發(fā)育生物學(xué)第六講輔助生育技術(shù)應(yīng)用試管嬰兒克隆技術(shù)應(yīng)用

發(fā)育生物學(xué)第六講輔助生育技術(shù)應(yīng)用試管嬰兒克隆技術(shù)應(yīng)用2010年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予英國(guó)生理學(xué)家RobertEdwards

,以表彰他在體外受精技術(shù)領(lǐng)域做出的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。不孕癥或不育癥：

結(jié)婚兩年（世界衛(wèi)生組織WHO1986年標(biāo)準(zhǔn)采用1年），有正常性生活、沒有采取避孕措施而未懷孕，稱為不孕癥(infertility)或不育癥。不育孕癥的發(fā)病率發(fā)達(dá)國(guó)家5%-8%,我國(guó)為6-10%女性不孕占60%，男性占40%全世界：約8000萬-1.1億

由于學(xué)習(xí)、就業(yè)壓力，性傳播疾病、環(huán)境污染的加重，發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。

不孕癥的分類

原發(fā)性不孕指婦女（婚后）從未受孕者；繼發(fā)性不孕指（婚后）曾有過妊娠，未采取避孕措施，隔二年后未再受孕者；絕對(duì)性不孕指夫婦一方（或雙方）有先天或后天解剖生理缺損致不能懷孕者（尚無治療康復(fù)可能的）；相對(duì)性不孕指有受孕可能，但因某種因素阻礙受孕或減低生育能力，致使女方暫時(shí)不能受孕，通過治療，仍能受孕者。女性不孕的原因1、排卵障礙3.子宮因素2.輸卵管不通暢或功能不良

4.子宮頸因素5.子宮內(nèi)膜異位癥6.不明原因不孕：有10%的不孕夫婦經(jīng)各種檢查不能發(fā)現(xiàn)異常。A）精液異常：精子＜2000萬/毫升，活精率＜

50%，畸形精子＞50%。

先天發(fā)育異常：如雙側(cè)隱睪全身因素：抽煙，酗酒等局部因素：睪丸結(jié)核，精索靜脈曲張男性不育的原因B）妨礙精子運(yùn)送：陽痿，早泄C）免疫因素：精漿產(chǎn)生抗精子的抗體不孕不育癥的檢查：

1.有無排卵

2.輸卵管是否通暢

3.B超檢查有無子宮病變、內(nèi)膜異位癥等

4.男方精液是否正常

輔助生育技術(shù)概述輔助生育技術(shù)（AssistedReproductionTechnology，ART）：

指人工輔助受精或胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植的生殖方法。

觀察胚胎發(fā)育過程，揭示生殖奧秘

治療不育不孕癥生殖醫(yī)學(xué)成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的核心。試管嬰兒技術(shù)體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）：又稱試管嬰兒，是指分別將卵子與精子取出后，在體外(培養(yǎng)皿中)使其受精，并發(fā)育成胚胎后，再植回母體子宮內(nèi)。1978年7月25日世界上第1例試管嬰兒LouiseBrown,20世紀(jì)世界醫(yī)學(xué)史上最偉大的事件之一。輔助生育技術(shù)發(fā)展史1997年12月美國(guó)報(bào)道了人克隆胚胎成功，但由于禁止人克隆的呼聲，12天后被銷毀。1998年11月美國(guó)獲得5個(gè)胚胎干細(xì)胞系和人胚胎生殖細(xì)胞建系工作。1984年，世界上第一例冰凍胚胎的嬰兒在英國(guó)誕生。1988年北京醫(yī)科大學(xué)附屬三院誕生首例試管嬰兒，與世界首例相差10年時(shí)間

(原因：中國(guó)的計(jì)劃生育國(guó)策，國(guó)內(nèi)技術(shù)設(shè)備落后，住處閉塞等)中國(guó)輔助生育技術(shù)的發(fā)展贈(zèng)卵試管嬰兒于1992年6月12日首例凍融胚胎移植試管嬰兒于1995年2月6日1996年中山醫(yī)科大學(xué)單精子卵胞漿內(nèi)注射技術(shù)(第二代試管嬰兒)，解決了男性不育的問題，與先進(jìn)國(guó)家差距僅為4年。首例代孕試管嬰兒于1996年9月8日誕生。我國(guó)試管嬰兒臨床妊娠率保持在30%-40%左右，近期出生試管嬰兒達(dá)到3萬多個(gè)。

全球試管嬰兒超過三百萬人七十對(duì)試管嬰兒“回娘家”

輔助生殖技術(shù)方法:

