真菌的實驗診斷胡主任

關(guān)于真菌的實驗診斷胡主任1第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日2真菌感染的危險因素：中心靜脈插管 尿道插管廣譜抗生素氣管插管腹部外科腸胃外營養(yǎng)營養(yǎng)不良住院時間感染之前定殖第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日3醫(yī)學(xué)重要的酵母菌分類SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64

條件致病的酵母菌

念珠菌屬

非念珠菌屬白念珠菌

非白念珠菌熱帶念珠菌近平滑念珠菌光滑念珠菌克柔念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌

隱球菌屬新型隱球菌

毛孢子菌屬白吉利毛孢子菌頭狀毛孢子菌

酵母屬釀酒酵母

紅酵母屬第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日4

霉菌

曲霉菌屬

非曲霉菌屬煙曲霉非煙曲霉

黃曲霉黑曲霉土曲霉

鐮刀霉

茄病鐮刀霉 尖孢鐮刀霉

賽多孢屬

尖端賽多孢 多育賽多孢

接合菌

根霉屬 毛霉屬 根毛霉屬 梨頭霉屬 小克銀漢霉屬

暗色孢霉

鏈格孢霉屬

萬氏霉屬

雙極菌屬

彎孢屬醫(yī)學(xué)重要的霉菌分類SegalB,BowEJ,MenichettiF:InfectDisClinNAm2002;16:935-64第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日5診斷方法影像學(xué)組織病理學(xué)/細(xì)胞學(xué)培養(yǎng)血清學(xué)分子生物學(xué)方法：

PlateliaAspergillusELISAFungitellassayPCR（unavailable）傳統(tǒng)的方法第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日6

TimeAxisofMethodsforDetectionofPulmonaryAspergillosisCTpositive

123456789101112131415chestX-rayantigen?-glucanculturehistologyPCRKamiMetal,ClinInfectDis2001;33:1504-12第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日7真菌病實驗室診斷主要內(nèi)容準(zhǔn)確、快速檢出真菌病原體真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué)第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日8真菌感染的診斷直接涂片真菌培養(yǎng)組織病理＋真菌培養(yǎng)是“金標(biāo)準(zhǔn)”第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日9有意義的真菌培養(yǎng)標(biāo)本非經(jīng)口痰標(biāo)本非插管尿標(biāo)本血液或其他無菌體液(膽汁、胸腹水、腦脊液）第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日10直接鏡檢的浮載液和染色劑KOH-10~20%-皮膚標(biāo)本Gramstain-真菌均為陽性Calcofluorwhite-熒光染色India-ink-墨汁染色LPCB-乳酸酚棉藍(lán)Immunofluorescence-免疫熒光第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日11直接鏡檢對痰、竇道排泄物及氣管沖洗液等標(biāo)本直接鏡檢可以看到透明分支的菌絲、膿血或痰太粘稠用10％KOH處理后再進行鏡檢如果曲霉菌寄生與空氣相通的器官中，鏡檢甚至可以看到曲霉頭菌絲有隔，呈二叉型，45℃分枝。第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日12菌絲和孢子第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日13直接鏡檢——酵母細(xì)胞第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日14隱球菌病—直接鏡檢（墨汁染色）第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日15有意義的涂片結(jié)果機體內(nèi)部標(biāo)本如血液、腹水、CSF、膿腫穿刺液等新鮮尿液見到大量菌絲及孢子口腔、陰道、支氣管灌洗液見到酵母樣菌應(yīng)作培養(yǎng)確定第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日16多細(xì)胞真菌形態(tài)sporehypha第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日17真菌培養(yǎng)第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日18真菌培養(yǎng)檢查目的—提高病原體檢出的陽性率，確定致病菌的種類。意義——發(fā)現(xiàn)肯定的致病原如新生隱球菌時，診斷即可確立。

