PCR常見問題分析及對(duì)策

PCR常見問題分析及對(duì)策（無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性）問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無原因：模板:含有抑制物，含量低Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時(shí)間M樣品樣品正對(duì)照問題2：非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶原因：引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)問題3:拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。原因：模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+度偏高循環(huán)次數(shù)過多對(duì)策：純化模板更換Buffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)問題4：假陽性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交*污染對(duì)策：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。炫口

精口口假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93°C變性，65C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)?？寺CR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8:1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul2X連接液,50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？A） 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B） 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA，用SOC稀釋到1000u后含10ngDNA，用1/10鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。C） 如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生＞20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801,M1804,M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酶替換。D） 用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生〉20-40藍(lán)斑，沒有菌落或少有菌落，連接有問題。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？A） 連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。B） 插入片段帶有污染，使3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3'-T缺失。C） 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D） 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核普酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。E） 高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞PCR疑難解答當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行：將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70C"熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。對(duì)于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA,則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。檢查模板和引物的用量。增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。泳道中出現(xiàn)模糊條帶：減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68°C。重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長的引物。其他值得注意的條件：建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92C時(shí)不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2:350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2:500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的?；蚪MDNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長度一般為24~34個(gè)核普酸，溶點(diǎn)在60~68C間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。變性：第一步變性在94C下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94C下進(jìn)行20--3。秒），除非模板中富含GC,則95C下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。延伸：68--72C下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A,因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。測序時(shí)因酶的混合物帶有3'^5'外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。引物設(shè)計(jì)：一般長度20-30bp;至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。也可下列圖示提示找到解決問題的突破口：

PCR實(shí)驗(yàn)操作程序1.在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣:反應(yīng)物加樣順序體積叫）終濃度去離子水129.410XBufferB251X4XdNTP混合物35各200pmol/LMgCl/31.5mmol/L有義引物52.60.25pmol/L反義引物62.60.25pmol/L模板720.1瞄TaqDNA聚合酶80.41unit用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50〃礦物油。每加一管換一次Tip。振蕩每只管，然后短暫離心。將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：預(yù)變性94°C4分鐘1次變性94°C1分鐘退火37-65C1分鐘延伸72C1分鐘循環(huán)30次終延伸72C7分鐘1次保存4C將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80V,15-20分鐘。紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。1.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。③模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2,離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：炫口精品①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法93°C變性，65°C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2,濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR常見問題的精辟總結(jié)--耶魯大學(xué)TroubleshootingforPCRandmultiplexPCRTroubleshootingdiscussionisbasedonthePCRprotocolasdescribedinthetablebelow.Allreactionsarerunfor30cycles.COMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclavedultra-filteredwater(pH7.0)20.7rL-2.10xPCRBuffer*2.5rL1x3.dNTPsmix(25mMeachnucleotide)0.2rL200p.M(eachnucleotide)4.primermix(25pmoles/^Leachprimer)0.4rL0.4[xM(eachprimer)5.TaqDNApolymerase(nativeenzyme)0.2rL1Unit/25[xL6.genomicDNAtemplate(100ng/^L)1.0rL100ng/25[xL*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mMMgCl2(thefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmixare:50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2).SOLUTIONSQUESTIONSSOLUTIONS1.Iget(many)longerunspecificproducts.DecreaseannealingtimeWhatcanIdo? IncreaseannealingtemperatureDecreaseextensiontimeDecreaseextensiontemperatureto62-68°CIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.TakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove2.Iget(many)shorterunspecificproducts.WhatIncreaseannealingtemperaturecanIdo?IncreaseannealingtimeIncreaseextensiontimeIncreaseextensiontemperatureto74-78°CDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstantTakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove3.Reactionwasworkingbefore,butnowIcan'tMakesureallPCRingredientsaretakeninthereaction(buffer,template,getanyproduct.Taq,etc)ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing,especiallyinmultiplexPCR)Ifyoujustboughtnewprimers,checkfortheirreliability(badprimersynthesis?)IncreaseprimeramountIncreasetemplateamountDecreaseannealingtemperatureby6-10°Candcheckifyougetanyproduct.Ifyoudon't,checkallyourPCRingredients.Ifyoudogetproducts(includingunspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.Combinesome/alloftheabove4.MyPCRproductisweak.IsthereawaytoGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.increasetheyield?IncreasetheamountofPCRprimerIncreasetheamountofDNAtemplateIncreasetheamountofTaqpolymeraseChangebuffer(KCl)concentration(higherifproductislowerthan1000bporlowerifproductishigherthan1000bp)Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8[xg/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerol.Checkprimersequencesformismatchesand/orincreasetheprimerlengthby5nucleotidesCombinesome/alloftheabove5.MytwoprimershaveverydifferentmeltingAneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowTm.If精品locus.WhatcanIdotoimprovePCRamplification?locus.WhatcanIdotoimprovePCRamplification?temperatures(Tm)butIcannotchangetheiryouneedtokeepthesizeoftheproductconstant,addafewbasesatthe3'end.Ifsizeisnotaconcern,addafewbasesateitherthe3'orthe5'endofthatprimer.6.IhaveanumberofprimerpairsIVerylikely,yes.wouldliketousetogether.CanIrunaTryamplifyalllociseapratelyusingthesamePCRprogram.IfoneoftheprimermultiplexPCRwiththem?.How?pairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingconditionsconstantandchangeotherparametersasmentionedabove(#1and#2).Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthesamecyclingconditionsorbydecreasingonlytheannealingtemperatureby4°C.Ifsomeofthelociareweakornotamplified,readbelow!!7.HowmanylocicanIamplifyinDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14loci.multiplexPCRatthesametime?Literaturedescribesupto25lociorso.8.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingtheamountofprimerforthe"weak"lociatthereactionareveryweakorinvisible.sametimewithdecreasingtheamountofprimerforalllocithatcanbeamplified.Howcanamplifythem?Thebalancebetweentheseamountsismoreimportantthantheabsolutevaluesused!!.Checkprimersequencesforprimer-primerinteractions9.ShortPCRproductsinmyIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationatmultiplexreactionareweak.Howcan1.5-2mMIimprovetheiryield?DecreasedenaturingtimeDecreaseannealingtimeandtemperatureDecreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"loci.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8[xg/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove10.LongerPCRproductsinmyDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationatmultiplexreactionareweak.Howcan1.5-2mMIimprovetheiryield?IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.IncreasedenaturingtimeIncreaseannealingtimeDecreaseannealingtemperatureIncreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"lociAddadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8Xg/xLfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove11.AllproductsinmyDecreaseannealingtimeinsmallsteps(2°C)multiplexreactionareweak.Decreaseextensiontemperatureto62-68°CHowcanIimprovetheyield?IncreaseextensiontimeIncreasetemplateconcentrationIncreaseoverallprimerconcentrationAdjust