1.宮腔內(nèi)丈夫精液人工授精（IUI）6.胚胎移植前遺傳學(xué)診斷(PGD)(第三代試管嬰兒)

5.贈(zèng)卵及贈(zèng)胚試管嬰兒4.冷凍胚胎3.單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI)(第二代試管嬰兒)2.體外受精胚胎移植（IVF）(第一代試管嬰兒)7.卵胞漿置換術(shù)(第四代試管嬰兒)1.宮腔內(nèi)丈夫精液人工授精方法:洗滌精液并使制之獲能，在女方排卵期內(nèi)通過導(dǎo)管注入宮腔.主要適合下列病人：

1.中度少精，弱精癥的患者2.精液不液化

3.宮頸粘液或精液中有抗體4.不明原因不孕

5.陽痿，早泄的病人瀘醫(yī)附院順利通過省衛(wèi)生廳生殖技術(shù)校驗(yàn)檢查四川省衛(wèi)生廳專家一行對(duì)瀘醫(yī)附院的“夫精人工授精技術(shù)”進(jìn)行校驗(yàn)檢查，自2010年開展以來，已成功授孕22例，分娩10例。2.體外受精胚胎移植（IVF）(第一代試管嬰兒)過程

超排卵取卵取精體外受精胚胎體外培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植后補(bǔ)充黃體酮胚胎移植后第14天驗(yàn)晨尿確定是否妊娠妊娠后14天，B超檢查胎兒數(shù)及胚胎著床部位試管嬰兒三關(guān)：人工誘發(fā)超排卵和采集卵細(xì)胞體外受精、體外培養(yǎng)胚胎移植A人工誘發(fā)排卵----超排卵（superovulation）

枸櫞克羅米酚（CC）、人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）、卵泡刺激素（FSH）、生長(zhǎng)激素（GH）、促性腺激素釋放激素類似物（GnRHa）。常規(guī)用GnRH-a進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)有2個(gè)或兩個(gè)以上卵泡直徑大于16～18mm時(shí)，注射5000～10000IU的hCG，誘發(fā)卵細(xì)胞成熟及便于卵細(xì)胞從卵泡壁脫離。

B采集卵細(xì)胞目前使用超聲裝置和穿刺針結(jié)合為一體的陰道探頭取卵。負(fù)壓吸取2～3ml卵泡液并在顯微解剖鏡下檢查有無卵細(xì)胞，并判斷其成熟度；培養(yǎng)3～6h完全成熟精液液化進(jìn)行常規(guī)檢查;處理精子,使精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng);將含精子混懸液與成熟卵細(xì)胞培養(yǎng)受精;C體外受精和體外培養(yǎng)在37℃培養(yǎng)中完成受精,30h左可見第一次卵裂為2細(xì)胞胚卵；在40h左右二次卵裂成4細(xì)胞胚卵；到48h后，胚卵一般處于4～8細(xì)胞階段。胚卵發(fā)育到16細(xì)胞階段約需85h，早期胚囊約需120h。試管嬰兒中卵裂的分級(jí)(速度\結(jié)構(gòu))Ⅱ級(jí)Ⅰ級(jí)Ⅲ級(jí)Ⅳ級(jí)D胚胎移植移植時(shí)間：受精48h后，選擇約8細(xì)胞階段或胚泡階段。

移植過程：吸入含有胚胎的移植液，應(yīng)試者取臥位，在超聲波引導(dǎo)下插入導(dǎo)管于宮腔中，注入胚胎移植液，靜置60s后慢慢拔出導(dǎo)管。

術(shù)后護(hù)理：應(yīng)試者臥床24h，限制活動(dòng)3～4天，同時(shí)接受黃體酮等孕激素助孕，于10天后進(jìn)行早期妊娠檢查與診斷。單胚移植妊娠成功率為10.7％，2個(gè)胚胎移植的成功率為32％，4個(gè)胚胎移植的成功率為37.8％，而移植5個(gè)胚胎的成功率卻反而下降，僅為13％。目前認(rèn)為，移植2～4個(gè)胚胎較為合適。移植成功率

①少精、弱精：精子密度＜20×106ml，活精子＜50%,快速前向移動(dòng)精子＜25%；②輸卵管堵塞、子宮內(nèi)膜異位癥等的不孕癥患者；③原因不明的不育癥：夫妻雙方經(jīng)過檢查均無異常發(fā)現(xiàn)。

