DNA連接與轉(zhuǎn)化原理

會計學1DNA連接與轉(zhuǎn)化原理1、ＤＮＡ分子的體外連接

ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下，由ＤＮＡ連接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程，ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎(chǔ)上進行的。第1頁/共23頁連接反應中值得注意的幾個問題：1.ＤＮＡ連接酶常用的ＤＮＡ連接酶有兩種：

(1)來自大腸桿菌的ＤＮＡ連接酶(2)來自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ連接酶。二者的作用機理類似。第2頁/共23頁Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機制Ｔ４連接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ連接酶與輔助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ復合物。２．酶－ＡＭＰ復合物結(jié)合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.第3頁/共23頁2.連接反應的溫度ＤＮＡ連接酶的最適反應溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過夜。第4頁/共23頁3.DNA的平未端和粘性末端由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的，第5頁/共23頁4.堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反應后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復。見下圖。第6頁/共23頁5.連接反應的檢測連接反應成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽性克隆的篩選來確定。我們下面的實驗從粘性末端為例操作。第7頁/共23頁二、實驗試劑１．純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。２．１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫芐糖醇500μl/mlBSA３．Ｔ４ＤＮＡ連接酶４．5mMATP第8頁/共23頁三．實驗方法

ＤＮＡ分子的體外連接１．在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：a.0.1μg質(zhì)粒載體，２倍分子的外源ＤＮＡ。b.加無菌水至7.5μl，于４５℃加溫５分鐘使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。c.加入：１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer1μlＴ４ＤＮＡ連接酶0.1Weiss5mMATP1μl２．蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心５秒。３．１２℃下過夜連接反應。４．反應結(jié)束后于－２０℃保存。第9頁/共23頁四．結(jié)果與分析

電泳檢查連接結(jié)果１．如何判斷連接效果的成功性？第10頁/共23頁問題與討論：１．簡述Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機理。２．簡述一個完整外源ＤＮＡ的克隆過程。３．連接反應中應注意些什么問題及如何提高連接效率。第11頁/共23頁2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選

一．實驗目的及背景體外通過基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù)，可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴增，繁殖，保存以及表達目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。第12頁/共23頁本實驗由二個方面組成:1.質(zhì)粒ＤＮＡ轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實驗的成敗直接相關(guān)，通常轉(zhuǎn)化效率可達１０５－１０７轉(zhuǎn)化子/μgDNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。第13頁/共23頁所謂感受態(tài)，就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多，目前主要有兩種假說：１．局部原生質(zhì)體化假說－－感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受ＤＮＡ的酶位點，使ＤＮＡ分子能進入細胞。第14頁/共23頁制備感受態(tài)細胞現(xiàn)在制備感受態(tài)細胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來ＤＮＡ分子相混合.ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細胞內(nèi)復制成雙鏈；４．表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。第15頁/共23頁2.重組子的篩選這和受體菌：質(zhì)粒ＤＮＡ的選擇相關(guān)，原則上要注意：１．受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；２．根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則而定。重組子的篩選方法常用的有兩種方法：第16頁/共23頁１．抗生素篩選法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實驗利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子。第17頁/共23頁２互補法現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭１４６個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌則含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。第18頁/共23頁二、實驗試劑

ＬＢ培養(yǎng)基質(zhì)粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受體菌CaCl20.1MAmp第19頁/共23頁三．實驗方法一、感受態(tài)細胞制備１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，３７℃培養(yǎng)１６～２０小時。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入２０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基錐瓶中，３７℃振蕩過夜。３．從中取２ｍｌ菌液轉(zhuǎn)入５０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基中３７℃振蕩培養(yǎng)４－５小時，測ＯＤ１００達０．４～０．５。４．培養(yǎng)物于冰上１０分鐘。５．轉(zhuǎn)入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。６．棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上１０分鐘。７．4,000rpm4℃離心１０分鐘，棄上清。８．加入2ml，0.1MCaCl2懸浮細胞，于４℃過夜。第20頁/共23頁二、轉(zhuǎn)化

１．在1.5mlEppendorf管中加入２００μl感受態(tài)細胞和１０μl40ngDNA溶液，溫和混勻，于冰上３０分鐘。２．于４２℃水浴９０秒。３．冰浴２分鐘。４．加入８００μlＬＢ液體培養(yǎng)基３７℃４５分鐘。５．?。玻埃?/p>