第十一章-熒光分析法

第十一章熒光分析法

Fluoreometry熒光1/15/20238:20:11PM/bbs熒光的產(chǎn)生發(fā)射與激發(fā)光譜熒光儀器定量關(guān)系熒光效率概述用熒光來(lái)進(jìn)行定性定量的分析方法——熒光分析法。

無(wú)輻射躍遷放出熱能或動(dòng)能物質(zhì)基態(tài)光照射激發(fā)態(tài)光致發(fā)光發(fā)射熒光和磷光物質(zhì)基態(tài)吸收特定光可見(jiàn)-紫外光源分子熒光分析

由熒光波長(zhǎng)可確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)

由熒光強(qiáng)度可測(cè)物質(zhì)的含量

§1熒光分析法基本原理

一、分子熒光（一）、分子熒光的產(chǎn)生分子在輻射能的照射下，電子躍遷至單重激發(fā)態(tài)，并以無(wú)輻射弛豫方式回到第一單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，由此再躍回基態(tài)或基態(tài)中其它振動(dòng)能級(jí)時(shí)所發(fā)出的光。

基態(tài)和激發(fā)態(tài)單重態(tài)和三重態(tài)輻射躍遷（光）和無(wú)輻射躍遷（熱）概念單重態(tài)：singletstate三重態(tài)：tripletstate電子能級(jí)的多重性M:M=2S+1；S為總自旋量子數(shù)續(xù)前ABC單重態(tài)和三重態(tài)電子分布能量ππππ*π*π*A：基態(tài)單重態(tài)B：激發(fā)單重態(tài)C：激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)T激發(fā)單重態(tài)S*基態(tài)單重態(tài)S0激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：

1.能量高2.激發(fā)單重態(tài)平均壽命短，tS=10-8s,3.基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷1.能量低2.激發(fā)三重態(tài)平均壽命長(zhǎng)，tS=10-4--1s,3.基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷激發(fā)單重態(tài)S激發(fā)三重態(tài)T去活化過(guò)程輻射躍遷無(wú)輻射躍遷振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換體系間跨越猝滅熒光磷光回基態(tài)途經(jīng)熒光形成機(jī)制單重態(tài)第二激發(fā)態(tài)第一激發(fā)態(tài)三重態(tài)熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換體系跨越振動(dòng)弛豫基態(tài)振動(dòng)弛豫熒光磷光處于第一電子激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子發(fā)射光量子回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程為熒光發(fā)射處于第一電子激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子發(fā)射光量子回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程為磷光發(fā)射。不同點(diǎn)起源不同波長(zhǎng)不同壽命不同吸收峰磷光峰熒光峰(二)、熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)光譜(excitationspectrum)：F~ex

熒光光譜(fluorescencespectrum)：F~em光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器熒光光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)，改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)熒光強(qiáng)度和激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系。固定激發(fā)波長(zhǎng)，（為最大激發(fā)波長(zhǎng)），測(cè)不同波長(zhǎng)時(shí)的熒光強(qiáng)度。熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜熒光光譜特征Stokes位移：熒光波長(zhǎng)一般比激發(fā)波長(zhǎng)要長(zhǎng)(前者能量較低)熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；熒光光譜與激發(fā)光譜形狀相似，呈鏡像對(duì)稱(chēng)。蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜S0S1*ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1蒽的能級(jí)躍遷圖鏡像關(guān)系的原因基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似返回

熒光產(chǎn)生的必要條件有吸收結(jié)構(gòu)有高的熒光效率二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）、熒光效率（fluorescenceefficiency）

分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性取代基類(lèi)型共軛高熒光效率高剛性平面使熒光效率高1、給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸電子基團(tuán)使熒光減弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基團(tuán)對(duì)熒光影響不明顯。共軛效應(yīng)產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.62熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。剛性平面結(jié)構(gòu)芴聯(lián)苯F=1F=0.2熒光黃不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯1）給電子取代基加強(qiáng)熒光.取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm）278~310285~365310~405280~390285~345相對(duì)熒光強(qiáng)度10182020202）吸電子取代基減弱熒光—C=O，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光.金屬螯合物的熒光1.螯合物中配位體的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強(qiáng)熒光2,2`-二羥基偶氮苯無(wú)熒光2,2`-二羥基偶氮苯-Al螯合物強(qiáng)熒光三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

A、溫度影響溫度上升，熒光減弱

B、溶劑的影響增大溶劑的極性使熒光增強(qiáng)含重原子的溶劑（e.g.CBr4）使熒光減弱溶劑粘度降低熒光強(qiáng)度減弱

C、酸度的影響

D、熒光熄滅劑激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用，使能量轉(zhuǎn)移，熒光強(qiáng)度減弱甚至消失。.E、散射光.散射光干擾及消除散射光：當(dāng)一束平行光投射在液體試樣上，大部分被吸收或透過(guò)，小部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向改變，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：無(wú)能量的交換，λ散射≈λ激發(fā)拉曼光：有能量轉(zhuǎn)移，λ散射><λ激發(fā)硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與散射光譜(b)熒光光譜散射光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm干擾的消除1）改變激發(fā)光的波長(zhǎng)；2）更換溶劑；CCL4的拉曼光與激發(fā)光波長(zhǎng)相近，其拉曼光幾乎不干擾熒光測(cè)定?！?熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系