(3)體外受精-胚胎移植的適應(yīng)癥3.卵母細(xì)胞單精子注射技術(shù)（ICSI)---

第二代試管嬰兒適應(yīng)癥：嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥（數(shù)量約低于2千萬/m1，且活率低于50％，活力II級(jí)以下）；不可逆的梗阻性無精子癥；生精功能障礙、阻塞性無精等

（如輸精管梗阻，而睪丸或附睪穿剌活檢有精子）；男性免疫性不育（存在抗精子抗體等，通過單精子注射技術(shù)進(jìn)行洗滌處理）；體外受精--胚胎移植受精失??；精子無頂體或頂體功能異常。

方法：選擇活力好、形態(tài)正常的單個(gè)精子用顯微注射器將其直接注射到卵細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)至分裂后，將胚胎移植到子宮腔內(nèi)使其繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育成胎兒。卵母細(xì)胞單精子顯微注射Intra-cytoplasmicsperminjection(ICSI)4.胚胎植入前遺傳學(xué)診斷PGD—

第三代試管嬰兒指將患者的卵子用第一代試管嬰兒(IVF)技術(shù)或第二代試管嬰兒技術(shù)授精，當(dāng)胚胎培養(yǎng)到6-8細(xì)胞期，取出1-2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，診斷染色體病或基因病，挑選正常的胚胎移植，可以避免將遺傳病傳給下一代。適應(yīng)癥為：?jiǎn)位蛳嚓P(guān)遺傳病、染色體病、性連鎖遺傳病及可能生育異常患兒的高風(fēng)險(xiǎn)人群等。

中山醫(yī)科大學(xué)已經(jīng)成功地對(duì)胚胎進(jìn)行活檢并基因診斷Genetictestingperformedpriortoembryotransfer5.冷凍胚胎

移植后尚有剩余的胚胎可以冷凍儲(chǔ)存,用于補(bǔ)充治療，但凍融對(duì)胚胎是損傷，影響胚胎生命力。6.贈(zèng)卵試管嬰兒7.卵胞漿置換術(shù)----第四代試管嬰兒

由于胚胎中存在第三者的卵漿，人們對(duì)其遺傳特征產(chǎn)生質(zhì)疑，這對(duì)社會(huì)倫理觀念構(gòu)成了一定的挑戰(zhàn)。2003年10月1日，衛(wèi)生部開始實(shí)施的《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》，對(duì)禁止使用技術(shù)作了明確規(guī)定。第一代“試管嬰兒”主要適合于輸卵管堵塞、子宮內(nèi)膜異位癥等的不孕癥患者，把精子和卵子放在一起，增加兩者相遇機(jī)會(huì)。第二代“試管嬰兒”技術(shù)是將單個(gè)精子直接注射入卵子里，從而“制造”出受精卵、胚胎，它適用于男方少精、弱精、甚至無精的情況第三代“試管嬰兒”技術(shù)主要適合于植入前遺傳學(xué)診斷，解決遺傳病及優(yōu)生問題。第四代“試管嬰兒”技術(shù)主要適合于年齡大的患者。

第一、二、三、四代試管嬰兒只是適應(yīng)癥不同，不是一代比一代好

分析：有一位母親是血友病基因的攜帶者，她自己雖然不發(fā)病，但是，她的兩個(gè)兒子都是血友病患者，接連不幸夭折。這位悲傷的母親來到試管嬰兒中心，要求給她做試管嬰兒。請(qǐng)分析該婦女適合做那種試管嬰兒？

血友病是一種X染色體連鎖隱性遺傳性疾病

“第三代”試管嬰兒

超排卵方案二、輔助生育技術(shù)的開展的影響因素種植前遺傳學(xué)診斷比最初設(shè)想的復(fù)雜單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）的安全性2012-07-20衛(wèi)生部批準(zhǔn)102家醫(yī)療機(jī)構(gòu)可進(jìn)行輔助生育技術(shù),9家機(jī)構(gòu)設(shè)置人類精子庫（cryopreservedsemen,spermbank）

四川?。?4家)

1、四川大學(xué)華西第二醫(yī)院：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射、供精人工授精技術(shù)。

2、成都市錦江區(qū)婦幼保健院：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)。

3、四川省人民醫(yī)院：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)。

4、四川生殖學(xué)院附屬醫(yī)院：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)。

重慶市：(2家)1、重慶市婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖與遺傳研究所：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射、胚胎移植前遺傳學(xué)診斷、供精人工授精技術(shù)。2、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：體外受精-胚胎移植、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)

二、批準(zhǔn)設(shè)置人類精子庫的機(jī)構(gòu)(11家)

