大腸桿菌基因工程

大腸桿菌基因工程201220131271

韓武生物技術(shù)一班大腸桿菌的基因工程一大腸桿菌表達的優(yōu)缺點二大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略三大腸桿菌工程菌構(gòu)建，分析，篩選四大腸桿菌生產(chǎn)實用重組蛋白基因工程步驟010203060504菌種貯存與保護目的基因的表達與篩選受體細胞的增值目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因獲取目的基因的獲取

方法1從基因組文庫獲取2pcr技術(shù)擴增目的基因3通過dna合成儀用化學(xué)方法合成表達載體的構(gòu)建外源基因在大腸桿菌中高效表達原理啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)將目的基因?qū)胧荏w細胞對于大腸桿菌微生物來講可以用ca+2處理大腸桿菌，再將目的基因的載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。啟動子最佳距離的探測

EEAEE啟動子A酶切開Bal31酶解目的基因啟動子

啟動子的篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動子探針pko上。受體細胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報告基因galk的表達產(chǎn)物聯(lián)作用?？蓪⑴囵B(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動子活性的重組克隆1啟動子啟動子構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac啟動子構(gòu)建終止子終止子選擇與使用目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選核糖體結(jié)合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）

核糖體結(jié)合位點大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列

密碼子不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能細胞內(nèi)tRNA的含量按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法質(zhì)粒拷貝數(shù)將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，在大腸桿菌生長達到對數(shù)期時，質(zhì)粒會大量拷貝增殖，進而對大腸桿菌生長以及目的基因表達產(chǎn)生阻礙。故應(yīng)將重組質(zhì)?？刂圃诳煽胤秶鷥?nèi)。大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建大腸桿菌工程菌構(gòu)建這些構(gòu)建大腸桿菌工程菌的方法，都是利用大腸桿菌本身特性，來達到目的基因高效、穩(wěn)定、快速表達。目的基因?qū)胧荏w細胞

對于微生物大腸桿菌，可以用ca+2處理，使其達到感受態(tài)，感受態(tài)細胞可以吸收周圍DNA,進而可將含有目的基因的載體吸附。目的基因的檢測與測定這樣得到的大腸桿菌會有四種一沒有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌二轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，但質(zhì)粒上沒有外來基因（轉(zhuǎn)化子）三轉(zhuǎn)入進質(zhì)粒，質(zhì)粒上有基因但沒有目的基因（重組子）四轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，質(zhì)粒上有目的基因(目的重組子）表達與篩選對于標定的目的基因的大腸桿菌進行培養(yǎng)擴增，誘導(dǎo)表達，進而采用多種方法鑒定篩選一營養(yǎng)缺陷型篩選二抗藥性篩選三顯色篩選

對于微生物常用藍白斑法鑒定大腸桿菌

挑選出轉(zhuǎn)入目的基因的大腸桿菌進行培養(yǎng)，送到相應(yīng)部門進行DNA擴增，獲取更多基因。也可以對大腸桿菌進行低溫保存處理。大腸桿菌基因工程實例胰島素的合成早期人類從動物體內(nèi)直接提取，生產(chǎn)效率低?；瘜W(xué)合成用化學(xué)方法合成，成本高基因工程以大腸桿菌為受體生產(chǎn)胰島素重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈同時表達法tacb-GaloriAprMetMetMMNCBpeptideApeptide化學(xué)合成AB鏈編碼序列重組人胰島素轉(zhuǎn)化分離純化CNBr處理特異性裂解體外折疊重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建生產(chǎn)技術(shù)的評價：由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達100美元以上。為了進一步降低生產(chǎn)成本，美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。A鏈B鏈同時表達法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建（人胰島素原表達法）基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：tacb-GalCpeptideoriAprMetMetMMNCBpeptideApeptide人胰島素原的cDNA重組人胰島素原轉(zhuǎn)化分離純化重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建人胰島素原表達法生產(chǎn)技術(shù)的評價：在人胰島素原表達工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率也相應(yīng)提高，折疊率高達80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達法更為簡捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目