I0I

F①

在ECl≤0.05時(shí)，F(xiàn)=KC,溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系；②在ECl＞0.05，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度不呈線性關(guān)系；③熒光分析法的測(cè)定靈敏度高。三.分子熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系1.熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：熒光強(qiáng)度（IF）與相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)成正比：按照級(jí)數(shù)展開(kāi)式：對(duì)于稀溶液，當(dāng)bc<0.05時(shí)：IF----熒光強(qiáng)度F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關(guān)的參數(shù)I0--入射光強(qiáng)度。l--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度通常A<0.05If與A

的關(guān)系A(chǔ)與c正比，低濃度泰勒級(jí)數(shù)展開(kāi)，僅取一項(xiàng)，x越小越符合定量關(guān)系熒光分析法的應(yīng)用一.工作曲線法熒光分析的靈敏度比紫外－可見(jiàn)分光光度法高103～104.直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法FCsFxCx二.熒光分析法的靈敏度比例法分光法與熒光法定量比較

UV-VIS分光法

熒光法定量基礎(chǔ)A=lgI0/IFC靈敏度 與有關(guān)與有關(guān)檢測(cè)限 10-6-10-9 10-9-10-12

靈敏度高選擇性好垂直方向§3

熒光光度計(jì)

光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器

與分光光度計(jì)的主要差別①

垂直測(cè)量方式,消除透射光影響②兩個(gè)單色器，激發(fā)和發(fā)射，常用光柵熒光儀特點(diǎn)一.光源1.光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強(qiáng)度隨波長(zhǎng)的變化小有足夠長(zhǎng)的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類(lèi)型：

氙燈光源高壓汞光源波長(zhǎng)范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動(dòng)電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：發(fā)射波長(zhǎng)范圍寬發(fā)射光強(qiáng)度大二.單色器：兩個(gè)三.檢測(cè)器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109四.樣品池1.形狀：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光波長(zhǎng)范圍2.使用注意事項(xiàng)容易破碎問(wèn)題：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？沾污問(wèn)題2.發(fā)射單色器：置于樣品池后和檢測(cè)器之間1.激發(fā)單色器：置于光源和樣品池之間，其作用是提供所需要的單色光，以激發(fā)被測(cè)物質(zhì)。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

測(cè)量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p§4分子熒光分析法的在藥學(xué)中的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)陽(yáng)離子發(fā)生熒光的很少，但很多能與一些有機(jī)試劑形成熒光絡(luò)合物而被測(cè)定；2.一些陰離子能使熒光減弱，可利用熒光猝滅法測(cè)定；3.脂肪族有機(jī)物分子能發(fā)生熒光的也不多，可與某些有機(jī)試劑反應(yīng)后生成會(huì)發(fā)射熒光的衍生物加以測(cè)定；4.芳香族化合物因有共軛結(jié)構(gòu)，多數(shù)能發(fā)射熒光；5.弱熒光的芳香族化合物也可與熒光試劑作用生成強(qiáng)熒光衍生物以提高測(cè)量靈敏度。故藥物中的胺類(lèi)、抗菌素、維生素、甾體類(lèi)均可用熒光法測(cè)定。該法在體內(nèi)藥物定量分析中應(yīng)用甚廣。芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測(cè)定的主要類(lèi)型。1.熒光和磷光在產(chǎn)生機(jī)制上有什么不同？2.何謂熒光量子效率？哪些結(jié)構(gòu)物質(zhì)有較高熒光效率？3.以下物質(zhì)中可能有最強(qiáng)熒光的物質(zhì)是（）。思考題4.熒光光譜分析中的最主要光譜干擾是().A.激發(fā)光;B.磷光;C.拉曼光;D.容器表面產(chǎn)生的散射光5．測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí),要在與入射光成直角的方向測(cè)量,這是因?yàn)?).A.只有在與入射光成直角的方向上才有熒光;B.在成直角方向測(cè)量可以避免散射光的影響;C.在成直角方向測(cè)量可免除透射光的影響;D.熒光的強(qiáng)度比入射光強(qiáng)6.（）熒光光譜形狀與激發(fā)光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。7.熒光光譜的特征？1.所謂熒光，即指某些物質(zhì)經(jīng)入射光照射后，吸收了入射光的能量，從而輻射出比入射光()。

A.波長(zhǎng)長(zhǎng)的光線B.波長(zhǎng)短的光線

C.能量大的光線D.頻率高的光線2.下列說(shuō)法正確的是()A熒光發(fā)射波長(zhǎng)永遠(yuǎn)大于激發(fā)波長(zhǎng)

B熒光發(fā)射波長(zhǎng)永遠(yuǎn)小于激發(fā)波長(zhǎng)

C熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

D熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)3．熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系的條件是()