1、中信湘雅不孕與遺傳?？漆t(yī)院

2、江蘇省人民醫(yī)院

3、廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院

4、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院

5、浙江省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所

6、國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所

7、山東省立醫(yī)院

8、山西省計(jì)劃生育科學(xué)研究所附屬醫(yī)院

9、河南省婦幼保健院(2008年通過)10、湖北省人類精子庫

11、重慶計(jì)劃生育科學(xué)研究所附屬醫(yī)院精子庫(2012-03-09

)精子庫的建立優(yōu)點(diǎn)甚多：冷凍精子可貯存20年，男子放心作結(jié)扎手術(shù)；二是有利于優(yōu)生，選擇健康的精子可使患有遺傳性疾病男子的妻子受孕，杜絕父方的有害遺傳；三是為解決男性不育癥提供了有效的方法；四是為優(yōu)生學(xué)提供了科學(xué)依據(jù)；五是有利于解決珍稀動(dòng)物和瀕危動(dòng)物的種族繁衍。費(fèi)用促排卵藥物的費(fèi)用：進(jìn)口藥和國(guó)產(chǎn)藥3000-20000元不等，一般花費(fèi)在5000-10000元左右.手術(shù)及實(shí)驗(yàn)室操作費(fèi)用,一般大約1萬元左右?？偟幕ㄙM(fèi)在1萬多至3萬多元不等。

那些人不適合做試管嬰兒

1.女方有重要的臟器功能異常者，如心臟、肝臟、腎臟疾病等而不能經(jīng)受妊娠及分娩

2.女方體內(nèi)存在急性或慢性活動(dòng)性傳染性疾病、急性感染性急病

3.女方有卵巢、子宮或乳腺惡性腫瘤者，不能接受接受胚胎移植著床、生長(zhǎng)

影響成功率的因素（1）女方因素：超過35周歲時(shí)影響妊娠率;單純因雙側(cè)輸卵管梗阻引起的不孕，其成功率較高。（2）男方因素：嚴(yán)重的精液異常等，其成功率較低（4）誘發(fā)超排卵影響：卵泡的數(shù)量、大小及發(fā)育速率等均影響其成功率。（5）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作的影響(白人夫婦生出黑孩子)4、醫(yī)學(xué)專家呼吁規(guī)范輔助生育技術(shù)

我國(guó)不育的發(fā)病率在10％左右，只有1％至2％（1／3）的試管嬰兒不靠試管就可以來到人間。經(jīng)濟(jì)效益的驅(qū)動(dòng)使個(gè)別醫(yī)療機(jī)構(gòu)盲目擴(kuò)大試管嬰兒的適應(yīng)征。美國(guó)的一個(gè)醫(yī)生未經(jīng)患者許可，用自己的精子為幾十名婦女做了人工受精，結(jié)果有了75個(gè)自己的孩子，被法院判處他256年監(jiān)禁。（1）人工受精技術(shù)給我們帶來的一系列社會(huì)與道德問題。

1987年我國(guó)第一例因人工受精引起的法律糾紛發(fā)人深省。嬰兒相貌與供精者（生物學(xué)）父親相似，但與養(yǎng)父（社會(huì)學(xué)父親）長(zhǎng)相全然不同，在巨大的社會(huì)輿論下，養(yǎng)父的心理防線崩潰，最終導(dǎo)致家庭的破裂。

5、輔助生育技術(shù)使用帶來的問題

精源的商業(yè)化造成了嚴(yán)重的社會(huì)問題，不僅給社會(huì)和不孕家庭帶來了痛苦和負(fù)擔(dān)，也違背了人工受精的初衷。

從技術(shù)上講，目前人類已具備使一個(gè)孩子有5位父母的可能：精子的捐贈(zèng)者、卵子的捐贈(zèng)者、懷孕母親、撫養(yǎng)孩子的父母

社會(huì)學(xué)問題：誰是人工受精出生孩子的合法父親？社會(huì)學(xué)父親應(yīng)負(fù)的責(zé)任是什么？撫養(yǎng)、繼承權(quán)的問題如何通過法律的形式確定？

