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文檔簡(jiǎn)介
原代胰腺癌組織中CD133+/ABCG2+細(xì)胞群分選及抗藥性分析,腫瘤學(xué)論文胰腺癌惡性程度極高,確診后生存率很低,是美國(guó)癌癥病死亡原因的第四位或第五位,占胃腸道癌癥死亡的1/5。由于胰腺位于腹膜后,異常感覺和狀態(tài)、體征的不明顯和不典型使之難以得到早期治療,臨床治療效果差,總的5年生存率僅為5%左右。當(dāng)前,手術(shù)切除癌腫是治療早期胰腺癌唯一有效的根治方式方法,而放化療等綜合性治療的效果均不滿意。因而,分子水平研究原發(fā)性胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性機(jī)制,已成為當(dāng)今胰腺癌研究中的熱門和難點(diǎn)。本研究擬利用流式細(xì)胞儀分選(FCMSorting)技術(shù)從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細(xì)胞群,并且通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)分析其特異性指標(biāo),進(jìn)而確定該群細(xì)胞在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用,為后續(xù)腫瘤化療藥物的挑選提供有效模型。
1材料與方式方法
1.1CD133+/ABCG2+人胰腺癌亞群細(xì)胞的挑選:無菌條件下收集胰腺癌患者手術(shù)中切除的腫瘤組織,用PBS清洗組織2次,剪去除組織中的壞死組織等,將腫瘤組織浸泡于青霉素(1000U/mL)和鏈霉素(1000U/mL)混合液中10min。棄去浸泡液,將腫瘤組織剪成直徑1mm的組織小塊,然后參加5倍體積的胰酶消化液(0.25%胰酶含0.02%EDTA),于37℃環(huán)境下震蕩消化30min。隨后,參加5倍體積的含10%胎牛血清的細(xì)胞完全培養(yǎng)基加以終止,上下顛倒震蕩使細(xì)胞脫落,過200目篩網(wǎng),于1500r/min離心5min。收集細(xì)胞沉淀,參加100L預(yù)冷的PBS緩沖液,隨后參加rabbitanti-h(huán)umanCD133-FITC和rabbitanti-h(huán)umanABCG2-PEmonoclonalantibodies(eBio-science生物科技有限公司)各4L,并于4℃環(huán)境中避光孵育30min。利用流式細(xì)胞儀(BDFACSAria,BDBio-science,CA,USA)將CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-分選出來,并懸浮于無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基[DMEM/F12,10ng/mLbasicfi-broblastgrowthfactor(bFGF),10ng/mLepidermalgrowthfactor(EGF),5g/mLinsulin和0.5%bovineserumalbumin(BSA),上述試劑均購于Sigma-Aldrich試劑公司]中,在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。
1.2RNA抽提與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè):按Tr-IzolReagent講明書的步驟,抽提各組細(xì)胞的TotalRNA,并且利用ReverTraAceM-mLVReverseTranscriptase和寡核苷酸引物Oligo(dT)18經(jīng)RT-PCR生成對(duì)應(yīng)的cDNA。測(cè)定其濃度,-20℃保存。以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板,在Ep-pendorfRealPlex4(EppendorfCO.,LTD)上,利用兩步法進(jìn)行qRT-PCR,根據(jù)相對(duì)定量法(mRNA的相對(duì)變化量Ratio=2-Ct︱Ct=[Ct_CD133+/ABCG2+-Ct_CD133-/AB-CG2-])計(jì)算目的片段的擴(kuò)增比例。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%的AgroseGel電泳進(jìn)行分析。檢測(cè)中設(shè)立空白對(duì)照(blankcontrol),均以ddH2O作為模板,各樣本設(shè)立3個(gè)重復(fù),以18SrRNA作為內(nèi)參。
1.3免疫熒光(IF)鑒定:各組細(xì)胞用PBS(0.02moL/L,pH7.4)清洗2次,然后用4%多聚甲醛溶液常溫下固定20min固定液,用封閉液(0.02mol/LPBS中參加0.2%Triton-100和5%正常山羊血清)在37℃下封閉60min。棄封閉液,用PBST(0.02mol/LPBS中參加0.2%Triton-100)漂洗3次,每次5min。
棄廢液,參加一抗(rabbitanti-h(huán)umanOct3/4antibody;rabbitanti-h(huán)umanNanogantibody;SantaCruz公司),于37℃下孵育45min。反響完畢后,用PBST漂洗3次,每次10min,然后參加熒光標(biāo)記二抗(goatanti-rabbitCy3-conjectionantibody;SantaCruz公司)及DAPI,于37℃下避光孵育45min。反響結(jié)束后,用PBST漂洗3次,用50%丙三醇封片,熒光顯微鏡觀察拍照。
