拖尾，而且甲醇水比例的改變和pH的變化都不影響峰形的對稱性，季銨鹽與固定相表面的硅羥基生成復合物而掩蔽了固定相表面的游離硅醇基。④在流動相中加入電解質緩沖鹽，通過改變流動相的離子強度，穩(wěn)定pH及促進離子對相互作用，起到改善峰形和分離效果的作用。硅醇基效應的消除流動相方面的改進色譜保留常常較弱，從而影響到它們的含量或有關物質HPLC測定的專屬性和準確度。采用離子對高效液相色譜法，可以改善它們的色譜保留行為，并實現(xiàn)準確測定。

在反相液相色譜條件下呈離子狀態(tài)的藥物，如有機堿類、有機酸類等調整流動相的pH，抑制它們的解離，以改變色譜保留行為。但并不都能獲得滿意的結果。

色譜保留常常較弱，從而影響到它們的含量或有關物質HPLC測定固定相方面的改進①選擇碳鏈較短的鍵合相硅膠填料，例如C8比C18好，原因可能是由于硅烷的碳鏈較短則覆蓋度更大，只有較少量的游離硅醇基;②采用端基封尾技術，即在C18鍵合反應結束后，用短鏈氯硅烷(如三甲基氯硅烷)鍵合殘留的活性硅羥基。生物堿的色譜分離模式多樣，除了常采用的PR-HPLC，目前文獻報道也可見到采用正相色譜法、吸附色譜法或離子交換色譜法等各種方法。生物堿類成分進行高效液相色譜法測定時，使用較多的是紫外檢測器，其他如電化學檢測器、化學發(fā)光檢測器等也適用于生物堿類成分的測定，如果化合物能產生熒光，還可以使用熒光檢測器。固定相方面的改進色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件

(二)氣相色譜法氣相色譜法可用于某些具有揮發(fā)性、遇熱不分解的生物堿及其鹽類的分析，游離生物堿可直接進樣，生物堿鹽一般會在高溫加熱下，快速解離成游離生物堿后再進行色譜柱分析，但生物堿鹽類在高溫加熱解離后所生成的酸容易損傷色譜柱和檢測器，所以一般在測定前先用堿水堿化，再用有機溶劑提取分離，制得游離生物堿溶液后再進樣分析。(二)氣相色譜法四、提取酸堿滴定法有些生物堿類藥物由于其樣品中其他組分對測定有干擾，測定前需經過堿化、有機溶劑提取后再進行酸堿滴定，稱為提取酸堿滴定法。本法適用于堿性較強(pKb6～9)的生物堿鹽類藥物，這類成分水相即可達到明顯的滴定突躍。經堿性試劑堿化、有機溶劑提取后，可采用酸堿滴定的方法測定含量。四、提取酸堿滴定法有些生物堿類藥物由于其樣品中其他組分對測定五、熒光分析法在紫外-可見光的激發(fā)下，有些生物堿或其化學反應產物能產生熒光，利用這一性質可用熒光分析法測定其含量。熒光分析法主要適用于制劑和體內藥物分析，其具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點但同時也存在干擾因素多、線性范圍較窄等問題。如《中國藥典》利舍平片的含量測定即采用本法。五、熒光分析法在紫外-可見光的激發(fā)下，有些生物堿或其化學反應色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件第四節(jié)含量測定生物堿類藥物由于品種多，結構多變，性質各異，可利用的含量測定方法也較多。原料藥物的含量測定，主要是利用整個分子的堿性，根據其堿性強弱以及存在形式的溶解行為，多采用非水溶液滴定法；制劑的含量測定方法主要有紫外分光光度法(包括酸性染料比色法)、色譜法、提取酸堿滴定法、熒光分光光度法等。ChP2015中收載的常見生物堿及其制劑的含量測定方法見表12-2。第四節(jié)含量測定生物堿類藥物由于品種多，結構色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件含量測定

(Assay)