—分離出條件致病菌如白念珠菌或煙曲霉，應(yīng)結(jié)合臨床情況進行判斷。

—無菌部位如血液或腦脊液中分離出條件致病菌常提示肯定的感染，但對來自于膿、痰或尿的標(biāo)本則應(yīng)謹(jǐn)慎解釋結(jié)果。但任何一株培養(yǎng)物都不應(yīng)輕易視為污染菌。需結(jié)合直接鏡檢的結(jié)果，強調(diào)直接鏡檢與培養(yǎng)檢查相結(jié)合的重要性。強調(diào)臨床醫(yī)師與實驗室檢驗人員之間的相互聯(lián)系。第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日19092第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日20區(qū)分酵母樣或霉樣菌落第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日21Aspergillusfumigatus-ColonialMorphology,Sabouraud葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基煙曲霉菌第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日22Aspergillusfumigatus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(單列)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、分生孢子第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日23Aspergillusflavus-在Sabouraud葡萄糖瓊脂黃曲霉菌生長快黃色表面粉末狀第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日24Aspergillusflavus-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue黃曲霉菌(二列為主)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、梗基、分生孢子第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日25Penicilliumspecies-ColonialMorphology,Sabouraudagar青霉屬氣生菌絲密毯狀第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日26Penicilliumspecies-MicroscopicMorphology,400xLactophenolcottonblue青霉屬(帚狀枝,分生孢子)第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日27Aspergillusniger-ColonialMorphology,Sabouraudagar黑曲霉菌(背面)第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日28Aspergillusniger-MicroscopicMorphology,100xLactophenolcottonblue(二列為主)分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、瓶梗、?；?、分生孢子第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日29真菌體外藥敏試驗第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日30真菌體外藥敏試驗1K-B法2MIC法3E-test法第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日31液基稀釋法

CLSIM27A2：致病性酵母菌

CLSIM38A：產(chǎn)孢絲狀真菌瓊脂稀釋法紙片擴散法——CLSIM44-AE－test法抗真菌藥物體外敏感試驗第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日32第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日33E-test法：可用于酵母樣真菌和絲狀真菌第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日34096第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日35白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日36白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日37白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日38白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日39白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日40白色念珠菌近平滑念珠菌熱帶念珠菌光滑念珠菌第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日41體外抗真菌藥敏試驗與體內(nèi)療效90-60原則—MIC值與臨床療效

藥敏試驗敏感菌株：90%對治療有效藥敏試驗?zāi)退幘辏?0%對治療有效

MahmoudA.G,JCM1996,34:489-495；RexJ,CID2002,35:982-989第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日42

真菌特異性抗原的免疫學(xué)檢測

1(1-3)-?-D-葡聚糖

2半乳甘露聚糖

3甘露聚糖

4D-阿拉伯糖醇

5烯醇化酶

6新生隱球菌莢膜抗原第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日43(1-3)-?-D-Glucan(葡聚糖)“G”試驗第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日44(1-3)--D-Glucan生物活性(1-3)--D-Glucan作為真菌細(xì)胞壁成分之一，一旦進入機體后，將引起真菌病，嚴(yán)重時將會引起嚴(yán)重的深部真菌感染疾病，因此,深部真菌感染對患者的健康與生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅.傳統(tǒng)檢測方法為真菌培養(yǎng)，一是周期長，二是陽性率特別低．主要是抗生素類藥物的濫用所引起．真菌感染出現(xiàn)逐漸上升趨勢．第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日45“G”試驗緣何而來？第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日46比濁法反應(yīng)機理

細(xì)菌內(nèi)毒素 （1-3）-D-Glucan LAL-RM(反應(yīng)物)因子C 活化因子C

因子B 活化因子B活化因子G

因子G

凝固酶原 凝固酶

凝固蛋白原 凝固蛋白（凝膠）定量濁度儀 TurbidimetrictechniqueGEL第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日47G試驗1-3-β-D-Glucan葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的細(xì)胞壁中，能特異性激活G因子，從而激活鱟試驗，此過程稱為G試驗?？谘什磕钪榫試驗結(jié)果陰性隱球菌,毛霉菌感染G試驗假陰性第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日48(1→3)-β-D-葡聚糖檢測是酵母菌及絲狀真菌細(xì)胞壁上的一種成分內(nèi)毒素檢測方法應(yīng)用范圍：曲霉菌、念珠菌、鐮刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌隱球菌、毛霉菌除外已在美國FDA以及一些歐洲國家得到批準(zhǔn)

第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日49(1→3)-β-D-葡聚糖檢測美國主要針對念珠菌血癥進行了研究需要更多有關(guān)其它感染的研究信息（侵襲性曲霉菌病）沒有真菌感染的患者血液中也會出現(xiàn)β-D-葡聚糖：-血液透析-使用血制品（白蛋白、丙球）-使用含有葡聚糖的紗布臨床上陽性結(jié)果出現(xiàn)較晚使用某種抗生素是否會導(dǎo)致假陽性？

