DNA提取方法和步驟

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA提取方法和步驟實(shí)驗(yàn)原理植物DNA的分離是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和育種學(xué)等植物科學(xué)研究的基礎(chǔ)要求。對(duì)DNA提取一般有三個(gè)要求：1.DNA的純度可以滿足下游操作的要求2.DNA必須完整3.DNA應(yīng)當(dāng)有足夠的量構(gòu)建基因組文庫(kù)，初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。RFLP和PCR分析，DNA長(zhǎng)度可短至50kb，在該長(zhǎng)度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。如果對(duì)植物進(jìn)行大規(guī)模篩選，操作程序應(yīng)當(dāng)快捷，簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，并盡可能避免使用有毒試劑。第1頁(yè)/共13頁(yè)核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。

DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來(lái)，再把蛋白質(zhì)和糖去除，同時(shí)除去RNA及無(wú)機(jī)離子等，從中分離DNA。

第2頁(yè)/共13頁(yè)核酸的提取方法提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，對(duì)它們進(jìn)行稍加修改就可以應(yīng)用于DNA的微量提取。兩種方法均采用去污劑裂解細(xì)胞并保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸內(nèi)切酶降解。具體方法簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)就是利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。第3頁(yè)/共13頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：新鮮植物組織。100mmol/LTris-HCl(pH8.0)50mmol/LEDTA500mmol/LNaCl1.5%SDSDNA提取緩沖液實(shí)驗(yàn)所需試劑：24:1/氯仿:戊醇其它試劑：液氮、TE緩沖液，無(wú)水乙醇、70%乙醇。2×CTABbuffer100mMTrispH8.01.4MNaCl20mMEDTApH8.02%CTAB0.2%巰基乙醇酚/氯仿（1:1）

氯仿：50ml無(wú)水乙醇第4頁(yè)/共13頁(yè)實(shí)驗(yàn)儀器第5頁(yè)/共13頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟：取新鮮葉片約3g,剪碎,加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移至2ml離心管中；2.在65℃預(yù)熱的提取液中按3.8g/L加入NaBisufite,混勻并調(diào)pH至8.0；3.在管中加入適量提取液，60℃水浴保溫約30min，不時(shí)顛倒混勻；

4.冷卻至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇，用力搖勻后，放置搖床上搖動(dòng)15min左右；5.室溫下10000rpm離心15min，小心吸上清于新的離心管中，加入兩倍體積的冷酒精，-20℃放置1h或過(guò)夜；6.挑出DNA置于新的管中，挑出有困難時(shí)可以低速離心后倒去上清。加入適量70%酒精，搖動(dòng)洗滌10min，重復(fù)洗滌2-3次；

7.吹干DNA，加入適量TE在65℃溶解，完全溶解后離心去除雜質(zhì)；

加入RNase（10mg/mL）,室溫處理0.5-1h,

除去RNA，4℃或-20℃貯存。

如需純化DNA，再加入適量TE，氯仿/異戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/LNaAc和兩倍體積的乙醇，-20℃放置1h或過(guò)夜；吹干沉淀后，加入適量TE，65℃溶解，4℃或-20℃貯存。

第6頁(yè)/共13頁(yè)1.植物葉子約3g,剪碎置預(yù)冷研缽中

加入液氮充分研磨，注意不能干磨混合球磨儀第7頁(yè)/共13頁(yè)3.60℃水浴保溫30-60min第8頁(yè)/共13頁(yè)加入等體積氯仿，用力搖勻第9頁(yè)/共13頁(yè)6.再次10000rpm離心5min；

將上清小心吸入新的離心管中；

第10頁(yè)/共13頁(yè)DNA樣品在1%Agarose膠上電泳（例圖）

第11頁(yè)/共13頁(yè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)微量移液槍的使用一定要規(guī)范，吸取氯仿等有機(jī)試劑要注意