非水溶液滴定法

非水溶液滴定法是在非水溶劑中進行的酸堿滴定測定法。主要用來測定有機堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽以及有機酸堿金屬鹽類藥物的含量。也用于測定某些有機弱酸的含量。含量測定(Assay)非水溶液滴定法一、非水溶液滴定法(弱堿性)溶劑種類（1）酸性溶劑：有機弱堿在酸性溶劑中可顯著地增強其相對堿度，最常用的酸性溶劑是冰醋酸。（2）堿性溶劑：有機弱酸在堿性溶劑中可顯著地增強其相對酸度，最常用的堿性溶劑是二甲基甲酰胺。（3）兩性溶劑：兼有酸堿兩種性能，最常用的是甲醇。（4）惰性溶劑：溶劑沒有酸堿性，如甲苯、三氯甲烷、丙酮。一、非水溶液滴定法(弱堿性)溶劑種類一、非水溶液酸堿滴定法

(一)原理與方法原理生物堿類藥物一般具有弱堿性，在水溶液中用酸滴定液進行直接滴定時沒有明顯的滴定突躍，難于掌握終點，不能順利的滴定。而在酸性非水介質(冰醋酸、醋酐)中，生物堿的堿性顯著增強，滴定突躍增大，滴定可順利進行。一、非水溶液酸堿滴定法(一)原理與方法

生物堿類藥物絕大多數都以鹽的形式供臨床使用，即供分析用的多為生物堿鹽類。其鹽的滴定，實際上是一個置換反應，即用強酸滴定液置換出與生物堿結合的較弱的酸。式中BH+·A-表示生物堿鹽類，HA表示被置換出的弱酸。由于被置換出的HA酸性強弱不同，對滴定反應的影響也不同，若置換出的HA酸性較強，則反應不能定量的完成。因此在實際滴定中，必需根據具體情況，采取相應的測定條件，設法將HA除去或減少其產生，使反應順利完成。生物堿類藥物絕大多數都以鹽的形式供臨床使用，即供方法除另有規(guī)定外，精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L)8ml]，加冰醋酸10～30ml使溶解。加各品種項下規(guī)定的指示液1～2滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。終點顏色以電位滴定時的突躍點為準，并將滴定的結果用空自試驗校正。方法除另有規(guī)定外，精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴(二)測定條件的選擇適用的范圍及溶劑的選擇

主要應用于pKb

>8的有機堿性藥物及其鹽的含量測定。條件選用適當的pKb為8~13的弱堿均可采用。對于堿性較弱的藥物pKb為8~10時，宜選用冰醋酸，pKb為10~12時，宜選用冰醋酸與醋酐混合溶劑，

pKb大于12時，就以醋酐為溶劑。(二)測定條件的選擇適用的范圍及溶劑的選擇酸根的影響在生物堿鹽的滴定中，與之成鹽的酸在冰醋酸中的酸性強弱對滴定能否順利進行有關。各種酸在冰醋酸中的酸性強弱順序為:高氯酸>氫溴酸>硫酸>鹽酸>硝酸>磷酸>有機酸由此可見，如被置換出的是氫鹵酸，其在冰醋酸中的酸性較強，對滴定終點有影響，需要進行處理。一般處理方法為在滴定反應開始前，預先在冰醋酸中加入醋酸汞的冰醋酸溶液，使氫鹵酸生成在冰醋酸中難解離的鹵化汞而排除干擾，然后再用高氯酸滴定液滴定。酸根的影響在生物堿鹽的滴定中，與之成鹽的酸在冰醋酸中的酸當醋酸汞的量加入不足時，滴定終點仍不準確，會使測定結果偏低，一般加入量以其理論量的1～3倍為宜。然而醋酸汞是劇毒的化學物質，且嚴重污染環(huán)境，近年來生物堿類藥物氫鹵酸鹽的非水溶液滴定法逐漸改用醋酐代替冰醋酸作溶劑，并以電位法指示終點，以避免使用醋酸汞。當醋酸汞的量加入不足時，滴定終點仍不準確，會使測定結果偏低終點指示方法一般指示終點的方法有電位法和指示劑法。結晶紫由堿性區(qū)域到酸性區(qū)域的顏色變化為紫、藍紫、藍綠、綠、黃。滴定液的穩(wěn)定性本法的溶劑冰醋酸具有揮發(fā)性，且膨脹系數較大，因此溫度和貯存條件等都影響滴定液的濃度。需校正注意事項①水分②高濃度的高氯酸與醋酐混合時容易引起爆炸，配制時應先將高氯酸用冰醋酸稀釋后再加入醋酐。終點指示方法一般指示終點的方法有電位法和指示劑法。結晶紫(三)應用實例(三)應用實例色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件色譜法硅醇基效應的消除流動相方面的改進課件二、紫外-可見分光光度法二、紫外-可見分光光度法基本原理UV

