阿維菌素的液相色譜分析

阿維菌素的液相色譜分析

1a1.阿維菌素介紹阿維菌素的產(chǎn)生菌———阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)是1975年日本北里研究所從日本靜崗縣的一個(gè)土壤樣品中別離得到的.阿維鏈霉菌自發(fā)現(xiàn)以來(lái),以日本北里大學(xué)和北里研究所以及美國(guó)Merk公司為主的研究小組分別對(duì)它開(kāi)展了深入研究,形成了一個(gè)重要的抗生素研究領(lǐng)域.與其他鏈霉菌一樣,阿維鏈霉菌不僅具有復(fù)雜的形態(tài)分化,也具有合成多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力,由它產(chǎn)生的阿維菌素在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)上有著重要的商業(yè)價(jià)值.目前對(duì)阿維鏈霉菌的研究主要集中在阿維菌素的生物合成領(lǐng)域.2a2.阿維菌素結(jié)構(gòu)阿維菌素的天然發(fā)酵產(chǎn)物共有8個(gè)組分A1a,A21,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a和B2b,它們的區(qū)別主要在于C25,C222,23和C226位所連接的基團(tuán)不同。3a3儀器和試劑

高效液相色譜儀:具有紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;(島津公司LC-10A色譜數(shù)據(jù)處理機(jī);(CLASS-10A工作站。)色譜柱:150mm×3.9mm(id)不銹鋼柱,內(nèi)裝Nova-PakC18、5μm填充物;(Waters)過(guò)濾器:濾膜孔徑約0.45μm;微量進(jìn)樣器:50μL;定量進(jìn)樣管:5μL;超聲波清洗器;甲醇:色譜級(jí);水:新蒸二次蒸餾水;乙腈:色譜級(jí);阿維菌素標(biāo)樣:阿維菌素(B1a+B1b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%。4a4.色譜操作條件

流動(dòng)相:甲醇+乙腈+水=38+38+24,膜過(guò)濾,并進(jìn)行脫氣;流量:1.0mL/min;柱溫:室溫(溫差變化應(yīng)不大于2℃);檢測(cè)波長(zhǎng):245nm;進(jìn)樣體積:5μL;保存時(shí)間:B1a15.6min,B1b11.3min。5a典型阿維菌素乳油高效液相色譜圖見(jiàn)圖6a5.溶液的配制

標(biāo)樣溶液的制備稱取阿維菌素標(biāo)樣0.05g(精確至0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。試樣溶液的制備稱取含阿維菌素0.05g的試樣(精確0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。7a6.測(cè)定

在上述操作條件下,待儀器穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液,直至相鄰兩針阿維菌素峰面積相對(duì)變化小于1.5%后,按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。8a7.計(jì)算

試樣中阿維菌素(B1a+B1b)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按式(1)計(jì)算式中:A1———兩針標(biāo)樣溶液,阿維菌素B1a與B1b峰面積和的平均值;A2———兩針試樣溶液,阿維菌素B1a與B1b峰面積和的平均值;m1———標(biāo)樣的質(zhì)量,g;m2———試樣的質(zhì)量,g;p———標(biāo)樣中阿維菌素(B1a+B1b)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。9a8.結(jié)果和討論

線性關(guān)系試驗(yàn)在一定質(zhì)量范圍內(nèi),按照濃度遞增的順序配制數(shù)個(gè)樣,按上述操作條件進(jìn)行分析。以阿維菌素標(biāo)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)。計(jì)算得回歸方程為Y=2.52×108X+4.69×103,線性相關(guān)系數(shù)。試驗(yàn)證明當(dāng)阿維菌素濃度在0.004g/100mL~0.2g/100mL之間(進(jìn)樣體積5μL)與其相應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。10a方法精密度試驗(yàn)對(duì)阿維菌素原藥、乳油按上述操作條件進(jìn)行屢次重復(fù)測(cè)定,試驗(yàn)說(shuō)明該定量方法具有較好的精密度。其標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為、0.0089,變異系數(shù)分別為0.34%、1.1%。方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)稱取數(shù)個(gè)含量的阿維菌素原藥、阿維菌素乳油試樣,分別參加一定量的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品,按本方法測(cè)定其中阿維菌素總質(zhì)量并計(jì)算回收率。阿維菌素原藥、乳油的平均回收率分別為99.9%、100.4%,說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。11a最正確操作條件的選擇檢測(cè)波長(zhǎng)確實(shí)定由阿維菌素的紫外光譜圖可以看出,阿維菌素B1a和B1b的最大吸收波長(zhǎng)均在245nm附近,由于流動(dòng)相在該波長(zhǎng)處無(wú)吸收且對(duì)B1a和B1b峰位置無(wú)干擾,故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為245nm。12a流動(dòng)相的選擇我們首先用單純的甲醇+水作流動(dòng)相,結(jié)果局部廠家的乳油產(chǎn)品中B1a和雜質(zhì)峰別離不開(kāi)。因此又改用乙腈+水作為流動(dòng)相,但B1a和B1b不能與雜質(zhì)完全別離。最后嘗試用乙腈+甲醇+水作流動(dòng)相,改變乙腈和甲醇之間的比例,發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈與甲醇比例小于1時(shí),B1a和雜質(zhì)不能完全別離。當(dāng)乙腈與甲醇比例大于1時(shí),B1b和雜質(zhì)不能完全別離,當(dāng)乙腈和甲醇比例在1附近時(shí)B1a和B1b均能與雜質(zhì)完全別離,因此