1.4軟瓊脂(SoftAgar)克隆集落構(gòu)成實(shí)驗(yàn):在42℃水浴中,將存儲(chǔ)濃度為1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2細(xì)胞完全培養(yǎng)基以1:1(v/v)混合,構(gòu)成終濃度0.6%的底層瓊脂,取1.4mL參加6孔板的一個(gè)孔中。待完全凝固后,取對(duì)數(shù)期細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,并調(diào)細(xì)胞濃度為2104/mL。再將存儲(chǔ)濃度為0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2細(xì)胞完全培養(yǎng)基以1:1(v/v)混合,構(gòu)成終濃度為0.3%的上層瓊脂,取1.0mL上層瓊脂與0.1mL細(xì)胞懸液充分混勻,參加已有下層瓊脂的6孔板中,待其凝固后,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周,計(jì)算細(xì)胞克隆集落構(gòu)成率。
1.5MTT比色法檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞耐藥性:各組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(密度為2103)。在藥物組孔中分別參加30nmoL/L的順鉑和35nmoL/L的吉西他濱,而陰性對(duì)照組中分別參加等體積的PBS緩沖液,置于37℃,5%CO2環(huán)境中分別培養(yǎng)24,48,96h。在檢測(cè)前的4h參加MTT20L(5mg/L),繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心去上清且參加DMSO溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在490nm處讀取所對(duì)應(yīng)的吸光度值(D490),設(shè)立3個(gè)復(fù)孔,取其平均值。測(cè)得各孔吸光度數(shù)值,利用公式:(1-實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值)100%,計(jì)算出藥物對(duì)于細(xì)胞的增殖抑制率。
1.6Westernblot檢測(cè):收集各組細(xì)胞,根據(jù)WesternblotKit講明書中的步驟,抽提各組細(xì)胞的總蛋白,利用Lowry法測(cè)定總蛋白濃度,以每個(gè)泳道20g濃度的蛋白樣品上樣,經(jīng)30%變性SDS-PAGE電泳后,利用半干電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,經(jīng)過封閉、一抗(稀釋倍數(shù)1:1000)孵育、PBST洗脫、HRP標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1:500)孵育、PBST再洗脫等步驟后,ECL化學(xué)發(fā)光及X光片暴光,并且經(jīng)定影顯影處理,獲得清楚明晰條帶。利用BandScan軟件分析各條帶的A值。
1.7裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn):收集各組細(xì)胞、離心、收集沉淀,利用冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整至細(xì)胞密度為10000/L。取2只裸鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),分別于背部皮下組織注射20L細(xì)胞懸液,華而不實(shí)1只注射CD133+/ABCG2+細(xì)胞,另1只注射CD133-/ABCG2-細(xì)胞。所有裸鼠均飼養(yǎng)于一樣的環(huán)境(SPF級(jí))中,每周觀察一次背部瘤體構(gòu)成情況。
1.8亞硫酸氫鈉處理及甲基化特異性PCR(MS-PCR)鑒定ABCG2啟動(dòng)子甲基化:抽提各組細(xì)胞的基因組DNA,并按CpGeno-meTMDNAModificationKit講明書的步驟完成基因組DNA的體外修飾。取各組細(xì)胞重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA(2L)作為模板,同時(shí)在PCR管中分別參加上下游引物(0.01nmoL)各0.5L、2HotStartTaqPCRMasterMix10L及ddH2O7L,使得MS-PCR總反響體系為20L。根據(jù)引物序列及PCR反響經(jīng)過及溫度進(jìn)行MS-PCR檢測(cè)。PCR反響完成后,其產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂塘凝膠檢測(cè),并且利用BandScan軟件分析各條帶的A值。