(二)酸性染料比色法基本原理UV(二)酸性染料比色法也可分離出有機相，然后用堿化試劑堿化有機相，將離子對中的酸性染料釋放出來，用水提取In-，測定水中染料的吸光度，間接計算出堿性藥物的含量。本法具有專屬性強、準確度好、靈敏度高、試樣用量少等優(yōu)點，適用于小劑量生物堿類藥物及其制劑以及生物體內生物堿類藥物的定量分析?！吨袊幍洹穼α蛩岚⑼衅?、氫溴酸山莨菪堿的片劑和注射劑的含量測定均采用此法。也可分離出有機相，然后用堿化試劑堿化有機相，將離子對BECDA有機試劑的選擇水分的影響水相最佳pH值的選擇酸性染料的選擇及其濃度酸性染料中雜質的影響酸性染料比色法的影響因素測定條件與影響因素BECDA有機試劑的選擇水分的影響水相最佳pH值的選擇酸性染

水性最佳pH值：使得BH+和In-最多

酸性染料及其濃度：定量結合；對離子對的溶解性好；有較高的吸收度；足夠量即可

有機溶劑的選擇：提取效率高，氯仿最理想

水分的影響：影響結果，脫水劑或濾紙除去水分

酸性染料中的有色雜質：有機溶劑萃取除去水性最佳pH值：使得BH+和In-最多應用示例硫酸阿托品片的含量測定精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠溶液4ml，振搖提取后，靜置使分層；分取三氯甲烷液，照紫外-可見分光光度法，在420nm波長處分別測定吸光度，計算，即得。應用示例硫酸阿托品片的含量測定精密量取對照品溶液和供試品溶液測定法精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠2.0ml，振搖提取兩分鐘后，靜止分層，分取澄清的三氯甲烷液，在420nm波長處分別測定吸光度，計算，并將結果與1.027相乘，即得本品（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O相當標示量的百分含量。百分標示量式中Ax、AS分別為供試品和對照品溶液的吸光度；CS為對照品溶液的濃度mg/ml；m為樣品片粉質量；W為平均片重。1.027為（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O與（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O的質量換算系數。測定法精密量取對照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預先精Fig.12-2TheUV-spectrumofatropinesulfatewithBTBions1.離子對2.染料空白（對照品平行測定，空白吸收可被扣除）3.阿托品（水溶液在420nm附近無吸收）Fig.12-2TheUV-spectrumofa適用范圍廣

分離模式多樣

檢測手段多樣靈敏

選擇和專屬性強

分離速度快重復性好

HPLC優(yōu)點各國藥典中采用HPLC法對莨菪類生物堿的含量和有關物質進行直接分析測定的比例不斷增加。

三、色譜法適用范圍廣分離模式多樣檢測手段多樣靈敏選擇和專屬性強硅醇基效應的消除流動相方面的改進①在流動相中加入含氮堿性競爭試劑(或稱掃尾劑、改性劑)，可抑制或掩蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使生物堿易出峰，且峰形好，最常用的硅醇基抑制劑有二乙胺、三乙胺等。②在適當的pH下使生物堿解離，再在流動相中加入電荷相反的離子對試劑，生成離子對化合物而掩蔽生物堿的堿性基團，這樣就避免與游離的硅醇基作用，使待測組分在非極性固定相中的分配與溶解度增大，從而改善其色譜保留與分離行為。③在流動相中加入季銨鹽等掩蔽試劑，如在甲醇一水的流動相中加入0.01mol/L的溴化四甲基胺，能在較短的保留時間內獲得良好的分離，色譜峰重現(xiàn)性好，也不拖尾，而且甲醇水比例的改變和pH的變化都不影響峰形的對稱性，季銨鹽與固定相表面的硅羥基生成復合物而掩蔽了固定相表面的游離硅醇基。④在流動相中加入電解質緩沖鹽，通過改變流動相的離子強度，穩(wěn)定pH及促進離子對相互作用，起到改善峰形和分離效果的作用。硅醇基效應的消除流動相方面的改進色譜保留常常較弱，從而影響到它們的含量或有關物質HPLC測定的專屬性和準確度。采用離子對高效液相色譜法，可以改善