第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日50G試驗商品化試劑盒detectsinonehour1天津濱海新區(qū)金山川公司生產(chǎn)產(chǎn)品

2Fungitec-Gglucan(Seikagaku)Obayashi1992cutoff：

20pg/ml3FungitellTMAssay(AssociatesofCAPECOD)cutoff：80pg/ml第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日511輸注白蛋白或球蛋白2血液透析(纖維素濾膜）3輸注抗腫瘤多糖類藥物4使用磺胺類藥物5外科手術(shù)后早期6標(biāo)本接觸紗布G試驗假陽性問題第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日52酵母菌、絲狀真菌細(xì)胞壁成分不僅檢測曲霉菌，還可以檢測念珠菌、鐮刀菌、毛孢子菌、支頂孢屬不能檢測：隱球菌和接合菌美國FDA已批準(zhǔn)，歐洲部分國家已注冊敏感性、特異性：90％左右－D－葡聚糖的價值第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日53－D－葡聚糖（G試驗）的缺陷標(biāo)本采集不能鑒定何種真菌感染第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日54－D－葡聚糖參考值健康人：<10pg/ml

可疑感染：10~20pg/ml深部真菌感染：>20pg/ml第五十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日55ThecutoffofGtestCutoff(pg/ml)Sensitivity(%)Specificity(%)6069.987.18064.492.4ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654-9ThecutoffofGtest第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日56曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日57曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure1-10Noncompetitivesandwichmethodofimmunoassay第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日58曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）曲霉菌細(xì)胞壁上一種多聚糖抗原可以從血清、腦脊、胸水、BALF檢測到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高1ng/mlLatexagglutination：15ng/ml第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日59影響GM檢測的因素宿主曲霉菌疾病譜高?；颊叩闹委烥M的其它來源GM的循環(huán)動力學(xué)抗GM抗體真菌曲霉菌種類？營養(yǎng)情況GM釋放的動力學(xué)？策略采樣頻率標(biāo)本種類陽性定義試驗設(shè)計方法Cut-off方法/實驗室內(nèi)差異手工vs自動化第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日60GM試驗假陽性問題以乳或乳制品為主食的嬰幼兒異體骨髓移植患者菌血癥患者自身抗體陽性患者使用半合成青霉素第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日61GM與β內(nèi)酰胺類抗生素GM與哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、青霉素V有交叉反應(yīng)錯誤地提高了診斷的確定性

第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日62合適的判定折點：1.0,0.7,0.5?在兒童的應(yīng)用價值？食物中的GM可以被吸收，假陽性？哌拉西林/他唑巴坦治療，假陽性？非血液病患者應(yīng)用不多抗真菌治療對結(jié)果的影響？半乳甘露聚糖(GM)檢測存在的問題第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日63兩種試驗敏感性、特異性相當(dāng)都可以在早期診斷侵襲性曲霉病，但是－D－葡聚糖可能出現(xiàn)更早兩者結(jié)合，可以互補彌補GM假陰性可能同樣在粒細(xì)胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究半乳甘露聚糖(GM)與－D－葡聚糖的比較第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日64血清抗體檢測由于患者存在免疫受損，抗原遞呈功能和及淋巴細(xì)胞功能受損，不能產(chǎn)生足夠的抗體。診斷價值較低。第六十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日65系統(tǒng)性真菌感染診斷的進展第六十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日66檢測真菌的特異性酶白念—N-乙酰-D半乳糖苷酶白念—脯氨酸按肽酶都柏林念珠菌N-乙酰-D半乳糖苷酶克柔酸性磷酸酶熱帶吡烙磷酸酶平滑-D半乳糖苷酶新生隱球菌酚氧酶第六十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日67PCR

通過擴增曲霉菌特異基因片斷，達到快速診斷的目的，但容易污染。第六十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日68PCR診斷侵襲性真菌病一種可能的全真菌檢測方法可能用來進行血清學(xué)篩查（早期診斷）方法和標(biāo)本不同，敏感性及特異性不同底線：有診斷潛能，但還不是最佳的方法

AlexanderB,TransplInfectDis,2002,(supply3)