1.9統(tǒng)計(jì)方式方法:本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示,利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞高表示出干細(xì)胞標(biāo)志:本研究中,我們共收集了3例胰腺癌患者的手術(shù)切除腫瘤組織(編號(hào)為:PC1-PC3),都為胰腺導(dǎo)管腺癌,病理分期為Ⅱ期。通過胰酶消化和流式細(xì)胞分選技術(shù),我們從胰腺癌組織中獲取了CD133+/ABCG2+的細(xì)胞亞群。經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在胰腺癌原代細(xì)胞中,CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群所占的比例非常小,而絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為CD133-/ABCG2-細(xì)胞(占總細(xì)胞數(shù)的)。原代的CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-均以無血清培養(yǎng)基在體外進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(suspendedcultured),當(dāng)傳代至第9代的時(shí)候,CD133-/ABCG2-出現(xiàn)大量的死亡細(xì)胞,而CD133+/ABCG2+細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng),華而不實(shí)細(xì)胞顆粒小且密集,折光度好,顯示出非常好的生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1)。我們利用qRT-PCR檢測(cè)了各類細(xì)胞群干細(xì)胞生物標(biāo)志(biomarkers)表示出情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚,CD133+/ABCG2+細(xì)胞群較CD133-/ABCG2-細(xì)胞群高表示出SoX2、Oct4等干細(xì)胞標(biāo)志(圖2)。同時(shí),Westernblot和免疫熒光(IF)檢測(cè)也同樣顯示了CD133+/ABCG2+細(xì)胞群較CD133-/ABCG2-細(xì)胞群高表示出干細(xì)胞生物標(biāo)志(圖3)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD133+/ABCG2+細(xì)胞群具有典型的干細(xì)胞特性。
2.2CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞在體外增殖能力明顯加強(qiáng)且具有高侵襲性:選擇第7代的細(xì)胞,每2d統(tǒng)計(jì)一次細(xì)胞的增殖數(shù)量,連續(xù)計(jì)算10d,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示清楚,CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群自第4天起出現(xiàn)明顯的增殖趨勢(shì),而CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞至第6天才進(jìn)入增殖期。結(jié)果表示清楚,CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我增殖能力(圖4)。同時(shí),細(xì)胞克隆構(gòu)成實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD133+/ABCG2+亞群細(xì)克隆構(gòu)成能力明顯高于CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞(圖4)。
2.3CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有高耐藥性:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在順鉑或吉西他濱藥物刺激下,CD133-/ABCG2-細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的增殖抑制現(xiàn)象,其增殖抑制強(qiáng)度與化療藥物刺激時(shí)間的長(zhǎng)短具有明顯的相關(guān)性(圖4)。而CD133+/ABCG2+細(xì)胞對(duì)于順鉑或吉西他濱均表現(xiàn)出很好的耐受性,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,其增殖抑制率均顯著低于CD133-/ABCG2-細(xì)胞。結(jié)果證實(shí),CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有較高腫瘤細(xì)胞化療藥物耐受性。