這些問題不解決，對(duì)嬰兒的成長(zhǎng)、家庭、社會(huì)都是極為不利的。目前自愿供精的人比較少，精源緊張，而且不易控制。若干年后，很可能出現(xiàn)同父異母的孩子相戀、通婚，釀成惡果。（2）代孕母親涉及的倫理問題。代孕母親分娩嬰兒的，能從其中得到報(bào)酬，因此這完全是一種商業(yè)行為，可能使某些人出于經(jīng)濟(jì)目的，使自己的子宮成為制造嬰兒、換取金錢的工具。同時(shí)，這樣就形成了遺傳學(xué)父母，生物學(xué)父母，社會(huì)學(xué)父母之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，容易出現(xiàn)法律上的糾紛。冷凍技術(shù)涉及的倫理學(xué)問題。冷凍胚胎的命運(yùn)由誰來決定？冷凍胚胎在法律上是否作為一個(gè)人？胚胎冷凍后延遲種植時(shí)間過長(zhǎng)，是否會(huì)引起輩分的改變等。生不了就生個(gè)試管嬰兒，這種觀念目前在年輕人中頗有市場(chǎng)，有的年輕人甚至因此“有恃無恐”。可事實(shí)上，由于各種原因，不是所有的不孕不育夫婦都可以通過輔助生殖技術(shù)獲得孩子的。

試管嬰兒技術(shù)的妊娠成功率雖已提高，但基本仍在35%左右。而且，做一次試管嬰兒手術(shù)需要幾萬元費(fèi)用。因此，對(duì)一般家庭也是一筆不小的負(fù)擔(dān)。

還有，要做“試管嬰兒”有一定風(fēng)險(xiǎn)。比如，用比較大量的促排卵的藥物，有些人會(huì)引起惡心、嘔吐、腹部不適、體重增加、少尿、腎衰等卵巢過度刺激綜合征。而且，取卵、移植手術(shù)也有可能引起并發(fā)癥?？寺〖夹g(shù)克隆(clone)：就是一種人工誘導(dǎo)的無性繁殖方式,被稱為“生物放大技術(shù)”。細(xì)胞核移植得到的個(gè)體都叫做克隆。通常所說的動(dòng)物克隆指體細(xì)胞克隆，即動(dòng)物的無性繁殖。1、克隆與無性繁殖不同無性繁殖是指不經(jīng)過雌雄兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合、只由一個(gè)生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經(jīng)過壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個(gè)體也叫無性繁殖。

綿羊、猴子和牛等動(dòng)物沒有人工操作是不能進(jìn)行無性繁殖的?？茖W(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆技術(shù)。

2、克隆發(fā)展三個(gè)時(shí)期：微生物克隆，即用一個(gè)細(xì)菌很快復(fù)制出成千上萬個(gè)和它一模一樣的細(xì)菌，而變成一個(gè)細(xì)菌群生物技術(shù)克隆，比如用遺傳基因――DNA克??；動(dòng)物克隆，即由一個(gè)細(xì)胞克隆成一個(gè)動(dòng)物。3、克隆技術(shù)的基本過程:

將細(xì)胞核移植到去除了細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，用人工的方法將其培養(yǎng)成胚胎，再將胚胎植入雌性動(dòng)物體內(nèi)，就可孕育出新的個(gè)體。4、克隆羊“多莉”的意義

（1）理論上證明：同植物細(xì)胞一樣，分化了的動(dòng)物細(xì)胞核也具有全能性，在分化過程中細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)沒有不可逆變化；

（2）在實(shí)踐上證明了：利用體細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物克隆的技術(shù)是可行的，從而為大規(guī)模復(fù)制動(dòng)物優(yōu)良品種和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及稀有物種的繁殖提供了有效方法。（1）培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；（2）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；（3）生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法；（4）復(fù)制瀕危的動(dòng)物物種，保存和傳播動(dòng)物物種資源。5、克隆技術(shù)的應(yīng)用前景在理論上，分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過程）的機(jī)理還不清楚6、克隆技術(shù)存在的問題在實(shí)踐中，克隆動(dòng)物的成功率還很低。維爾穆特研究組在培育“多莉“的實(shí)驗(yàn)中，融合了277枚移植核的卵細(xì)胞，僅獲得了“多莉”這一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同時(shí)進(jìn)行的胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的克隆實(shí)驗(yàn)的成功率也分別只有1.7％和1.1％。1998年4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動(dòng)物也能生育。日蘇格蘭向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實(shí)施了安樂死。由于早衰問題，人們懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊”。生出的部分個(gè)體表現(xiàn)出生理或免疫缺限（早衰跡象）

如果克隆人真能存活下來，那么世界上基因多樣性和生物多樣性的原則就會(huì)被破壞。這正是生物學(xué)界反對(duì)克隆人的主要意見，因?yàn)榭寺〕鰜淼幕蛲耆窍嗤牡任换?，缺乏多樣性，無異于近親繁殖，疾病的發(fā)生率會(huì)大大提高。