2.4CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有高致瘤性:選取少量的細(xì)胞(約為10000/L)接種于裸鼠背部皮下。大約在8周之后,CD133+/ABCG2+細(xì)胞接種鼠的背部能夠觀察到有明顯的瘤體產(chǎn)生,而接種CD133-/ABCG2-細(xì)胞的裸鼠背部一樣位置上并未發(fā)現(xiàn)有瘤體。繼續(xù)飼養(yǎng)2周,CD133+/ABCG2+細(xì)胞接種鼠的瘤體不斷長(zhǎng)大,而接種CD133-/ABCG2-細(xì)胞的裸鼠背部仍然未發(fā)現(xiàn)有瘤體長(zhǎng)出(圖5)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)講明,CD133+/ABCG2+細(xì)胞具有典型的腫瘤干細(xì)胞強(qiáng)致瘤性的特征。2.5多耐藥基因ABCG2啟動(dòng)子區(qū)域在CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞中呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài):兩組細(xì)胞的基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后,以ABCG2啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行MS-PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞中,ABCG2非甲基化引物PCR結(jié)果呈現(xiàn)出陽性條帶,而在CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞中,ABCG2非甲基化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物則無明顯條帶,提示CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群中,ABCG2啟動(dòng)子區(qū)域存在去甲基化現(xiàn)象(圖6)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD133+/ABCG2+胰腺癌細(xì)胞中,由于ABCG2啟動(dòng)子去甲基化而導(dǎo)致其高表示出,使其具有較強(qiáng)的化療耐藥性。該研究中,利用5-Aza-CdR(10mol/L)處理細(xì)胞,作為MS-PCR檢測(cè)的陰性對(duì)照。3討論腫瘤學(xué)傳統(tǒng)觀點(diǎn)以為,腫瘤中每個(gè)瘤細(xì)胞都具有無限增殖和構(gòu)成克隆瘤灶的的能力,但詳細(xì)哪個(gè)瘤細(xì)胞能夠構(gòu)成新瘤灶是隨機(jī)的。而如今頗受關(guān)注的腫瘤干細(xì)胞(CancerStemCell)學(xué)講則對(duì)此種觀點(diǎn)提出挑戰(zhàn)。該學(xué)講以為,腫瘤組織中存在著一小群腫瘤干細(xì)胞(或起始細(xì)胞);其單個(gè)細(xì)胞即可發(fā)展為腫瘤,具有干細(xì)胞自我更新和多向分化能力等特征。此種學(xué)講還以為,腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤構(gòu)成的起始細(xì)胞,維持著腫瘤的生長(zhǎng),可能是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制的根本源頭。
利用流式細(xì)胞術(shù)來分選出具有特定分子標(biāo)志的細(xì)胞群體是挑選腫瘤干細(xì)胞的經(jīng)典方式方法。腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞來源于一群邊緣細(xì)胞群(SidePopulation,SP),亦稱之為側(cè)群細(xì)胞。1996年Goodle等利用流式細(xì)胞術(shù)研究骨髓細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過Hoechst33342染色后并非所有的細(xì)胞都可發(fā)出藍(lán)色熒光,而有大約不到0.1%的細(xì)胞并未被染料著色。
然而,這群細(xì)胞卻高度表示出干細(xì)胞的標(biāo)記sca1+/Lin-。相關(guān)研究同時(shí)還指出,SP細(xì)胞之所以能夠不被Hoechst33342染色,是由于其高度表示出ABCG2蛋白。ABCG2蛋白全稱為ATP結(jié)合G蛋白偶聯(lián)超家族泵蛋白成員,其存在能夠?qū)⒁恍┬》肿尤玖?Hoechst33342、羅丹明123等)及化療藥物等物質(zhì)通過離子交換形式泵出細(xì)胞外,以避免這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生理生化活動(dòng)的干擾。由此可見,在腫瘤細(xì)胞中,ABCG2蛋白的表示出情況與腫瘤耐藥性具有密切的聯(lián)絡(luò);而腫瘤干細(xì)胞之所以高度耐藥,與其細(xì)胞膜上ABCG2蛋白的過度表示出關(guān)系密切。
本試驗(yàn)中,利用流式細(xì)胞儀分選(FCMSorting)技術(shù)從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細(xì)胞群,并且通過細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)、耐藥性實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆構(gòu)成實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR及WesternBlotting分析其耐藥性、干細(xì)胞標(biāo)志、腫瘤克隆構(gòu)成率及遷徙特性,結(jié)果表示清楚該亞群細(xì)胞高表示出干細(xì)胞標(biāo)志物(如:Oct4、SoX2),和普通胰腺癌細(xì)胞相比,具有更強(qiáng)的侵襲性和克隆構(gòu)成能力以及更強(qiáng)的化療耐藥性。
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